我们描述了一种荧光报告基因检测方法，可用于快速鉴定和表征调控小鼠胚胎干细胞维持与自我更新的基因。
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摘要
摘要
多能性和自我更新是胚胎干细胞（ES细胞）的两个定义性特征。了解其潜在的分子机制将极大促进ES细胞在发育生物学研究、疾病建模、药物发现和再生医学中的应用（详见文献1,2）。
为了加快鉴定和表征胚胎干细胞（ES细胞）维持与自我更新的新调控因子，我们开发了一种基于荧光报告基因的检测方法，利用Oct4GiP细胞定量测定小鼠ES细胞的自我更新状态3。Oct4GiP细胞在Oct4基因启动子区域的调控下表达绿色荧光蛋白（GFP）4,5。Oct4是ES细胞自我更新所必需的基因，在ES细胞中高表达，并在分化过程中迅速下调6,7。因此，报告细胞中的GFP表达和荧光信号能够真实反映ES细胞的身份特征5，并通过荧光激活细胞分选（FACS）分析在单细胞水平上密切监测细胞的自我更新状态3,8。
结合RNAi技术，Oct4GiP报告基因检测可用于快速鉴定和研究胚胎干细胞维持与自我更新的调控因子3,8。与其他检测自我更新能力的方法相比，该方法更便捷、灵敏、定量性好，且成本较低。该检测可在96孔或384孔板中进行，适用于大规模研究，如高通量筛选或遗传上位性分析。最后，通过使用其他谱系特异性的报告基因胚胎干细胞系，本文所述的检测方法也可被改造用于研究胚胎干细胞分化过程中的命运决定。
方案
1. Oct4GiP 小鼠胚胎干细胞的维持
Oct4GiP 细胞由 Austin Smith 博士惠赠。该细胞系来源于携带 Oct4-GFPiresPac 转基因的 129/Ola 小鼠4,5。细胞培养于明胶包被的组织培养皿中，使用 ESGRO complete plus clonal grade 培养基（Millipore）或 M15 培养基：DMEM（Invitrogen）添加 15% FBS、1000 U/ml ESGRO（Millipore）、1x 非必需氨基酸（Invitrogen）、1x EmbryoMax Nucleasides（Millipore）以及 10 μM β-巯基乙醇。
- 在室温下用 0.1% 明胶（Sigma）包被培养板 30 分钟（每 cm2 加入 0.1 ml 明胶溶液）。
- 将 Oct4GiP 细胞接种至明胶包被的培养板中，密度约为 2 × 104/cm2。
- 每两天用 0.05% 胰蛋白酶消化传代一次细胞。
2. Oct4GiP 细胞中的 siRNA 转染
Oct4GiP 报告基因检测最适宜在经明胶包被的平底96孔或384孔板（Corning 或 BD）中的 M15 培养基内进行。整体操作流程如图1所示。
- siRNA-脂质复合物的制备：
- 对于96孔板中的转染，在U型底96孔板中制备siRNA-脂质复合物。
- 在每个孔中，加入10 μl OptiMEM（Invitrogen）和0.3 μl Lipofectamine 2000（Invitrogen），室温孵育5分钟。
- 向脂质-OptiMEM混合物中加入5 pmol siRNA，再孵育15分钟。siRNA与脂质的比例为100 pmol : 6 μl。
- 使用多通道移液器将U型底板中的siRNA-脂质复合物转移至明胶包被的平底板中。
- 对于384孔板中的转染，使用10 μl OptiMEM、0.1 μl Lipofectamine 2000和2 pmol siRNA制备siRNA-脂质复合物。
注意：转染中siRNA的终浓度为50 nM。每种siRNA转染需进行3-4次生物学重复。在U型底培养板中配制siRNA-脂质复合物的主混合液，并分装至平底明胶包被的培养板中。
- Oct4GiP 细胞铺板与转染：
- 对于 96 孔板中的转染，收集 Oct4GiP 细胞并将其重悬于新鲜 M15 培养基中，调整细胞密度至 9 x 104 个细胞/ml。
- 使用多通道移液器向每孔加入 100 μl 细胞悬液。
- 通过上下吹打 3–5 次，将孔中预分装的 siRNA-脂质复合物与细胞悬液混合均匀。不同 siRNA 转染时需更换移液器吸头。
- 对于 384 孔板中的转染，将 Oct4GiP 细胞重悬至 6 x 104 个细胞/ml，并向每孔分装 30 μl 细胞悬液。
注意：最佳细胞接种密度通常为 3 × 105 个细胞/cm2，但对于显著影响细胞生长或活力的 siRNA，可能需要进一步优化。接种密度过低会导致转染期间细胞存活率差；接种密度过高则会因细胞汇合度过高引发分化，从而导致背景信号升高。如有必要，可在 2–4 × 105 个细胞/cm2 范围内测试接种密度。
- 更换培养基：
- 使用多通道吸液器（Corning）或真空吸头（VP-Scientific）移除旧培养基。注意不要刮伤培养板底部的细胞。
- 每天使用多通道移液器向细胞中加入新鲜的胚胎干细胞培养基（96孔板每孔100 μl，384孔板每孔30 μl）。
3. FACS 分析
- 细胞解离：
- 转染后第四天，使用多通道吸液器（Corning）或真空吸头（VP-Scientific）移除培养基。
- 对于96孔板，用100 μl PBS洗涤细胞一次。
- 使用多通道移液器向每孔加入25 μl 0.25%胰蛋白酶。
- 室温孵育5分钟，期间轻轻振荡，观察以确保细胞完全脱落。
- 加入90 μl含10% FBS的PBS以终止胰蛋白酶反应，并通过反复吹打使细胞解离成单细胞悬液。
- 对于384孔板，使用10 μl胰蛋白酶解离细胞，并用30 μl含10% FBS的PBS终止反应。
- FACS分析：
- 使用配备高通量筛选（HTS）装置的BD LSRII FACS分析仪或其他类似配置的FACS分析仪（如Accuri或Intellicyt）检测GFP荧光。
- 在HTS上启用高通量模式，分析10 μl细胞悬液。将计数阈值设定为1.0 × 104个细胞。
- 调节PMT电压和阈值，使细胞在前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）图中清晰可见。在FSC与SSC散点图中圈选活细胞群体。
- 建立GFP通道的直方图。在GFP通道中设置门控，使空白对照组或对照siRNA转染组中约有10%的细胞显示为GFP阴性。
- 计算各处理组中GFP阴性细胞的百分比：分化细胞百分比 = GFP阴性细胞百分比。使用双尾t检验比较实验组与对照组siRNA转染后的分化细胞百分比，将p值 < 0.01的结果判定为阳性结果。
4. 代表性结果
Oct4、Nanog 和 Sox2 是三个在维持胚胎干细胞自我更新中起关键作用的基因6,7,9-11。图2显示，Oct4GiP 报告基因检测能够轻松检测到在 Oct4GiP 胚胎干细胞中沉默这些因子所引起的分化。
图2A 显示Oct4GiP ES细胞在维持为ES细胞状态时呈GFP阳性。图2B 显示转染了对照siRNA或Oct4-siRNA的Oct4GiP细胞的前向散射与侧向散射图以及GFP通道的直方图。在前向散射与侧向散射图中必须对活细胞进行设门，因为死细胞和碎片呈GFP阴性，会增加背景信号。另一方面，双联体 discrimination 以排除可能的细胞团块并非总是必需的。在转染对照siRNA的细胞中，绝大多数细胞应为GFP阳性。如果在转染对照siRNA的孔中出现明显的GFP阴性细胞群，则起始的Oct4GiP细胞或转染操作可能已受到影响，导致结果无法解读。
图2C显示了对照组、Oct4、Nanog和Sox2 siRNA转染细胞中分化细胞百分比（%分化细胞 = GFP阴性细胞百分比）的柱状图。
图1. Oct4GiP 报告基因检测流程示意图。
图2. Oct4GiP报告基因检测可检测由Nanog、Oct4或Sox2沉默引起的胚胎干细胞分化。A) 通过FACS分析E14Tg2a（野生型，黑线）和Oct4GiP（绿线）细胞。GFP通道的直方图显示Oct4GiP细胞为GFP阳性。B) 在96孔板中将Oct4GiP细胞转染对照siRNA或Oct4-siRNA，并在转染后4天进行FACS分析。图中显示了转染细胞的前向散射与侧向散射图以及GFP通道的直方图。C) Oct4GiP细胞分别转染对照、Nanog、Oct4或Sox2的siRNA。转染后4天，根据GFP阴性细胞的百分比确定分化细胞百分比，并以均值±标准误差（n = 4）表示。 点击此处查看大图。
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讨论
我们上述描述的 Oct4GiP 报告基因检测法可定量测量自我更新与分化程度。与其他现有方法（如基于形态学12或基于增殖/活力的检测法）相比，该方法具有更高的灵敏度和通量，并能更直接地检测胚胎干细胞状态，因此非常适用于大规模筛选和遗传上位性分析。事实上，我们及其他研究者已成功将 Oct4GiP 报告基因检测法用于全基因组范围的 RNA 干扰筛选3,8。然而，与其他所有检测方法一样，该方法也存在局限性。它仅可用于研究直接或间接调控 Oct4 启动子活性的基因，且可能错误地鉴定出在转录后水平影响 GFP 表达、稳定性或功能的基因。因此，需通过其他辅助检测或二次筛选方法（如碱性磷酸酶染色13（Millipore, SCR004）以及多能性标志物的免疫荧光染色或定量 RT-PCR3,8,12,14）来验证本方法所得结果。
Oct4GiP 报告基因检测依赖于高效的基因沉默。有效的 siRNA 及高效的 siRNA 转染是该检测成功的关键。尽管我们仅描述了报告基因检测与 siRNA 转染联用的方法，但该检测...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢 Brad Lackford 对手稿的阅读和编辑。本研究由美国国立环境卫生科学研究所、美国国立卫生研究院院内研究计划 Z01ES102745（资助编号：G. H.）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ESGRO Complete Plus 克隆级培养基 | EMD Millipore | SF001-500P | |
| DMEM（高糖1X） | Invitrogen | 11965 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM（减血清培养基） | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO mLIF (107 单位/1毫升 | EMD Millipore | DAM1776540 | |
| MEM 非必需氨基酸（Non-Essential Amino Acids） | Invitrogen | 11140 | |
| 100倍浓缩核苷用于ES细胞 | EMD Millipore | 10620-1 | |
| 2-巯基–乙醇 | Sigma-Aldrich | M7522-100ml | |
| 经胚胎干细胞验证的胎牛血清 | Invitrogen | 10437 | |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 | |
| 对照siRNA：靶向萤火虫荧光素酶的siRNA双链（5’-CGTACGCGGAATACTTCGA）由Dharamcon公司合成。 |
参考文献
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