使用全内反射荧光显微镜观察微生物皮层结构与动态

摘要

全内反射荧光（TIRF）显微镜是一种强大的技术，可用于高对比度和高时间分辨率地观察靠近细胞表面的结构。我们展示了如何利用TIRF研究细胞壁包被的细菌和真菌细胞皮层中的蛋白质动态。

摘要

全内反射荧光显微镜（TIRF）已成为一种强大的成像技术，用于研究体外及活细胞中荧光分子的空间-时间动态¹。当光以大于某一特征临界角（即更接近与界面平行）的角度从折射率较高的介质进入折射率较低的介质时，会发生全内反射这一光学现象。尽管在此条件下所有光线均被反射回原介质，但仍会产生一种沿界面传播的隐逝波，该波随距离呈指数衰减，仅能穿透距界面约100–200 nm范围内的样品区域²。除了提供优异的轴向分辨率外，TIRF还能显著减少离焦荧光分子的激发，从而获得极高的信噪比，并最大限度地降低光漂白带来的损伤效应^2,3。作为一种宽场成像技术，TIRF也比大多数基于扫描的共聚焦系统具有更快的图像采集速度。

从表面上看，全内反射荧光显微镜（TIRF）较浅的穿透深度似乎难以适用于成像具有厚细胞壁的细菌和真菌细胞。然而，我们发现酵母和细菌细胞的细胞壁实际上能够提升TIRF的可用性，并扩大可观测结构的范围^4-8。因此，对于许多体积小、单细胞的微生物而言，TIRF可直接用于研究多种细胞过程，而这些微生物通常具备强大的遗传操作技术。这使得我们能够在活细胞中开展in vivo 生物化学实验，直接评估蛋白质相互作用和活性的动力学过程。

本文介绍了获取酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）细胞高质量全内反射荧光（TIRF）图像所需的各个步骤。我们指出了可能影响细胞中荧光探针TIRF成像效果的多种问题，并通过多个应用实例展示了实验流程。最后，我们演示了如何利用成熟的图像恢复技术进一步提升TIRF图像质量。

方案

1. 样品制备

1. 准备盖玻片
   应清除盖玻片上的灰尘颗粒，因为全内反射荧光显微镜（TIRF）对来自盖玻片的背景信号非常敏感（图 1A，视频 1）。
   1. 使用镊子将盖玻片放入带盖的陶瓷 holder 中。
   2. 在玻璃容器中加入 1 M NaOH（可多次重复使用）。
   3. 在缓慢连续旋转（轨道摇床）条件下孵育 2 小时。过度孵育（> 8 小时）会导致盖玻片变浑浊。
   4. 在缓慢连续旋转条件下，用蒸馏水洗涤两次，每次 5 分钟。
   5. 将盖玻片储存在盛有 100% 乙醇的陶瓷 holder 中。
2. 准备 Bacillus subtilis 细胞
   
   1. 将菌液稀释至 OD₆₀₀ 为 0.01 - 0.05，加入 5 ml 合适的培养基中，培养至对数生长期（OD₆₀₀ 为 0.3-0.7）。
   2. 配制 1.25% 琼脂糖水溶液或培养基溶液。建议使用合成培养基以减少背景荧光。在 95°C 条件下于 1.5 ml 塑料离心管中溶解粉末，并保存在 72°C 加热块中。
   3. 在载玻片中央滴加少量琼脂糖，用另一张载玻片压成平整的垫片。至少静置 2 分钟后或在使用前小心分离两片载玻片。
   4. 取 500 μl 细胞悬液，在微量离心机中以 12,000 rpm 离心 1 分钟。
   5. 弃去上清液，将沉淀重悬于 50 μl 培养基中。
   6. 取 2–4 μl 细胞悬液加至琼脂糖垫中央。
   7. 用镊子从盛有乙醇的容器中取出一块已清洁的盖玻片，用加压空气吹干，小心地覆盖在样品上。
   8. 显微观察前让细胞沉降至少 2 分钟。
   9. 如需长时间成像，可用 VALAP（凡士林、羊毛脂和石蜡，按等质量比加热混合）密封盖玻片边缘（用小刷子或刮刀涂抹）。
3. 准备 Saccharomyces cerevisiae 细胞
   
   1. 将预培养物稀释后，在合适的培养基中生长至少 5 小时至对数生长期（OD₆₀₀ 为 0.2–0.8）。
   2. 用镊子从容器中取出盖玻片，用加压空气吹干。
   3. 用移液器在盖玻片上滴加 5 μl 刀豆蛋白 A 溶液（ConA，2 μg/ml 溶于蒸馏水中），然后用加压空气吹干。ConA 可结合酵母细胞壁中的碳水化合物，从而固定酵母细胞。
   4. 将 4.5 μl 酵母细胞悬液转移至 ConA 涂覆的盖玻片一侧，小心地将盖玻片放置在显微镜载玻片上。从一侧开始，缓慢放下，以避免产生气泡。
   5. 显微观察前让细胞沉降至少 2 分钟。
   6. 如需长时间成像，可用 VALAP（见上文）密封盖玻片边缘。

2. 图像采集

1. 显微镜设置
   所有实验均在定制的全内反射荧光（TIRF）显微镜系统上进行，该系统基于完全自动化的iMIC显微镜支架（Till Photonics），配备奥林巴斯100倍、数值孔径（NA）为1.45的物镜。使用488 nm（Coherent Sapphire）和561 nm（Cobolt Jive）的75 mW半导体泵浦固体（DPSS）激光器作为光源。通过声光可调滤波器（AOTF）选择激光，并经由宽带光纤导入iMIC系统。采用由伺服电机驱动的双轴扫描头调节入射角度或荧光漂白后恢复（FRAP）的位置。额外的一个伺服电机用于在落射荧光、FRAP和TIRF模式之间切换。图像由Andor iXON DU-897 EMCCD相机采集，并在相机前加装2倍放大镜。图像采集由Live Acquisition（Till Photonics）软件包控制。
   以下几点需特别注意：
   
   1. 照明光源（激光线）和TIRF角度的可编程控制对于获得可重复的结果至关重要，尤其是在多色TIRF实验中，需要针对每种激发波长调节入射角，以确保倏逝波具有相同的穿透深度。在我们的系统中，可通过两个伺服电机即时调节TIRF角度，这两个电机由Live Acquisition软件直接控制。
   2. 我们定制的系统还通过第三个伺服电机实现落射荧光、TIRF和FRAP之间的快速切换，从而可简便地测量在TIRF中追踪对象的定位动力学。
   3. 物镜型TIRF要求高数值孔径（NA>1.4）。我们使用了奥林巴斯100倍、NA 1.45的物镜。
   4. 由于具有高信噪比，EMCCD相机非常适合TIRF成像。为了实现最佳灵敏度的成像，我们使用了512×512像素、背照式EMCCD相机，像素尺寸为16 μm。为保持最大分辨率，在相机前加装了2倍放大镜。
   5. 由于TIRF是一种宽场技术，激光束强度被分散。因此，较强功率的激光通常有助于改善成像效果。我们使用了488 nm和561 nm的75 mW半导体泵浦固体（DPSS）激光器。
   6. 为在成像过程中维持细胞的最佳生长条件，应使用适当的环境控制系统。我们使用自制的加热腔室（图1B）研究酵母温度敏感型突变体。在采集过程中进行培养基更换时，可使用简单的流动腔室或玻璃底培养皿，后者可在倒置显微镜上从上方方便地操作。
2. 参数调节
   
   1. 使用明场照明确定细胞位置。红光LED尤为合适，因其不会引起显著的光损伤。
   2. 切换至激光照明，并选择适当的激光和滤光片组合以激发目标荧光团。确保TIRF角度处于临界角以下，否则将无法检测到GFP融合蛋白产生的信号。如有疑问，可先将TIRF角度设为0°，以获得垂直入射的激光束。找到细胞的顶部区域（即靠近盖玻片的一侧）。调整激光束的入射角直至信号消失，然后缓慢增加角度，直到细胞表面荧光重新出现（视频2）。再次调节z轴焦距，使表面成像位置达到最佳。合适的TIRF角度应在细胞边缘不产生模糊的光晕（图1C）。若在设置过程中发生明显光漂白，应保存当前TIRF角度，并在开始正式采集前移动至未漂白的视野区域。
   3. 调节激光强度和相机增益，以最大化动态范围（在不使像素饱和的前提下获得高信噪比）。通常，EMCCD相机最适合检测极低信号下的高信噪比图像；而对于较强信号，常规CCD相机噪声更低且动态范围更宽。
   4. TIRF显微镜对盖玻片微小的高度差异极为敏感，导致通常只能同时对少数几个细胞进行成像（图1D）。对于较小的细胞，采集区域（感兴趣区域，ROI）通常可缩小至包含目标对象的子区域。这也有助于减少数据从芯片传输到硬盘所需的时间，该过程往往是高帧率成像中的速率限制步骤。
   5. 进行双色TIRF实验时，应尽量减少荧光串色。对于RFP/GFP组合，应使用独立的发射滤光片，因为RFP可被488 nm光微弱激发（图2A）。大多数滤光片之间并非完全对齐。可通过将荧光微珠与细胞混合来校正滤光片偏移。为实现相近的穿透深度，需针对每条激光线分别调节TIRF角度。典型工作流程见图2B。
   6. 影响图像质量的一个关键参数是激光准直和物镜清洁度。进行激光准直时，首先聚焦至用于TIRF成像的z轴位置。然后移除样品，并彻底清除物镜上的所有浸油（残留油渍会导致激光衍射并在光束轮廓中产生散斑）。在TIRF模式下将激光投射到天花板上，校准0°位置，使激光与物镜保持直线对齐（使用参考光斑，务必佩戴激光防护眼镜，并避免光路中出现任何反射）。将激光光斑聚焦至最小尺寸。我们的系统在伺服电机与显微镜之间设有可移动透镜，便于快速校准。在最佳调节状态下，激光轮廓应形成一个边界清晰、大致呈圆形的光斑。每次实验前均应执行校准，以获得最优图像质量。

3. 代表性结果

1. 肌动蛋白同源物及细胞壁酶在细胞中的分布 Bacillus subtilis. 我们通过全内反射荧光显微镜（TIRF）和常规落射荧光显微镜对表达肌动蛋白同源物 Mbl 或转肽酶 PbpH 的 GFP 融合蛋白的细胞进行了成像。TIRF 中的穿透深度明显降低，仅限于面向盖玻片的表面区域。图 3A、B）。弱表达的转肽酶 PbpH 定位于皮层斑块，通过落射荧光难以观察，但可通过全内反射荧光（TIRF）清晰分辨图 3B）。PbpHGFP 信号在隔膜处的穿透减少最为明显，在落射荧光显微镜下呈现为线条状，而在全内反射荧光显微镜（TIRF）下则呈现为点状图3B，箭头).


2. 酵母细胞质膜中的蛋白质结构域 酵母中由质膜蛋白形成的网络样模式的示例已在 图 1C 和 2除了TIRF显微镜提供的增强对比度可清晰区分这些网状结构外，某些微弱信号有时仅能通过TIRF显微镜检测到。例如，我们对TORC2复合物组分Bit61的GFP融合蛋白进行了成像，该蛋白来源于 Saccharomyces cerevisiae该蛋白表达较弱，形成的小型皮层斑块中每斑块仅含少量蛋白拷贝⁹在落射荧光显微镜下，仅能观察到少数斑点位于强烈的背景之上，而在全内反射荧光显微镜（TIRF）中，斑点可被清晰成像，信噪比非常高。图 3C因此，TIRF 特别适用于研究细胞表面弱荧光的结构和蛋白质。
   
   TIRF 提供的高轴向分辨率已能降低背景荧光。通过多种图像处理步骤可进一步提高图像对比度。一种简单的标准技术是局部背景均衡化，即从原始图像中减去一幅模糊图像。模糊可通过多种低通滤波器实现，包括中值滤波器或高斯滤波器（图 3D）。局部背景减除可去除噪声并增强高强度结构的清晰度，但通常会以丢失精细结构为代价，并导致高强度区域被过度放大图 3D，箭头）。更优的方法是二维去卷积，可使用免费或商业软件包（如 ImageJ、Matlab 或 Huygens（Scientific Volume Imaging b.v.））实现。TIRF 图像具有极佳的轴向分辨率，因此其点扩散函数（PSF）几乎呈二维分布。我们通过使用与实际成像相同的设置（物镜、相机、激发和发射波长）采集 40 nm 荧光微球的图像，实验测定该 PSF。随后在 Huygens 软件中采用经典的极大似然算法，利用实验测得的 PSF 进行去卷积处理。GFPRas2 或 Fet3GFP 与 Pma1RFP 的延时成像视频（视频 3 和 4) 展示去卷积后对比度的增强。在双色图像中，最大化对比度至关重要，以便能够量化共定位值。视频 4).


3. 细胞皮层蛋白质周转分析 全内反射荧光显微镜（TIRF）与荧光漂白恢复技术（FRAP）相结合，为研究皮层蛋白动态提供了强大工具。然而，为高效利用这些技术，需快速调控激光角度与位置。在TIRF这一宽场技术中，激光必须聚焦于物镜的后焦平面，并以较小的入射角入射，以实现所需的全内反射。相比之下，FRAP要求激光直接聚焦于样品，并具备高空间精度，以便对特定结构或区域进行漂白。本研究中所采用的Till Photonics系统可对上述参数实现快速且直观的控制。系统使用两个由检流计驱动的反射镜，用于调节FRAP在x、y方向的位置或设定TIRF的入射角；另有一个反射镜用于切换TIRF与FRAP各自的光路（在TIRF光路中，激光通过附加透镜被展宽）。所有参数均由LA（live acquisition）软件控制，且可在每次实验前快速完成校准，以达到最佳成像条件。该软件还支持在图像采集过程中定义漂白位置，这对于运动结构的FRAP实验至关重要。
   利用这一特性，我们可以排除Mbl纤维的踏车行为作为含Mbl斑块运动的来源图 3E这一观察结果促使我们寻找其他运动机制，最终导致我们发现了一种完全出乎意料的运动方式：细胞内的蛋白质复合物（包括Mbl）通过位于细胞外侧的细胞壁合成酶的活性被推动移动⁴以类似的方式，我们能够观察到酵母细胞质膜蛋白的缓慢重排，这些蛋白分布形成网状结构域，覆盖整个细胞表面（图 3F).
   这些实例展示了如何通过结合全内反射荧光显微技术（TIRF）和荧光漂白恢复技术（FRAP）直接评估皮层蛋白的动力学行为与空间分布模式。

4. 代表性结果

图1. 参数调节。A. 污染与清洁盖玻片的对比。盖玻片上的灰尘产生的背景信号会干扰潜在的GFP/RFP信号，清洁后的盖玻片背景较低。B. 自制电加热控制器，显示设定温度（a）、探针处温度（b）和样品台温度（c）。C. 酿酒酵母蛋白Pma1GFP在入射角逐渐减小条件下成像（从左上到右下）。图像显示在临界角处信号突然消失，并且结构信息和信噪比逐步下降。D. 视场不均匀。对高密度荧光微球悬浮液成像，显示仅有部分视场处于焦点范围内。A、B中的标尺：2 μm，C中的标尺：10 μm。

图 2. 双色成像。A. Pil1RFP的串色现象。使用488 nm和561 nm激光激发Pil1RFP，并通过双通道带通滤光片记录荧光信号。Pil1RFP信号在GFP通道中微弱可见。比例尺：2 μm B. 在双色成像中避免串色的典型步骤。分别使用不同的滤光片组对细胞成像后，通过荧光微珠对图像进行去卷积和对齐，然后合并用于分析。

图3. 代表性结果。A. 使用全内反射荧光（TIRF）或常规落射荧光（Epi）显微镜观察B. subtilis中GFPMbl分布的比较。蓝色：明场图像中的细胞边界。图像代表时间序列的平均投影，用于显示通过不同成像模式监测到的运动性MreB斑块所覆盖的区域。B. 对B. subtilis中转肽酶PbpHGFP进行TIRF成像所获得的轴向分辨率和对比度的提升。箭头指示在落射荧光下呈环状、而在TIRF下呈斑块状的隔膜染色。曝光时间：100 ms。C. 对酿酒酵母（S. cerevisiae）中TOR复合物组分Bit61在落射荧光与TIRF照明下的成像比较。Bit61表达水平极低⁹。曝光时间：250 ms。D. 不同图像处理方法的比较。图示为Pma1GFP的原始TIRF图像，以及高斯模糊或中值模糊图像相减结果，还有使用Huygens软件中最大似然算法进行去卷积的结果。E. 单个GFPMbl斑块（星号上方）在B. subtilis细胞上移动时的TIRF-FRAP实验。该斑块无恢复的明暗图及其沿明暗图的强度分布（虚线）排除了“踏车”运动作为其运动来源的可能性。F. 表达Pma1GFP的酵母细胞的TIRF-FRAP实验。注意皮层染色模式中缺口呈扩散性闭合。比例尺：2 μm。时间为秒。

视频 1. 在脏的盖玻片上表达 RFP 融合蛋白的 B. subtilis 细胞的动态成像。请注意，RFP 信号几乎无法与背景噪声区分。循环时间为 100 ms。点击此处观看视频。

视频 2. Pma1GFP 在不同入射角度下的成像视频。入射角度从低于临界角逐渐调整至临界角，直至信号消失。注意，在低于临界角时，内部信号可见，导致图像噪声较大；仅当达到临界角时，细胞膜（PM）上的蛋白信号才清晰可见。循环时间为 200 ms。比例尺：2 μm。点击此处观看视频。

视频 3. 酵母 GFPRas2 的动态视频，显示交替的 RAW 图像与去卷积 TIRF 图像。GFPRas2 是一种快速移动的蛋白质（半衰期为 2 秒，未发表数据），因此快速采集时间对于解析其动态行为至关重要。循环时间为 150 毫秒。比例尺：2 μm。点击此处观看视频。

视频 4. 酵母蛋白 Fet3GFP 和 Pma1RFP 的双色成像。前 10 帧为原始图像，最后的帧为去卷积处理后的图像。该视频展示了图像处理在共定位分析中的重要性。模糊的原始图像经处理后变得清晰，从而使分析成为可能。循环时间 5 s。比例尺：2 μm。点击此处查看视频。

讨论

全内反射荧光显微镜（TIRF）是成像外周蛋白的首选技术。由于消逝场的穿透深度较浅，可最大程度减少离焦光，从而获得极佳的信噪比，使得能够以高帧率进行数据采集，或对表达量极低的蛋白进行成像。高对比度与高帧率的结合，使TIRF显微镜成为研究皮层局部化蛋白时空动态的理想工具。有趣的是，许多微生物周围较厚的细胞壁并不会阻碍TIRF对外周蛋白的成像。事实上，消逝场的实际产生位置很可能位于细胞壁与质膜之间的界面^5,10。从细胞中出射的光可能发生反射，进而沿细胞壁传播，这或许可以解释在酵母细胞中能够成像较大表面积的原因⁸。

为了获得高质量的全内反射荧光（TIRF）图像，必须确保显微镜系统经过良好校准。每次成像前，应聚焦并校正激光光路。盖玻片需清洁（图1A），细胞必须被妥善固定。进行双色成像时，需考虑或通过使用可分离发射波段的滤光片组来消除光谱串色。但显然，由于机械滤光片切换，这将导致成像速度变慢。如有必要，可采用快速滤光轮或基于检流计驱动的照明光源以避免此类延迟。或者，可将关键荧光蛋白（RFP）用于表达水平较低的目标蛋白...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
轨道摇床	UniEquip	UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER
全内反射荧光显微镜		定制装置
玻璃容器	Vitlab	340-232880353
陶瓷染色架	Thomas Scientific	8542E40
刀豆蛋白A	Sigma-Aldrich	L7647
盖玻片 #1（18 × 18 mm）	Menzel-Glaser	BB018018A1
显微镜载玻片	Menzel-Glaser	AA00000102E
浸油	Carl Zeiss, Inc.	Immersol 518F
琼脂糖	Invitrogen	16500-500
FluoSpheres	Invitrogen	F8795