由诱导性多能干细胞（iPS细胞）生成T淋巴细胞，为T细胞免疫治疗提供了一种替代使用胚胎干细胞的新途径。该方法表明，通过利用以下任一方式 体外 或 体内 诱导系统能够使iPS细胞分化为常规T淋巴细胞和抗原特异性T淋巴细胞。
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摘要
摘要
过继性细胞转移（adoptive cell transfer, ACT）抗原特异性的CD8+ 细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）是治疗多种恶性肿瘤的有前景策略1。CTLs可通过T细胞受体（TCR）与肿瘤抗原相互作用来识别恶性细胞，并释放细胞毒素及细胞因子以杀伤恶性细胞。已知分化程度较低且具有中央记忆样表型（称为高反应性）的CTLs是基于ACT的免疫治疗中最理想的细胞群体，因为这类CTLs具有较强的增殖潜能，较已分化细胞更不易发生凋亡，并且对稳态细胞因子具有更强的响应能力2-7。然而，由于从患者体内获取大量此类CTLs存在困难，因此迫切需要开发一种新方法以生成高反应性的抗原特异性CTLs，从而实现ACT疗法的成功应用。
将T细胞受体转导至可自我更新的干细胞以实现免疫重建，在疾病治疗中具有治疗潜力 8-10然而，从患者体内获取胚胎干细胞（ESCs）的方法并不可行。尽管造血干细胞（HSCs）在临床治疗中的应用已十分广泛 11-13，造血干细胞的分化能力和增殖能力降低，且难以在体外扩增 体外 细胞培养 14-16. 近期iPS细胞技术的发展及一种 体外 无需任何外科手术即可从患者体内生成诱导多能干细胞的基因递送系统。此外，与胚胎干细胞类似，诱导多能干细胞具有无限增殖能力 体外，并已被证明可分化为造血细胞。因此，与胚胎干细胞（ESCs）或造血干细胞（HSCs）相比，诱导性多能干细胞（iPS细胞）在基于细胞疗法的免疫治疗中具有更大的应用潜力。
本文介绍了由诱导性多能干细胞（iPS细胞）生成T淋巴细胞的方法 体外，和 体内 由iPS细胞编程抗原特异性CTL以促进癌症免疫监视。刺激 体外 使用Notch配体可诱导iPS细胞向T细胞分化，而TCR基因转导可使iPS细胞分化为抗原特异性T细胞 体内，从而抑制肿瘤生长。因此，我们展示了由iPS细胞分化为抗原特异性T细胞的过程。本研究为生成用于过继性细胞治疗（ACT）的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）提供了一种潜在更高效的方法，并有助于推动针对各类疾病的治疗策略的开发。
方案
1. 细胞培养
- 用于培养的辐照SNL76/7细胞（irSNL76/7）饲养层细胞的制备
SNL76/7 细胞通常在含 10% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养。- 培养皿或培养瓶将用0.1%明胶溶液包被 37 °C在从液氮中复苏SNL76/7细胞前，先将细胞置于培养箱中孵育30分钟。
- 当 SNL76/7 细胞达到汇合状态时，用胰蛋白酶消化细胞，400 g 离心 5 分钟，弃上清，重悬于新鲜培养基中。
- 重悬的SNL76/7细胞将在以下条件下进行辐照： 60Co 源辐照器，剂量为 5000 Rads。
替代方法，SNL76/7 细胞可用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）替代，且可用丝裂霉素失活替代辐照。 - 辐照后，细胞以400 g离心5分钟，重悬于含10%二甲基亚砜（DMSO）的FBS冻存缓冲液中，分装至冻存管，于液氮中保存以备后续使用。
- OP9-DL1 细胞的制备 体外 分化
OP9-DL1 细胞通常在含 20% 胎牛血清的 α-最小必需培养基（α-MEM）中培养。当细胞达到汇合时，按 1:5 比例传代。 - E.G7胸腺瘤细胞的制备
E.G7 胸腺瘤细胞通常在含10%胎牛血清的罗斯韦尔帕克纪念研究所培养基（RPMI-1640）中培养。当细....
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讨论
对于基于ACT的疗法， 体外 大量高活性抗原特异性T细胞的制备 体内 再次输注是一种最佳方法。尽管我们的 体外 该方法可由iPS细胞获得功能性T细胞，但大量iPS细胞来源的细胞在四周内死亡，尤其在第四周尤为显著。我们得出结论：由DL1介导的Notch信号通路以及IL-7和FLt3L提供的存活信号不足以维持iPS细胞来源的T细胞前体的存活，可能需要其他存活因子协同作用以调控这些细胞的成熟。TCR基因转导及 体外 使用Notch配体刺激可有效引导iPS细胞向T细胞分化，然而iPS细胞来源的抗原特异性T细胞仍无法长期存活，这阻碍了获得足够数量的iPS细胞来源抗原特异性T细胞用于基于过继性细胞转移（ACT）的免疫治疗。
T淋巴细胞在胸腺中的发育是一个高度有序的过程。那些不表达CD4和CD8的未成熟胸腺细胞被称为双阴性（DN）细胞。DN前体细胞根据CD44和CD25的表达情况进一步划分为不同的发育亚群：DN1（CD44+CD25-）、DN2（CD44.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢京都大学的 Shinya Yamanaka 博士提供 iPS-MEF-Ng-20D-17 细胞系，圣裘德儿童研究医院的 Dario Vignali 博士支持提供 OT1-2A•pMig II 载体，多伦多大学免疫学系的 Juan Carlos Zuniga-Pflucker 博士支持提供 OP9-DL1 细胞系，以及宾夕法尼亚州立大学医学院药理学系的 Kent E Vrana 博士在本研究设计方面提供的帮助。本项目获得美国国家癌症研究所（资助号：K18CA151798）、Barsumian 信托基金和黑色素瘤研究基金会（J. Song）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C57BL/6J 小鼠 | 杰克逊实验室 | 000664 | |
| B6.129S7-Rag1tm1Mom/J | 杰克逊实验室 | 002216 | |
| 抗 CD3 (2C11) 抗体 | BD 生物科学 | 553058 | |
| 抗 CD28 (37.51) 抗体 | BD 生物科学 | 553295 | |
| 抗 CD3 (17A2) 抗体 | BioLegend | 100202 | |
| 抗 CD4 (GK1.5) 抗体 | BioLegend | 100417 | |
| 抗 CD8 (53-6.7) 抗体 | BioLegend | 100714 | |
| 抗 CD25 (3C7) 抗体 | BioLegend | 101912 | |
| 抗 CD44 (1M7) 抗体 | BioLegend | 103012 | |
| 抗 CD117 (2B8) 抗体 | BioLegend | 105812 | |
| 抗 TCR-β (H57597) 抗体 | BioLegend | 109220 | |
| 抗 IL-2 (JES6-5H4) 抗体 | BioLegend | 503810 | |
| 抗 IFN-γ (XMG1.2) 抗体 | BioLegend | 505822 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| 布雷菲尔德菌素 A | Sigma-Aldrich | B7651 | |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | 107689 | |
| GeneJammer | Integrated Sciences | 204130 | |
| RNA 试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| DNA 试剂盒 | Qiagen | 69504 | |
| CD8 分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | |
| ACK 裂解缓冲液 | Lonza Inc. | 10-548E | |
| mFlt-3L | PeproTech Inc | 250-31L | |
| mIL-7 | PeproTech Inc | 217-17 | |
| 明胶 | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| FITC-抗 OVA 抗体 | Rockland Immunochemicals | 200-4233 | |
| 通透缓冲液 | Biolegend | 421002 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 甲醛 | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 0.4 μm 滤膜 | EMD Millipore | ||
| Moflo 细胞分选仪 | Dako | ||
| Calibur 流式细胞仪 | BD Biosciences | ||
| LSR II 流式细胞仪 | BD Biosciences | ||
| 小鼠固定器 | Braintree Scientific, Inc. |
参考文献
- Brenner, M. K., Heslop, H. E. Adoptive T cell therapy of cancer. Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).
- Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
- Se....
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重印与许可
