Oct4GiP 报告基因检测法用于研究调控小鼠胚胎干细胞维持与自我更新的基因

摘要

我们描述了一种荧光报告基因检测方法，可用于快速鉴定和表征调控小鼠胚胎干细胞维持与自我更新的基因。

摘要

多能性和自我更新是胚胎干细胞（ES细胞）的两个定义性特征。了解其潜在的分子机制将极大促进ES细胞在发育生物学研究、疾病建模、药物发现和再生医学中的应用（详见文献^1,2）。

为了加快鉴定和表征胚胎干细胞（ES细胞）维持与自我更新的新调控因子，我们开发了一种基于荧光报告基因的检测方法，利用Oct4GiP细胞定量测定小鼠ES细胞的自我更新状态³。Oct4GiP细胞在Oct4基因启动子区域的调控下表达绿色荧光蛋白（GFP）^4,5。Oct4是ES细胞自我更新所必需的基因，在ES细胞中高表达，并在分化过程中迅速下调^6,7。因此，报告细胞中的GFP表达和荧光信号能够真实反映ES细胞的身份特征⁵，并通过荧光激活细胞分选（FACS）分析在单细胞水平上密切监测细胞的自我更新状态^3,8。

结合RNAi技术，Oct4GiP报告基因检测可用于快速鉴定和研究胚胎干细胞维持与自我更新的调控因子^3,8。与其他检测自我更新能力的方法相比，该方法更便捷、灵敏、定量性好，且成本较低。该检测可在96孔或384孔板中进行，适用于大规模研究，如高通量筛选或遗传上位性分析。最后，通过使用其他谱系特异性的报告基因胚胎干细胞系，本文所述的检测方法也可被改造用于研究胚胎干细胞分化过程中的命运决定。

方案

1. Oct4GiP 小鼠胚胎干细胞的维持

Oct4GiP 细胞由 Austin Smith 博士惠赠。该细胞系来源于携带 Oct4-GFPiresPac 转基因的 129/Ola 小鼠^4,5。细胞培养于明胶包被的组织培养皿中，使用 ESGRO complete plus clonal grade 培养基（Millipore）或 M15 培养基：DMEM（Invitrogen）添加 15% FBS、1000 U/ml ESGRO（Millipore）、1x 非必需氨基酸（Invitrogen）、1x EmbryoMax Nucleasides（Millipore）以及 10 μM β-巯基乙醇。

1. 在室温下用 0.1% 明胶（Sigma）包被培养板 30 分钟（每 cm² 加入 0.1 ml 明胶溶液）。
2. 将 Oct4GiP 细胞接种至明胶包被的培养板中，密度约为 2 × 10⁴/cm²。
3. 每两天用 0.05% 胰蛋白酶消化传代一次细胞。

2. Oct4GiP 细胞中的 siRNA 转染

Oct4GiP 报告基因检测最适宜在经明胶包被的平底96孔或384孔板（Corning 或 BD）中的 M15 培养基内进....

讨论

我们上述描述的 Oct4GiP 报告基因检测法可定量测量自我更新与分化程度。与其他现有方法（如基于形态学¹²或基于增殖/活力的检测法）相比，该方法具有更高的灵敏度和通量，并能更直接地检测胚胎干细胞状态，因此非常适用于大规模筛选和遗传上位性分析。事实上，我们及其他研究者已成功将 Oct4GiP 报告基因检测法用于全基因组范围的 RNA 干扰筛选^3,8。然而，与其他所有检测方法一样，该方法也存在局限性。它仅可用于研究直接或间接调控 Oct4 启动子活性的基因，且可能错误地鉴定出在转录后水平影响 GFP 表达、稳定性或功能的基因。因此，需通过其他辅助检测或二次筛选方法（如碱性磷酸酶染色¹³（Millipore, SCR004）以及多能性标志物的免疫荧光染色或定量 RT-PCR^3,8,12,14）来验证本方法所得结果。

Oct4GiP 报告基因检测依赖于高效的基因沉默。有效的 siRNA 及高效的 siRNA 转染是该检测成功的关键。尽管我们仅描述了报告基因检测与 siRNA 转染联用的方法，但该检测.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ESGRO Complete Plus 克隆级培养基	EMD Millipore	SF001-500P
DMEM（高糖1X）	Invitrogen	11965
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200
Lipofectamine 2000	Invitrogen	1001817
OPTI-MEM（减血清培养基）	Invitrogen	31985
ESGRO mLIF (107 单位/1毫升	EMD Millipore	DAM1776540
MEM 非必需氨基酸（Non-Essential Amino Acids）	Invitrogen	11140
100倍浓缩核苷用于ES细胞	EMD Millipore	10620-1
2-巯基–乙醇	Sigma-Aldrich	M7522-100ml
经胚胎干细胞验证的胎牛血清	Invitrogen	10437
Nanog siRNA	Invitrogen	MSS231181
Oct4 siRNA	Dharmacon	D-046256-02
Sox2 siRNA	Dharmacon	M-058489-01
对照siRNA：靶向萤火虫荧光素酶的siRNA双链（5’-CGTACGCGGAATACTTCGA）由Dharamcon公司合成。