使用全内反射荧光显微镜观察微生物皮层结构与动态

摘要

全内反射荧光（TIRF）显微镜是一种强大的技术，可用于高对比度和高时间分辨率地观察靠近细胞表面的结构。我们展示了如何利用TIRF研究细胞壁包被的细菌和真菌细胞皮层中的蛋白质动态。

摘要

全内反射荧光显微镜（TIRF）已成为一种强大的成像技术，用于研究体外及活细胞中荧光分子的空间-时间动态¹。当光以大于某一特征临界角（即更接近与界面平行）的角度从折射率较高的介质进入折射率较低的介质时，会发生全内反射这一光学现象。尽管在此条件下所有光线均被反射回原介质，但仍会产生一种沿界面传播的隐逝波，该波随距离呈指数衰减，仅能穿透距界面约100–200 nm范围内的样品区域²。除了提供优异的轴向分辨率外，TIRF还能显著减少离焦荧光分子的激发，从而获得极高的信噪比，并最大限度地降低光漂白带来的损伤效应^2,3。作为一种宽场成像技术，TIRF也比大多数基于扫描的共聚焦系统具有更快的图像采集速度。

从表面上看，全内反射荧光显微镜（TIRF）较浅的穿透深度似乎难以适用于成像具有厚细胞壁的细菌和真菌细胞。然而，我们发现酵母和细菌细胞的细胞壁实际上能够提升TIRF的可用性，并扩大可观测结构的范围^4-8。因此，对于许多体积小、单细胞的微生物而言，TIRF可直接用于研究多种细胞过程，而这些微生物通常具备强大的遗传操作技术。这使得我们能够在活细胞中开展in vivo 生物化学实验，直接评估蛋白质相互作用和活性的动力学过程。

本文介绍了获取酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）细胞高质量全内反射荧光（TIRF）图像所需的各个步骤。我们指出了可能影响细胞中荧光探针TIRF成像效果的多种问题，并通过多个应用实例展示了实验流程。最后，我们演示了如何利用成熟的图像恢复技术进一步提升TIRF图像质量。

方案

1. 样品制备

1. 准备盖玻片
   应清除盖玻片上的灰尘颗粒，因为全内反射荧光显微镜（TIRF）对来自盖玻片的背景信号非常敏感（图 1A，视频 1）。
   1. 使用镊子将盖玻片放入带盖的陶瓷 holder 中。
   2. 在玻璃容器中加入 1 M NaOH（可多次重复使用）。
   3. 在缓慢连续旋转（轨道摇床）条件下孵育 2 小时。过度孵育（> 8 小时）会导致盖玻片变浑浊。
   4. 在缓慢连续旋转条件下，用蒸馏水洗涤两次，每次 5 分钟。
   5. 将盖玻片储存在盛有 100% 乙醇的陶瓷 holder 中。
2. 准备 Bacillus subtilis 细胞
   
   1. 将菌液稀释至 OD₆₀₀ 为 0.01 - 0.05，加入 5 ml 合适的培养基中，培养至对数生长期（OD₆₀₀ 为 0.3-0.7）。
   2. 配制 1.25% 琼脂糖水溶液或培养基溶液。建议使用合成培养基以减少背景荧光。在 95°C 条件下于 ....

讨论

全内反射荧光显微镜（TIRF）是成像外周蛋白的首选技术。由于消逝场的穿透深度较浅，可最大程度减少离焦光，从而获得极佳的信噪比，使得能够以高帧率进行数据采集，或对表达量极低的蛋白进行成像。高对比度与高帧率的结合，使TIRF显微镜成为研究皮层局部化蛋白时空动态的理想工具。有趣的是，许多微生物周围较厚的细胞壁并不会阻碍TIRF对外周蛋白的成像。事实上，消逝场的实际产生位置很可能位于细胞壁与质膜之间的界面^5,10。从细胞中出射的光可能发生反射，进而沿细胞壁传播，这或许可以解释在酵母细胞中能够成像较大表面积的原因⁸。

为了获得高质量的全内反射荧光（TIRF）图像，必须确保显微镜系统经过良好校准。每次成像前，应聚焦并校正激光光路。盖玻片需清洁（图1A），细胞必须被妥善固定。进行双色成像时，需考虑或通过使用可分离发射波段的滤光片组来消除光谱串色。但显然，由于机械滤光片切换，这将导致成像速度变慢。如有必要，可采用快速滤光轮或基于检流计驱动的照明光源以避免此类延迟。或者，可将关键荧光蛋白（RFP）用于表达水平较低的目标蛋白.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
轨道摇床	UniEquip	UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER
全内反射荧光显微镜		定制装置
玻璃容器	Vitlab	340-232880353
陶瓷染色架	Thomas Scientific	8542E40
刀豆蛋白A	Sigma-Aldrich	L7647
盖玻片 #1（18 × 18 mm）	Menzel-Glaser	BB018018A1
显微镜载玻片	Menzel-Glaser	AA00000102E
浸油	Carl Zeiss, Inc.	Immersol 518F
琼脂糖	Invitrogen	16500-500
FluoSpheres	Invitrogen	F8795