肝微循环中血流与氧耗的可视化与分析：在急性肝炎模型中的应用

摘要

开发了一种光学系统，用于通过FITC标记的红细胞观察肝脏微循环，并利用激光辅助磷光测定法测量微血管中的氧分压。该方法可通过分析微血管结构、管径、血流速度和氧张力，研究生理和病理机制。

摘要

肝脏中氧供应与需求之间存在显著差异，因为肝脏的氧消耗量相对较高，但约70%的肝血供来自胃肠道和脾脏的低氧门静脉血。氧气通过血液从门静脉终末分支经由肝窦流向中央静脉，从而在肝小叶内形成氧梯度。该氧梯度是一个重要的物理参数，影响肝微循环中上下游酶的表达，但由于缺乏在肝微循环中测量氧消耗的技术，肝脏氧代谢相关机制的研究一直受到阻碍。因此，我们采用荧光素异硫氰酸（FITC）标记的红细胞来可视化肝微循环，并利用激光辅助磷光法测量微血管中的氧分压。这种非接触式、连续的光学测量方法可定量分析血流速度、血管直径以及与肝脏氧消耗相关的氧梯度。在通过给予小鼠对乙酰氨基酚建立的急性肝炎模型中，我们观察到门静脉和中央静脉中的氧分压均升高，但肝窦内的氧梯度降低，表明肝细胞在终末肝静脉周围区域的坏死可能使氧分压上升，并影响门静脉周围区域的酶表达。综上所述，我们用于测量肝血流动力学和氧消耗的光学方法能够揭示与肝病相关的机制。

方案

1. 使用异硫氰酸荧光素异构体 I（FITC）标记红细胞

我们使用的所有实验方案均经庆应义塾大学医学院动物护理委员会批准。

1. 麻醉供体小鼠，做腹部切口后，用含有少量肝素的1 ml注射器从下腔静脉采集全血。随后通过腹腔注射戊巴比妥钠（100 mg/kg）立即处死小鼠。
2. 将全血用PBS（pH 7.4）洗涤两次，每次在摆动桶转子中以400 g 离心5分钟。
3. 将10 mg FITC溶解于5 ml 100 mM Na₂HPO₄溶液中，并使用孔径为0.22 μm的滤膜过滤。
4. 在试管中混合1 ml FITC溶液、0.15 ml 3 mM葡萄糖、0.25 ml 180 mM NaH₂PO₄和1.5 ml 100 mM Na₂HPO₄。加入0.2 ml红细胞沉淀，轻敲试管混匀。
5. 将试管置于4 °C孵育2小时，然后用PBS洗涤标记的红细胞两次。
6. 取少量红细胞悬液滴于载玻片上，观察红细胞是否形态正常、大小均匀，且荧光强度是否足够。
7. 将0.1 ml红细胞重悬于0.9 ml pH 7.4的PBS中，4 °C保存直至注射使用。

2. 氧敏感染料的制备

1. 将500 mg BSA溶解于10 ml pH 7.4的PBS中。
2. 向BSA溶液中加入30 mg Pd(II)-meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine (Pd-TCPP)，搅拌过夜。
3. （可选）使用重力流层析或离心柱分离与BSA结合的Pd-TCPP，以去除游离的Pd-TCPP。
4. 离心溶液以去除未溶解的Pd-TCPP，并用孔径为0.22-μm的膜滤器过滤上清液。
5. 将1 ml分装样品储存于-20 °C的离心管中。避免反复冻融。

3. 动物准备

1. 为进行微循环的显微观察，准备一个带有直径为 20 mm 圆孔的塑料板，并用胶带将一块 30 mm 见方的盖玻片固定在圆孔上。
2. 麻醉小鼠，去除毛发并消毒皮肤。使用连接有 10 cm 聚乙烯管（PE 10，内含肝素化 PBS）的 30 G 针头插入尾静脉，留置导管以用于药物注射。
3. 行正中切口后，将肝脏的一个主要叶展平置于塑料板上，并将小鼠保持于仰卧位。
4. 用厨房用纸制成小条（3 mm × 8 mm），沿肝叶边缘呈斜向放置，以限制肝脏随呼吸移动并防止其干燥。
5. 在显微镜下（使用透射光）观察肝微循环，并确认在至少 15 分钟内视野中血流无淤滞现象。
6. 缓慢注入 0.2 ml 荧光标记的红细胞用于血流观察，或注入 0.2 ml Pd-TCPP 溶液用于 pO₂ 测定。此剂量的 FITC 标记红细胞约占观察区域内循环红细胞总量的 1/50。

4. 血流可视化

1. 使用通过带通滤光片（450–490 nm）的汞灯照射激发 FITC¹。
2. 用 CCD 相机记录荧光图像。

5. 氧分压（pO₂）测量

Pd-TCPP 的磷光相对较弱，应使用高灵敏度检测器进行检测。所有实验均需在暗室中进行。

1. Pd-TCPP 的吸收峰位于 410 nm 和 532 nm，因此推荐使用倍频波长 532 nm 进行激发。该波长可通过 Nd:YAG 脉冲激光器²产生。
2. 将 Nd:YAG 激光器的光束导入倒置显微镜的相应端口，并调节光斑至焦平面中心位置。空间分辨率取决于激光光斑尺寸，可通过使光束穿过小孔来调节光斑大小。
3. 为检测磷光信号，将长通滤光片（>620 nm）和光电倍增管（PMT）连接至显微镜的另一端口。PMT 应对红光波长敏感，特别是在 700 nm 附近。
4. 采样磷光信号（以 200 kHz 采样 500 个点），并通过将指数函数拟合至衰减曲线来计算衰减的时间常数。
5. 为进行校准，准备两组 Pd-TCPP 溶液样品，其 pO₂ 分别为 150 mmHg 和 0 mmHg。向样品中加入体积比为 1% 的连二亚硫酸钠以实现无氧环境。校准期间保持样品 pH 为 7.4，温度为 37 °C。
6. 在公式 (1)³ 中固定 Stern-Volmer 常数 k_q 和无氧条件下的发光衰减时间 τ₀。在本例中，Pd-TCPP 溶液在 37 °C 和 pH 7.4 条件下，k_q 为 374 mmHg^-1 s^-1，τ₀ 为 0.74 ms。这些测量参数依赖于设备（如激光器、探测器、其他光学器件）及信号处理方法，因此每个测量系统均需进行校准⁴。
   τ₀/τ = 1 + k_q • τ₀ • pO₂     (1)
7. 将小鼠置于显微镜载物台的样品板上，观察肝脏微循环，并调节目标微血管的位置至激光光斑焦点处。

6. 肝炎模型

1. 实验前一晚对小鼠实施禁食，但可自由饮水。
2. 用DMSO配制浓度为20 mg/ml的对乙酰氨基酚（APAP）溶液。
3. 按1 ml/100 g体重（即200 mg/kg体重）剂量进行腹腔注射。注射后，小鼠可自由摄食和饮水⁵。
4. 注射后24小时，麻醉小鼠并作腹中线切口暴露肝脏。若肝炎模型成功建立，肝小叶中央区的坏死灶将肉眼可见。

7. 代表性结果

肝微循环的示例图像如图1所示，其中（a）为透射光图像，（b）为荧光图像。在视频录像中可观察到单个FITC标记的红细胞，并通过血流方向识别门静脉小静脉、窦状隙和中央静脉。

如图2所示，通过100倍物镜照射到中央小静脉的激光光斑直径约为10 μm。在雄性C57BL/6小鼠中测量了肝脏微循环中的血管内pO₂，图3(a)显示了门静脉小静脉和中央小静脉中pO₂与血管直径之间的关系。从门静脉小静脉到中央小静脉的pO₂梯度表明，红细胞在通过窦状隙时能有效释放氧气。如图3(b)所示，门静脉血管中的平均pO₂为59.8 mmHg，窦状隙中为48.2 mmHg，中央小静脉中为38.9 mmHg。

通过腹腔注射APAP诱导急性肝炎时，肝微循环各部位的血管内pO₂均显著升高：门静脉中p<0.05，窦状隙和中央静脉中p<0.01（图3(c)）。

图1. 低倍显微图像，显示肝脏微循环：(a) 透射光，(b) 荧光。

图 2. 激光光斑照射目标中央微静脉以进行 pO₂ 测量的图像。

图 3. 健康对照小鼠及对乙酰氨基酚（APAP）诱导肝损伤小鼠肝微循环中的 pO₂ 梯度。（a）显示门静脉小静脉（PV）和中央静脉小静脉（CV）的 pO₂ 与血管直径的关系，（b）显示通过窦状隙（S）从 PV 到 CV 的氧梯度。PV 与 CV 之间的 pO₂ 差值反映了肝细胞或其他实质细胞的耗氧量。（c）显示在 APAP 给药诱导的肝炎条件下，PV、S 和 CV 中的 pO₂ 显著升高，且 pO₂ 梯度降低，表明肝脏耗氧功能受损。

讨论

向组织输送氧气是微循环的一项基本功能，大量论文描述了与微血管解剖结构和流变学相关的疾病⁶。肝脏的血流由动脉血和静脉血共同组成。其中约30%的肝脏血流来自富含氧气的肝动脉，其余70%则来自门静脉，后者携带来自脾脏和胃肠道的低氧静脉血⁷。脂肪肝、休克或肿瘤等肝脏疾病会改变肝微循环中的血流。要确定组织的氧合状态，需要同时测量微循环中的血流量和氧浓度。由于目前尚无 commercially available 仪器可用于肝微循环中的这些测量，导致该领域的生理学数据难以获取。

动物准备步骤中的一个关键点是将肝脏固定在塑料板上。固定不牢会导致肝脏随呼吸运动而移动，从而干扰显微观察并使分析变得困难。然而，过度紧的固定又会引起血流停滞。在手术过程中应通过低倍显微镜观察血流状况。高功率激光容易损伤微血管，因此应尽量减少照射频率。通常情况下，1 Hz 的频率已足以满足时间测量需求⁸。然而，单次 pO₂ 测量耗时不到 1 毫秒，这意味着在需要快速检测 pO₂ 变化时，重复频率可提高至 1 kHz...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
四(4-羧基苯基)卟啉钯(II)	Frontier Scientific, Inc.	PdT790
异硫氰酸荧光素异构体 I	Sigma-Aldrich Co.	F7250
对乙酰氨基酚	Sigma-Aldrich Co.	A7085
仪器
光电倍增管	hamamatsu photonics k.k	H10722-20