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体外电穿孔转染中期小鼠胚胎菱脑唇下部

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DOI：

10.3791/3983

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2012年8月3日

 ,  ,  , 
1Biology Department, University of Illinois at Springfield

本文内容

摘要

本研究描述了一种 体外 一种电穿孔技术，可实现对中期胚胎菱脑下唇基因表达的调控。

摘要

菱形唇是位于后脑的一个胚胎期神经上皮结构，处于神经管与第四脑室顶板的交界处（详见文献1）。菱形唇可分为上菱形唇（URL），其涵盖菱脑节1（r1），并产生小脑神经元；以及下菱形唇（LRL），其产生多种脑干神经元谱系2-4。LRL的衍生物包括耳蜗核的听觉神经元，以及参与调节平衡和运动控制的前小脑核团的神经元5-8。LRL的神经发生过程发生在一个较宽的时间窗口内，涵盖胚胎发育第9.5至16.5天（E9.5–E16.5）5, 9。在此神经发生期内，不同的神经元谱系作为终末分裂后的细胞（或称“出生”）在特定的发育时间点依次出现。

电穿孔法导入基因表达载体可用于操控LRL前体细胞中的基因表达，并可能改变由该区域产生的神经元的命运 10-12通过改变小鼠LRL前体细胞的基因表达 在子宫内 电穿孔技术在操控胚胎第12.5天（E12.5）或之后出生的细胞谱系方面已取得显著成功 10, 12-14. 在子宫内 在E12.5之前进行的电穿孔实验一直未能成功，主要原因是穿刺第四脑室顶板会导致胚胎死亡，而穿刺顶板是将外源DNA递送至LRL并进行电穿孔所必需的步骤。然而，许多源自LRL的细胞谱系在E12.5之前便已从LRL产生。 9这些较早生成的谱系包括构成脑桥旁网状核、外侧楔束核和下橄榄核的神经元，这些核团属于前小脑系统，其功能是将脊髓和大脑皮层的输入信息传递至小脑。 5为了在 E12.5 之前的胚胎中操控 LRL 中的基因表达，我们开发了一种方法 体外 电转染后将胚胎放入培养的系统。

本研究提出了一种在E11.5时期高效调控LRL前体细胞基因表达的方法。利用广泛活性的CAG启动子驱动绿色荧光蛋白（GFP）对胚胎进行电穿孔处理，经过24小时培养后，胚胎可重复地表达GFP。该实验方法的关键在于，基因表达的改变仅源于外源基因的表达，而非由电穿孔和培养技术所引发的次级效应。研究确定，在经过电穿孔和体外培养的胚胎中，内源性基因表达模式保持未受干扰。该实验体系可用于通过导入过表达质粒或RNA干扰（RNAi）质粒，调控E12.5之前胚胎LRL来源细胞的命运，以干预不同的前神经转录因子。

方案

1. 电穿孔前的准备工作

  1. 通过大提试剂盒（Prime-It 或 Qiagen）扩增用于电穿孔的 DNA。DNA 浓度应至少为 1 mg/mL，以确保高效的细胞摄取。
  2. 取 495 μL DNA，与 5 μL 0.01% 快绿溶于 1× PBS（磷酸盐缓冲液）中，在微量离心管中混匀。

2. 胚胎收获

  1. 建立 CD-1 小鼠（Harlan）的定时交配。检查阴道栓的存在，并将观察到阴道栓的当天记为胚胎发育第（E）0.5 天。在观察到阴道栓后第 11 天（E11.5）获取胚胎。
  2. 将灭菌器械置于 70% 乙醇中。使用前，用紫外灯对超净工作台照射至少一小时。用 70% 乙醇喷洒工作台面、解剖托盘和解剖显微镜。将 1 × PBS 预热至 37 °C。
  3. 在 E11.5 天，根据机构动物护理与使用委员会（ICCUA）批准的条件对雌鼠实施安乐死。将解剖托盘放入超净工作台中。用 70% 乙醇喷洒雌鼠腹部。
  4. 打开腹腔，并将腹壁固定在解剖托盘上。拉出子宫角，使其位于腹腔内。
  5. 小心切开子宫角壁。使用 20 mm 勺子（Fine Scientific Tools）轻柔地将胚胎连同卵黄囊从胎盘分离并取出。将胚胎放入已预先加入 10 mL 无菌 1 × PBS 的 100 mm 组织培养皿中，该 PBS 已在步骤 2.2 中预热。
  6. 对所有存在的胚胎重复上述操作。

3. E11.5 胚胎的电穿孔（图1）

  1. 使用一个20 mm的勺子，将第一个胚胎转移至一个新的100 mm培养皿中，该培养皿已预先加入10 mL经灭菌并预热至37 °C的1×PBS缓冲液。
  2. 使用尖端尺寸为0.05 × 0.02 mm的11 cm镊子（Fine Scientific Tools）小心去除并弃去卵黄囊。
  3. 将胚胎摆放至背侧朝上的位置，使其形态类似于图1A中的示意图。使用7 mm电极板（Harvard Apparatus）轻轻固定胚胎。电极板应放置在后脑第四脑室水平的神经管两侧。第四脑室肉眼可见，但使用解剖显微镜有助于准确放置电极板。电极板的位置对于确定电穿孔DNA的靶向区域至关重要。若目标为胚胎后脑背侧的下菱形唇（LRL），则必须将电极板置于第四脑室开口最宽处的正两侧。
  4. 使用1 cc注射器吸取与0.01%快绿染料混合的质粒DNA。500 μL混合液足以完成至少8–10个胚胎的电穿孔实验（见3.5节）。
  5. 将连接在1 cc注射器上的25G 5/8规格结核菌素针头轻轻刺入覆盖第四脑室的室顶膜，并将DNA-染料混合液注入脑室内。成功的注射表现为DNA-染料混合液充满整个脑室系统（图1C）。通常注入的DNA-染料混合液体积小于50 μL。由于部分混合液会从脑室泄漏至胚胎周围的PBS中，因此每次注射的实际体积在不同胚胎间存在差异。另一种递送DNA-染料混合液的方法是通过穿刺中脑上方的膜结构进入脑室系统。同样，成功的注射以DNA-染料混合液充满整个脑室系统为特征。
  6. 使用电脉冲发生器（BTX）和7 mm电极板施加五个方波脉冲。每个脉冲电压为50 V，持续时间为5 ms，脉冲间隔为500 ms。靠近正极电极的组织将摄取质粒DNA。

4. 胚胎培养

  1. 在超净工作台中，向12孔培养板的外周孔中加入2 mL预热至37 °C的DMEM/F12培养基，培养基中添加10%胎牛血清、5%马血清、1%谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素。该培养条件改编自de Diego及其同事的研究15。
  2. 在超净工作台中，用镊子夹住胚胎中段（心脏下方），去除胚胎后部组织，将前部组织放入12孔培养板的一个已加液孔中。
  3. 对所有胚胎重复上述操作。仅填充12孔板的外周孔，以避免培养物污染。
  4. 将胚胎置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。电穿孔质粒的表达应在24小时内可观察到。
  5. 若需延长培养时间，取新的12孔板，在其外周孔中加入4.1步骤所用培养基2 mL。用灭菌勺将胚胎转移至新板的孔中，放回37 °C培养箱。最长可培养至48小时。
  6. 当达到所需培养时间后，固定胚胎以进行后续分析（见下文）。

5. 分析用胚胎的制备

  1. 在 4 °C 条件下，用 1 X PBS 清洗胚胎 5 分钟。重复一次。
  2. 在 4 °C 条件下，用含 2% 多聚甲醛（PFA）的 1 X PBS 固定胚胎 2 小时，用于后续分析。
  3. 在 4 °C 条件下，用 1 X PBS 清洗胚胎 5 分钟。重复一次。
  4. 在 4 °C 条件下，将胚胎置于含 30% 蔗糖的 1 X PBS 中过夜平衡。
  5. 使用干冰/乙醇浴将胚胎包埋于最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂中。胚胎可在 -20 °C 下保存。
  6. 使用冷冻切片机（Leica）将胚胎切成 30 μm 切片，并转移至载玻片（VWR，Superfrost Plus）上。于 -20 °C 保存。

6. 免疫组织化学分析

  1. 免疫组织化学操作步骤如文献16所述进行。本研究使用的一抗稀释比如下：兔抗GFP（Invitrogen）1:2500；小鼠抗Mash1（BD Biosciences）1:100；兔抗Ngn1（Jane Johnson）1:5000；兔抗Ptf1a（Jane Johnson）1:2500；兔抗Math1（Jane Johnson）1:100。将切片平放于染色盒中，组织面向上，于4 °C孵育过夜。
  2. 使用复合显微镜（Olympus BX51）对切片进行分析。

7. 代表性结果

图1A 示意图展示了电穿孔实验。图1B 显示了操作前E11.5胚胎的矢状面视图。同一胚胎在注射含有 CAG::GFP 的质粒（溶于0.01%快绿溶液中）后的图像见图1C，而图1D展示了一个典型的未经固定的胚胎，在培养24小时后表现出后脑背侧单侧的 GFP 表达。成功实现电穿孔的菱脑唇（LRL）区域范围存在差异，且似乎高度依赖于电极的位置。在我们的研究中，65个电穿孔胚胎中有52个（80%）成功表达了 GFP。若固定后通过免疫组织化学分析，在多个切面上均能在局部区域检测到GFP阳性信号，则认为该组织电穿孔成功（见下文）。未能满足此标准的胚胎被记为电穿孔失败。

可通过在第四脑室水平对电转染胚胎进行横断面切片的GFP免疫组织化学染色，进一步评估电穿孔效率。图2展示了显示单侧GFP表达的胚胎的代表性连续切片。图2A为理想化的示意图，说明胚胎左侧朝向正极。横断面切片（对应于图2A中间示意图所示水平）显示GFP表达仅局限于后脑组织的左侧（图2C和2D）。电转染的LRL区域并未延伸至神经管的整个前后轴，因为在图2C所示切片更前端300 μm或更远处的切片中未检测到GFP表达（图2B）。

该检测方法在基因表达操控方面的应用价值取决于内源性蛋白表达区域的稳定性。LRL 被证实具有独特的前体细胞区域，其特征在于不同神经前体转录因子的差异表达（详见文献1）。本研究选择其中一部分转录因子（Mash1、Math1、Ngn1 和 Ptf1a）进行分析，因其已被提出或证实参与 LRL 中小脑前体神经元亚型的特化过程，这也是后续研究的主题16-18。这四种蛋白在 E11.5 期尾部后脑中均具有高度特征性的表达区域16-18。我们观察到，被置于培养条件下的胚胎未能继续增大体积，也未能启动脉络丛上皮的生成以及 LRL 和顶板的内陷过程——这些形态学事件通常发生在 E11.5 至 E12.5 之间5。基于上述观察结果，可判断这些胚胎的正常发育已停止或显著延迟，因此，培养胚胎的相应对照应为未培养的 E11.5 期胚胎。

为确保培养和电穿孔不会影响内源性蛋白的表达水平，我们对34个经电穿孔并培养至少24小时的胚胎进行了免疫组织化学（IHC）分析，检测了四种不同蛋白的表达情况。 表 I 显示了每种标记物所分析的胚胎数量，以及分析胚胎中保持正常蛋白水平的百分比。 图3 显示了所分析的两种蛋白质中Mash1的代表性免疫组化数据（图3A 和 3B）和 Math1（图3C和图3D我们观察到，经过电穿孔和培养后，大部分胚胎仍保持正常的表达水平图3B和图3D) 与 E11.5 时期的对照组胚胎相比（图3A和图3C重要的是，这些蛋白质的特征性表达区域未受到干扰。

神经管发育：示意图和胚胎图像，4v为第四脑室，荧光显微镜成像。
图1. E11.5 胚胎的电穿孔操作。 （A）电穿孔实验的示意图。分离 E11.5 胚胎后，将含有 0.01% 快绿的表达质粒注入第四脑室。随后在胚胎两侧放置电极板，施加 50 V 脉冲，之后将胚胎放入培养环境中。（B）注射前 E11.5 胚胎的矢状面图像。（C）同一 E11.5 胚胎在注入含 0.01% 快绿的质粒后的图像。（D）培养 24 小时后，在 E11.5 胚胎中观察到的 GFP 在后脑的单侧表达。mb—中脑；4v—第四脑室。

神经解剖图：脑切片及第四脑室区域横切面的荧光显微镜图像。
图 2. 电转染组织中 GFP 的表达。 （A）左侧示意图显示电极在 E11.5 胚胎周围的放置位置。中间示意图显示编码 GFP 的质粒在胚胎左侧的摄取与表达。右侧示意图表示通过中间图中黑线所示水平的理想化横切面。 （B−D）对电转染后培养 24 小时的 E11.5 胚胎进行横切面 GFP 免疫组织化学染色。箭头指示顶板（rp），其可非特异性结合二抗。图像以 10X 放大倍数拍摄。所示切片的相对位置由（A）中中间示意图的水平线标示。mb-中脑；4v-第四脑室；rp-顶板。

免疫荧光结果；α-Mash1 和 α-Math1 表达，细胞培养条件比较。
图 3. 菱脑下唇内源性蛋白的表达。 对未进行培养的 E11.5 胚胎（A、C）与转染 CAG::GFP 并培养 24 小时的胚胎（B、D）的横切面进行 Mash1（A 和 B）或 Math1（C 和 D）的免疫组织化学染色比较。图像拍摄于 10 倍放大倍数下。

分析的促神经转录因子分析的胚胎数量保持正常表达模式的百分比
Math11586.7%
Mash11283.3%
Ngn1771.4%
Ptf1a6100%

表 I. LRL 区域中保留正常原神经转录因子表达域的电穿孔并培养胚胎的百分比。

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讨论

本研究介绍的 体外 电穿孔技术是一种新型方法，可高效用于操控妊娠12天以内的胚胎中的基因表达。将胚胎置于体外培养环境中，可实现导入基因的表达，并避免了电穿孔后胚胎在 体内 继续发育时所出现的致死现象。该技术使得此前难以通过电穿孔方法进行研究的胚胎前体细胞中的基因表达调控成为可能。

电穿孔技术在所分析的80%胚胎中实现了导入基因的高效表达。如图2所示，电穿孔组织的范围局限于特定区域。为了特异性地靶向后脑的某一特定区域进行电穿孔，必须精确放置电极，因为电极位置决定了受影响组织的部位。如果希望靶向胚胎背侧后脑的下菱形唇区域，则需将电极板置于第四脑室开口最宽处的两侧正对位置。如果希望在神经管的一侧实现单侧表达，则需将胚胎置于电极之间，使神经管的轴线与电极板平行。胚胎倾斜可能导致靶向不准确和/或双侧表达。为了优化以获得更佳的电穿孔效率，可调整电穿孔电压，因为这可能会提高摄取电穿孔DNA的细胞比例。此外，也可进一步浓缩DNA储备液。由于神经管只能容纳少量液体，使用更高浓度的样品可在电穿孔时将更多质粒导入细胞。最后，还可改变电...

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致谢

作者感谢 Jane Johnson 提供的 Math1、Ngn1 和 Ptf1a 抗体，以及 Connie Cepko 提供的 pCAG::GFP 质粒。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R15 1R15HD059922-01 项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
冷冻切片机Leica MicrosystemsCM-1850
Biologie 尖端经 Dumoxel 处理的 DUMONT 镊子Fine Science Tools11252-30
20 mm MORIA 带孔勺Fine Science Tools10370-17
ECM 830 方波电穿孔仪BTX (VWR)47745-928
Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* 电极BTX (Fisher)BTX450165
Fisher Isotemp CO2 培养箱Fisher Scientific1325525
NAPCO CO2 气体调节器Fisher Scientific15497020
12 孔组织培养板BD Falcon (Fisher)877229
HyClone 液体培养基 DMEM/F-12 (1:1)；含 L-谷氨酰胺和 HEPES；500 mLThermo Scientific (Fisher)SH3002301
HyClone* 供体马血清Thermo Scientific (Fisher)SH3007402
胎牛血清，经鉴定，热灭活Invitrogen16140-063
cellgro* 10,000 IU 青霉素，10,000μg/mL 链霉素Mediatech (Fisher)MT-30-002-CI
HyClone* L-谷氨酰胺；200 mM 溶于 0.85% NaCl；200 mMThermo Scientific (Fisher)SH3003401
快绿Fisher ScientificAC41053-02500.01%

参考文献

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