诱导多能干细胞向T淋巴细胞的定向分化

摘要

由诱导性多能干细胞（iPS细胞）生成T淋巴细胞，为T细胞免疫治疗提供了一种替代使用胚胎干细胞的新途径。该方法表明，通过利用以下任一方式 体外 或 体内 诱导系统能够使iPS细胞分化为常规T淋巴细胞和抗原特异性T淋巴细胞。

摘要

过继性细胞转移（adoptive cell transfer, ACT）抗原特异性的CD8⁺ 细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）是治疗多种恶性肿瘤的有前景策略¹。CTLs可通过T细胞受体（TCR）与肿瘤抗原相互作用来识别恶性细胞，并释放细胞毒素及细胞因子以杀伤恶性细胞。已知分化程度较低且具有中央记忆样表型（称为高反应性）的CTLs是基于ACT的免疫治疗中最理想的细胞群体，因为这类CTLs具有较强的增殖潜能，较已分化细胞更不易发生凋亡，并且对稳态细胞因子具有更强的响应能力^2-7。然而，由于从患者体内获取大量此类CTLs存在困难，因此迫切需要开发一种新方法以生成高反应性的抗原特异性CTLs，从而实现ACT疗法的成功应用。

将T细胞受体转导至可自我更新的干细胞以实现免疫重建，在疾病治疗中具有治疗潜力 ^8-10然而，从患者体内获取胚胎干细胞（ESCs）的方法并不可行。尽管造血干细胞（HSCs）在临床治疗中的应用已十分广泛 ^11-13，造血干细胞的分化能力和增殖能力降低，且难以在体外扩增 体外 细胞培养 ^14-16. 近期iPS细胞技术的发展及一种 体外 无需任何外科手术即可从患者体内生成诱导多能干细胞的基因递送系统。此外，与胚胎干细胞类似，诱导多能干细胞具有无限增殖能力 体外，并已被证明可分化为造血细胞。因此，与胚胎干细胞（ESCs）或造血干细胞（HSCs）相比，诱导性多能干细胞（iPS细胞）在基于细胞疗法的免疫治疗中具有更大的应用潜力。

本文介绍了由诱导性多能干细胞（iPS细胞）生成T淋巴细胞的方法 体外，和 体内 由iPS细胞编程抗原特异性CTL以促进癌症免疫监视。刺激 体外 使用Notch配体可诱导iPS细胞向T细胞分化，而TCR基因转导可使iPS细胞分化为抗原特异性T细胞 体内，从而抑制肿瘤生长。因此，我们展示了由iPS细胞分化为抗原特异性T细胞的过程。本研究为生成用于过继性细胞治疗（ACT）的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）提供了一种潜在更高效的方法，并有助于推动针对各类疾病的治疗策略的开发。

方案

1. 细胞培养

1. 用于培养的辐照SNL76/7（irSNL76/7）饲养层细胞的制备
   SNL76/7 细胞通常在含 10% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养。
   1. 在从液氮中复苏 SNL76/7 细胞前，需将培养皿或培养瓶用 0.1% 明胶溶液在 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。
   2. 当 SNL76/7 细胞达到汇合状态时，用胰蛋白酶消化细胞，400 g 离心 5 分钟，弃上清，重悬于新鲜培养基中。
   3. 重悬的SNL76/7细胞将在以下条件下进行辐照 ⁶⁰钴-60辐照器，剂量为5000拉德。
      可选方案，SNL76/7 细胞可用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）替代，且可用丝裂霉素失活替代辐照处理。
   4. 照射后，细胞以400 g离心5分钟，重悬于含10%二甲基亚砜（DMSO）的FBS冻存缓冲液中，分装至冻存管，于液氮中保存以备后续使用。
2. OP9-DL1 细胞的制备 体外 分化
   OP9-DL1 细胞通常在含 20% 胎牛血清的 α-最小必需培养基（α-MEM）中培养。当细胞生长至融合状态时，按 1:5 比例传代。
3. E.G7胸腺瘤细胞的制备
   E.G7 胸腺瘤细胞通常在含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养基中培养。当细胞达到汇合状态时，按 1:10 的比例进行传代。
4. iPS细胞及TCR转导iPS细胞的常规培养与维护
   1. 在复苏或传代iPS细胞的前一天，将培养皿用0.1%明胶溶液在37 °C孵育30分钟进行包被，随后接种irSNL76/7饲养细胞。
   2. 对于iPS细胞的传代，将用胰蛋白酶消化细胞，400 g离心5分钟，然后重悬于含15%胎牛血清的DMEM培养基中。
   3. 将胰蛋白酶消化后的iPS细胞置于新的培养皿中，在37 °C培养箱中孵育30分钟，以去除已分化的细胞和残留的饲养细胞，随后接种于预先包被有irSNL76/7饲养细胞的新培养皿中。
   4. 孵育后，4×10⁶ 细胞将被接种于100 mm培养皿中。

2. 体外 编程

1. 体外共培养系统。
   1. 第0天，将5×10⁴个iPS细胞接种于含有融合OP9-DL1细胞单层的100 mm培养皿中，培养基为含20% FBS的α-MEM。
   2. 第3天，更换为新鲜培养基。
   3. 1. 第5天，用胰酶消化细胞，400 g离心5分钟，随后将细胞转移至新的100 mm培养皿中，在37 °C培养箱中孵育30分钟。
      2. 收集悬浮细胞并计数，取5×10⁵个细胞转移至含有融合OP9-DL1细胞单层的新培养皿中，培养基为含20% FBS的α-MEM，并添加细胞因子mFlt-3L（终浓度：5 ng/mL）。
   4. 1. 第8天，轻轻吹打使松散贴壁的细胞脱落。
      2. 用10 mL PBS再洗涤OP9-DL1饲养层一次，以最大程度回收部分分化的iPS细胞。
      3. 收集共培养体系中的细胞，400 g离心5分钟，重悬于含mFlt-3L（5 ng/mL）和mIL-7（1 ng/mL）的20% FBS α-MEM培养基中。
      4. 将细胞转移至预先铺有融合OP9-DL1细胞的6孔板中。通常，从一个100 mm培养皿回收的iPS细胞转移至6孔板的一个孔中。
   5. 1. 从第10天开始，每隔一天更换一次培养基（含20% FBS的α-MEM，补充mFlt-3L（5 ng/mL）和mIL-7（1 ng/mL））。
      2. 根据饲养细胞的生长情况，每4–6天更换一次铺有OP9-DL1细胞的培养板。
2. 体内部分分化iPS细胞的成熟。
   1. 共培养第22天，用胰酶消化iPS细胞，400 g离心5分钟，在37 °C下于新培养皿中孵育30分钟。
   2. 收集悬浮细胞，经70 μm尼龙滤网过滤以去除可能引起小鼠肺栓塞的细胞团块，并用冷PBS洗涤三次。
   3. 将细胞重悬于PBS中，浓度为1.5×10⁷个细胞/mL。
   4. 注射前将细胞置于冰上保存。
   5. 通过尾静脉进行i.v.注射前，将小鼠置于红外灯下以扩张其尾静脉。
   6. 静脉扩张后，将200 μL细胞悬液（即3×10⁶个细胞）经尾静脉过继转移至4周龄的B6.129S7-Rag1^tm1Mom/J小鼠体内。给予三周时间使部分分化的iPS细胞在体内完成成熟。
3. 评估。
   1. 分化细胞的形态学变化及细胞回收率。图1。
      1. 在与OP9-DL1细胞共培养的不同时间点，使用普通显微镜拍摄活细胞图像。
      2. 根据从培养物中收获的细胞数量计算细胞回收率。
   2. 表面标志物变化的流式细胞术分析。图2a。
      1. 在共培养的不同时间点，通过胰酶消化将细胞从培养物中分离，用冷PBS洗涤后进行细胞表面染色。
      2. 在使用不同荧光素标记抗体染色前，用Fc阻断剂24G2在4 °C下封闭细胞20分钟。
      3. 在4 °C染色20分钟后，用冷PBS洗涤三次，然后进行流式细胞术检测。
   3. 体外分化iPS细胞的激活。图2b。
      1. 激活实验前一天，于4 °C过夜在24孔板中包被抗-CD3抗体（终浓度：4 μg/mL，溶于PBS）。
      2. 共培养第22天，收集由iPS细胞衍生的T细胞，用冷PBS洗涤后，用板包被的抗-CD3抗体和可溶性抗-CD28抗体（终浓度：4 μg/mL）进行刺激。
      3. 在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育40小时，随后加入Brefeldin A继续培养4小时。
      4. 共培养结束时，收集细胞，洗涤，并如上所述用Fc阻断剂封闭。封闭后的细胞使用荧光素标记的抗体对CD8和TCR Vβ链等表面标志物进行染色。
      5. 表面染色后，使用4%甲醛固定细胞，并使用Biolegend的透化试剂盒进行透化处理。
      6. 透化后，使用荧光素标记的抗体对细胞内分子如IL-2和IFN-γ进行染色。
      7. 最终流式细胞术检测前，用冷PBS洗涤三次以去除未结合的过量抗体。
   4. 在Rag-/-小鼠体内的成熟。
      1. 体内发育三周后，处死Rag-/-小鼠，取出脾脏和淋巴结。
      2. 通过机械法获得单细胞悬液，使用ACK裂解缓冲液裂解红细胞，收集单核细胞并用冷PBS洗涤两次。
      3. 洗涤后，在4 °C下用Fc阻断剂24G2封闭细胞20分钟，封闭结束后，在4 °C下用不同荧光素标记的抗-CD3、抗-CD4、抗-CD8和抗-TCRβ抗体染色20分钟。
      4. 染色结束后，用冷PBS洗涤三次，然后进行流式细胞术检测。

3. 在体 编程

1. 逆转录病毒载体的构建
   1. MSCV-IRES-DsRED（MiDR）载体是通过将MSCV-IRES-GFP载体中的GFP基因替换为DsRED基因而构建的。
   2. 将OT-I T细胞受体基因亚克隆至MiDR载体中，构建OT-I/MiDR重组质粒。
2. 逆转录病毒转导与细胞分选
   1. Plat-E 包装细胞用于产生假病毒，该假病毒将用于后续的转导。
      1. 3×10⁶ 转染前一天，将Plat-E细胞接种于100 mm培养皿中。
   2. 第0天，使用GeneJamma转染试剂将OT-I MiDR质粒转染至Plat-E细胞中。
   3. 第1天，1x10⁶ 将iPS细胞接种至经0.1%明胶预包被的24孔板中的一个孔内。
   4. 1. 第2天，收集含假病毒的Plat-E细胞培养上清液，并通过0.4 μm滤器过滤，以去除潜在污染物。
      2. 在含有 5 μg/ml 多聚素（polybrene）的条件下，于 32 °C、1400 rpm 离心 1 小时进行转导。
      3. 离心法转导后，细胞将置于32 °C、5% CO₂条件下培养。₂ 过夜孵育。
   5. 第3天，重复第2天的转导操作，具体步骤如上所述。将预先用irSNL76/7饲养层细胞包被6孔板，以备后续使用。
   6. 第4天，将转导的iPS细胞用胰蛋白酶消化下来，以400 g离心5分钟，然后接种至预先包被的irSNL76/7饲养层细胞上。
   7. 细胞汇合后，用胰蛋白酶消化，400 g 离心 5 min，进行细胞分选。使用 MoFlo 细胞分选仪分选 GFP 和 DsRED 双阳性细胞。分选后的细胞将接种于 irSNL76/7 饲养层细胞上，用于后续实验。
3. 过继性转移与肿瘤攻击。
   OT-I TCR转导的iPS（OT-I/iPS）细胞通常如上所述培养在irSNL76/7饲养细胞上。
   1. 在过继转移当天，将OT-I/iPS细胞用胰蛋白酶消化脱落，以400 g离心5分钟，并重悬于新鲜培养基中。
   2. 在37 °C培养箱中，于新的培养皿中孵育30分钟，以去除已分化细胞和残留的饲养层细胞。
   3. 孵育结束后，收集悬浮细胞，在400 g下离心5分钟。
   4. 细胞沉淀将用预冷的PBS洗涤三次，每次洗涤之间通过70 μm尼龙滤网过滤，以去除细胞团块（共过滤两次）。
   5. 洗涤后，将对细胞进行计数，并重悬于冷PBS中，浓度为1.5×10⁶⁷ 细胞/毫升
   6. 细胞在注射前将置于冰上保存。
   7. 用于过继转移的4-6周龄雌性C57BL/6J小鼠。在 i.v. 通过尾静脉注射时，需将小鼠置于红外灯下以扩张其尾静脉。
   8. 静脉扩张后，注入200 μl细胞悬液或3×10⁶个细胞⁶ 细胞将通过尾静脉过继转移。给予六周时间以 体内 OT-I TCR 转导的iPS细胞的成熟
   9. 1. 六周后 i.v. 注射，4x10⁶ E.G7 胸腺瘤细胞将被腹腔接种。
      2. E.G7 胸腺瘤细胞将从培养物中收集，并用 PBS 洗涤三次。
      3. 洗涤结束后，细胞将悬浮于冷的PBS中，浓度为8x10⁷ 细胞/毫升
      4. 50 μl 细胞悬液或 4×10⁶ 细胞将被注射到腹腔内。
4. 评估。
   1. 体外 OT-I TCR 转导的 iPS 细胞的表征
      1. 在常规荧光显微镜下对未固定的活细胞进行DsRED、GFP双阳性细胞的荧光显微观察。
      2. 通过PCR和RT-PCR分析基因整合与表达情况。
         1. 使用Qiagen的DNA或RNA提取试剂盒分别从样品中分离细胞DNA或RNA。
         2. 将使用特异性识别TCR Vβ5链重排后VDJ区域的引物进行PCR和RT-PCR。
   2. T细胞的发育与成熟 图3a.
      1. 在细胞移植后的第2、4和6周，处死动物并取出脾脏和淋巴结。
      2. 通过机械法解离制备单细胞悬液。使用ACK裂解缓冲液裂解红细胞，收集单个核细胞，并用冷PBS洗涤两次。
      3. 洗涤后，细胞将在4 °C用Fc阻断剂24G2封闭20分钟，封闭结束后将细胞分装，并在4 °C用不同荧光染料标记的抗体染色20分钟。
      4. 染色结束后，细胞需用冷PBS洗涤三次，然后上流式细胞仪。
   3. 肽段刺激 图3b.
      1. 在肿瘤攻击的第50天，将处死动物并取出脾脏和淋巴结。
      2. 通过机械法解离制备单细胞悬液。使用ACK裂解缓冲液裂解红细胞，收集单个核细胞，并用预冷的PBS洗涤两次。
      3. CD8⁺ 将使用美天旎生物技术公司的CD8分选试剂盒分离T细胞⁺ T细胞分离试剂盒。分离得到的CD8+ T细胞将与来自未致敏C57BL/6J小鼠的经照射处理的脾细胞按1:10的比例混合，并用0.5 μmol/ml OVA刺激_257-264 肽孵育40小时。随后，将布雷菲德菌素A加入培养物中继续培养4小时。
      4. 共培养结束时，按上述方法收集细胞，洗涤，并用Fc阻断剂封闭。
      5. 经封闭处理的细胞将使用荧光素偶联抗体对CD8和TCR Vβ5链等表面标志物进行染色。
      6. 细胞表面染色后，使用4% 甲醛固定细胞，并利用细胞通透化试剂盒进行通透处理。
      7. 透化处理后，将使用荧光染料偶联抗体对细胞内分子（如IL-2和IFN-γ）进行染色。
      8. 在最终进行流式细胞术检测之前，细胞需用预冷的PBS洗涤三次，以去除过量的抗体。
   4. 在体 杀伤实验 图3C.
      1. 从未经处理的 C57BL/6J 小鼠中分离脾细胞，并用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记作为靶细胞。
      2. 用 5 μmol/ml CFSE 标记的细胞（CFSE^你好 细胞将用 10 μg/ml OVA 进行脉冲处理_257-264 肽段与细胞用 0.5 μmol/ml CFSE（CFSE）标记^lo 细胞将不进行脉冲处理。
      3. 2.5×10 的混合物⁶ CFSE^你好 细胞加2.5×10⁶ CFSE^lo 细胞将通过静脉注射过继性转移至指定受体。
      4. 16小时后，将分离这些小鼠的脾细胞，并通过流式细胞术分析CFSE+细胞。
   5. 腹腔内肿瘤细胞计数 图4.
      在肿瘤攻击的第20天，处死小鼠并使用冷PBS冲洗腹腔。收集腹腔灌洗液中的肿瘤细胞并进行计数。
   6. 肿瘤浸润性T细胞鉴定 图5.
      1. 在肿瘤攻击实验的晚期阶段，将处死小鼠并从不同组别的腹腔中取出肿瘤组织。
      2. 肿瘤将被切成数块；其中一块立即放入冻存管并置于干冰上，另一块用甲醛固定，第三块则保存于条件化RPMI-1640培养基中以备后续使用。
      3. H&E染色将根据常规方案对甲醛固定和石蜡包埋的样本进行。
      4. 免疫荧光染色将在冷冻保存的样本上进行。
         1. 组织将在使用前切片并保存于 -20 °C。
         2. 组织切片将在室温下干燥15分钟，随后进行15分钟的冷丙酮固定。
         3. 固定后，切片需再室温干燥15分钟，然后用PBS洗涤5分钟。
         4. 洗涤后，将切片置于湿盒中，用30 μl含3% BSA的PBS覆盖组织切片，室温孵育30分钟以阻断非特异性结合。
         5. 封闭结束后，吸去封闭缓冲液，用50 μl PE标记的抗TCR Vα2抗体与FITC标记的抗OVA抗体混合液覆盖组织切片，该混合液用含3% BSA的PBS稀释。
         6. 在湿盒中孵育2小时，孵育结束后，用冷的PBS洗涤载玻片3次，然后用水溶性封片剂封片，再进行荧光显微镜观察。
      5. 肿瘤浸润性T细胞的流式细胞术分析
         1. 肿瘤将被研磨成单细胞悬液，并使用ACK裂解缓冲液裂解红细胞。
         2. 洗涤和封闭后，细胞将用不同荧光染料标记的抗体进行孵育，这些抗体可特异性识别细胞表面表达的 CD8、TCR Vα2 和 TCR Vβ5 分子。
   7. 小鼠存活率 图6.
      肿瘤攻击后，将密切监测小鼠的存活情况。

4. 代表性结果

CD3 和 TCRβ 用作 T 细胞的标志物。为了确定 Notch 配体 DL1 对 iPS 细胞的刺激是否能够促进 T 细胞分化，我们检测了 CD3 和 TCRβ 的表达情况⁺ 在iPS细胞来源的细胞上，进一步分析CD4和CD8的表达，以CD3为门控依据⁺ 和 TCRβ⁺ 群体。如图所示，在第22天，CD3⁺ TCRβ⁺ CD4^- CD8⁺ 由iPS细胞生成单阳性（SP）T细胞 体外此外，经刺激后，由iPS细胞衍生的SP细胞能够产生IL-2和IFN-γ。 体外 通过平板包被的抗CD3抗体和可溶性抗CD28抗体图 2)，表明iPS细胞分化的T细胞具有功能活性。

过继转移至受体小鼠后，大部分经TCR基因转导的iPS细胞分化为CD8⁺ 细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），其作出应答 体外 通过分泌 IL-2 和 IFN-γ 对肽刺激作出反应（图 3最重要的是，过继性移植TCR转导的iPS细胞可诱导OVA反应性CTL浸润至肿瘤组织，并保护动物免受肿瘤攻击（图 5-6因此，经TCR基因转导的iPS细胞可分化为具有功能的抗原特异性CTLs 体内.

图1. iPS细胞分化的形态学特征。在不同时间点，将小鼠iPS细胞与OP9-DL1细胞在α-MEM培养基中共同培养，培养基中添加20%胎牛血清（FCS）、2.2 g/L碳酸氢钠，并含有5 ng/ml mFlt3L和1 ng/ml mIL-7。

图 2. 由iPS细胞分化生成T细胞。小鼠iPS细胞与OP9-DL1细胞共培养，方法如图 1所述。第22天时，分离并分析由iPS细胞衍生的细胞。A) 在CD3⁺和TCRβ⁺群体设门后，分析CD4⁺ CD8^-或CD4^- CD8⁺细胞。B) 细胞在37 °C、5% CO₂条件下，使用包被抗CD3抗体和可溶性抗CD28抗体刺激5小时。在对活的CD4^- CD8⁺ T细胞设门后，通过胞内染色分析IL-2和IFN-γ的表达。

图3. 抗原特异性CD8⁺ 由iPS细胞分化T细胞 体内OT-I TCR基因转导的iPS细胞被注射 i.v. 到C57BL/6小鼠体内。六至十周后，检测OVA特异性CD8⁺ Vβ5⁺ T细胞发育情况被确定。A) CD8⁺ Vβ5⁺ 来自汇集的淋巴结和脾脏的T细胞在流式细胞术分析中经CD8设门后进行分析⁺ 群体。B）在圈选CD8后，通过细胞内细胞因子染色检测IL-2和IFN-γ的产生（深色线条；阴影区域表示同型对照）⁺ Vβ5⁺ 群体。C） 体内 增殖/细胞毒性检测。CFSE^你好 （右侧峰）和 CFSE^lo （左侧峰）靶细胞用OVA致敏_257-264 分别注射肽段和对照，并在iPS细胞转移后十周或OT-I CTL转移后一天注射到小鼠体内。

图 4. 过继转移表达OT-I TCR基因的诱导多能干细胞可抑制肿瘤生长。将表达OT-I TCR基因的诱导多能干细胞过继转移至C57BL/6小鼠体内。一组小鼠注射来自OT-I TCR转基因小鼠的OVA反应性CD8⁺ T细胞，另一组小鼠未进行细胞转移。在细胞转移后六周或次日，对小鼠进行E.G7肿瘤细胞攻击。在第20天，计数腹腔内的肿瘤细胞数量。

图5. iPS细胞来源的抗原特异性CTL浸润至肿瘤组织。在肿瘤攻击后的第30至35天，检测肿瘤组织中肿瘤反应性T细胞的浸润情况。A) H&E染色。炎症细胞浸润于肿瘤组织中（↓）。B) 免疫组织化学染色。OVA特异性Vα2⁺ CTL（红色）浸润至表达OVA的肿瘤组织（绿色）。C) 肿瘤组织制备的单细胞悬液经CD8⁺细胞群设门后，通过流式细胞术分析Vα2⁺和Vβ5⁺的表达情况。

图6. 过继转移经OT-I TCR基因转导的iPS细胞可维持小鼠存活。将经OVA TCR基因转导的iPS细胞过继转移至C57BL/6小鼠体内，并如图4所述用E. G7肿瘤细胞进行攻击。通过Kaplan-Meier生存曲线显示小鼠在第50天的存活情况（n=6）。

讨论

对于基于ACT的疗法， 体外 大量高活性抗原特异性T细胞的制备 体内 再次输注是一种最佳方法。尽管我们的 体外 该方法可由iPS细胞获得功能性T细胞，但大量iPS细胞来源的细胞在四周内死亡，尤其在第四周尤为显著。我们得出结论：由DL1介导的Notch信号通路以及IL-7和FLt3L提供的存活信号不足以维持iPS细胞来源的T细胞前体的存活，可能需要其他存活因子协同作用以调控这些细胞的成熟。TCR基因转导及 体外 使用Notch配体刺激可有效引导iPS细胞向T细胞分化，然而iPS细胞来源的抗原特异性T细胞仍无法长期存活，这阻碍了获得足够数量的iPS细胞来源抗原特异性T细胞用于基于过继性细胞转移（ACT）的免疫治疗。

T淋巴细胞在胸腺中的发育是一个高度有序的过程。那些不表达CD4和CD8的未成熟胸腺细胞被称为双阴性（DN）细胞。DN前体细胞根据CD44和CD25的表达情况进一步划分为不同的发育亚群：DN1（CD44⁺CD25^-）、DN2（CD44^...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6J 小鼠	杰克逊实验室	000664
B6.129S7-Rag1tm1Mom/J	杰克逊实验室	002216
抗 CD3 (2C11) 抗体	BD 生物科学	553058
抗 CD28 (37.51) 抗体	BD 生物科学	553295
抗 CD3 (17A2) 抗体	BioLegend	100202
抗 CD4 (GK1.5) 抗体	BioLegend	100417
抗 CD8 (53-6.7) 抗体	BioLegend	100714
抗 CD25 (3C7) 抗体	BioLegend	101912
抗 CD44 (1M7) 抗体	BioLegend	103012
抗 CD117 (2B8) 抗体	BioLegend	105812
抗 TCR-β (H57597) 抗体	BioLegend	109220
抗 IL-2 (JES6-5H4) 抗体	BioLegend	503810
抗 IFN-γ (XMG1.2) 抗体	BioLegend	505822
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
FBS	Hyclone	SH3007.01
布雷菲尔德菌素 A	Sigma-Aldrich	B7651
聚凝胺	Sigma-Aldrich	107689
GeneJammer	Integrated Sciences	204130
RNA 试剂盒	Qiagen	74104
DNA 试剂盒	Qiagen	69504
CD8 分离试剂盒	Miltenyi Biotec	130-095-236
ACK 裂解缓冲液	Lonza Inc.	10-548E
mFlt-3L	PeproTech Inc	250-31L
mIL-7	PeproTech Inc	217-17
明胶	Sigma-Aldrich	G9391
FITC-抗 OVA 抗体	Rockland Immunochemicals	200-4233
通透缓冲液	Biolegend	421002
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
甲醛	Sigma-Aldrich	F8775
0.4 μm 滤膜	EMD Millipore
Moflo 细胞分选仪	Dako
Calibur 流式细胞仪	BD Biosciences
LSR II 流式细胞仪	BD Biosciences
小鼠固定器	Braintree Scientific, Inc.