皮层组织和动态可视化的微生物，利用全内反射荧光显微镜

Summary

全内反射荧光显微镜（TIRF）是一个功能强大的方法来观察结构在细胞表面的高对比度和时间分辨率。我们展示的TIRF如何可受聘在皮层细胞壁封闭的细菌和真菌细胞的蛋白质动力学研究。

Abstract

TIRF显微镜已成为一个强大的成像技术，研究时空动态的荧光分子在体外和活细胞^1。全内反射光的现象时有发生，当光线从高折射率介质传递到与低折射率介质在一个角度大于特征的临界角（即接近边界平行）。尽管所有的光被反射回在这种情况下，创建渐逝波传播横跨和沿边界，距离指数衰减，只有穿透样本地区是100-200纳米界面附近的^2。除了 ​​提供优越的轴向分辨率，减少了重点荧光激发创建了一个非常高的信号噪声比和减少漂白^2,3破坏性影响。作为一个广角技术的TIRF还允许更快的图像交流quisition比扫描基于共聚焦设置。

乍一看，低的TIRF穿透深度，似乎是不符合，这往往是厚厚的细胞壁所包围的细菌和真菌细胞成像。相反，我们发现，酵母和细菌细胞的细胞壁，实际上提高可用性的TIRF和增加^4-8观察到的结构范围内。许多细胞过程，因此可以直接访问的TIRF小，单细胞微生物，它往往提供了强有力的遗传操作技术。这使我们能够执行在体内的生化实验，可以直接在活细胞中进行评估蛋白质相互作用和活动的动力学。

在这里，我们描述了酵母或枯草芽孢杆菌细胞获得高品质的TIRF图像所需的各个步骤。我们指出的各种问题，可以affeCT的TIRF可视化细胞中的荧光探针和几个应用实例说明过程。最后，我们展示的TIRF图像可进一步提高使用既定的图像恢复技术。

Protocol

1。样品制备

1. 准备盖玻片
   盖玻片应清洗尘粒的TIRF从盖玻片（ 图1A，电影1）产生的背景信号是敏感。
   1. 在有盖的陶瓷人用钳子盖玻片到位。
   2. 1 M氢氧化钠（可重复使用多次）填补玻璃容器。
   3. 缓慢连续旋转（轨道摇床）下孵育2小时。过多的潜伏期（> 8小时），将创建不透明的盖玻片。
   4. 下缓慢连续旋转5分钟，用蒸馏水清洗两次。
   5. 储存在陶瓷支架覆盖100％的乙醇。
2. 枯草芽孢杆菌细胞准备
   
   1. 0.01外径₆₀₀ - 0.05稀释至5毫升的适度增长，媒体和成长指数阶段（0.3-0.7 OD _600）。
   2. 准备在1.25％琼脂糖水或中等。使用合成纤维媒体减少背景荧光。溶于1.5毫升塑料管粉在95℃，加热块存储在72°C。
   3. 琼脂糖小滴添加到幻灯片和记者到了第二张幻灯片的平垫中间。至少2分钟后，或前仔细单独的幻灯片使用。
   4. 微型离心机在降速为1分12.000转500μL细胞。
   5. 弃上清，重悬于50μL介质中的颗粒。
   6. 2-4μL的细胞到琼脂糖垫的中心。
   7. 采取用钳子从乙醇装满容器的清洗盖玻片，用加压空气干燥，小心地放在样品。
   8. 让细胞定居至少2....

Discussion

TIRF显微镜图像周边蛋白的首选技术。渐逝场的低渗透深度，最大限度地减少了光的焦点，这导致了一个非常好的信噪比，并允许数据采集，高帧频，或非常弱表达的蛋白质成像。高对比度和高帧率相结合，使TIRF显微镜的成像时空外皮本地化的蛋白质动力学的完美的工具。有趣的是，厚厚的细胞壁周围的许多微生物不妨碍周边蛋白的TIRF成像。事实上，渐逝的实际发电量很可能发生在细胞壁和细胞膜^5,10之间的接口。退出细胞，甚至可能导致沿细胞壁，这或许可以解释的表面积大，可在酵母细胞中⁸成像光的传播光的反射。

对于质量最优的TIRF IM年龄关键是有一个很好的校正镜系统。激光应集中和一致之前，每个成像会议。盖玻片应清洗（ 图1A）和细胞必须正确固定。对于双色成像光谱出血通过必须考虑或消除使用过滤器过滤套独立的发射范围。这显然​​会在较慢的采集时间，由于机械过滤器变化的价格。如果有必要，快速滤光轮或振驱动的照明光源，可以规避这种延迟。另外，关键的荧光（RFP），可用于对较弱的表达一对蛋白质，最大限度地减少信号干扰的水平。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
该工具的名称/试剂	类型	公司	目录编号
轨道摇床	工具	UniEquip	UNITWIST的3-D摇杆振动筛
的TIRF显微镜	直到		自定义安装
玻璃容器	工具	vitlab	340-232880353
陶瓷染色架	工具	托马斯科学。	8542E40
刀豆蛋白A	试剂	西格玛	L7647
的盖玻片＃1（18×18毫米）	显微镜	门泽尔格拉泽	BB018018A1
显微镜载玻片	显微镜	门泽尔Ğ激光	AA00000102E
浸油	显微镜	蔡司	immersol 518F
琼脂糖	试剂	Invitrogen公司	16500-500
FluoSpheres	试剂	Invitrogen公司	F8795