α-测试：利用全唾液进行快速无细胞CD4计数

摘要

本文介绍了一种使用全唾液进行快速且准确CD4计数的CD4计数方法——α-test。该α-test成本低廉，无需专业技术培训，也无需单克隆抗体等昂贵试剂、仪器设备、冷藏条件、样本运输，以及血液的采集和处理。

摘要

目前迫切需要一种经济实惠的CD4计数方法来监测艾滋病病情。由于时间和温度限制、技术复杂性以及试剂成本（特别是用于检测血细胞CD4的单克隆抗体），目前唯一可接受的CD4检测方法在资源有限地区难以实现。一种常见的节省成本和时间的实验室策略是通过计算而非直接测量某些血液指标。例如，低密度脂蛋白（LDL）水平是通过总胆固醇、高密度脂蛋白（HDL）和甘油三酯的实测值计算得出的¹。因此，若能鉴定出直接调控CD4⁺ T细胞数量的无细胞因子相关物，将可能提供一种准确计算CD4计数的方法，因为这些相关物具有生理学相关性。

进入血液并 destined to become 循环 CD4 的干细胞数量⁺ T细胞的定位由趋化因子CXCL12及其受体CXCR4决定，因其对细胞运动具有调控作用²干细胞向血液中迁移的过程还受到细胞表面人白细胞弹性蛋白酶（HLE）的调控。_CS）以及 HLE_CS-反应性活性 α₁蛋白酶抑制剂（α₁PI，α₁抗胰蛋白酶，SerpinA1³在HIV-1疾病中，α₁PI 因疾病过程而失活 ⁴在HIV-1感染的早期无症状阶段，活跃的α₁PI 在 100% 未经治疗的 HIV-1 患者中均低于正常水平（中位数 = 12 μM），且在有症状阶段仍未能恢复至正常水平^{4, 5}这种模式归因于免疫失活，而非合成不足、蛋白水解失活或氧化作用。我们观察到，在HIV-1感染者中 >220 个 CD4 细胞/μl，CD4 计数与血清中活性 α 水平相关₁PI (r²=0.93，p<0.0001，n=26）和非活性α₁PI (r²=0.91，p<0.0001，n=26 ⁵α的给药₁PI治疗HIV-1感染者与未感染者导致CD4计数显著升高，提示α₁PI 参与调控 CD4 的数量⁺ 血液中的T细胞 ³.

在刺激条件下，全唾液中含有足够的血清渗出物（即含有蛋白质成分、通过血管壁进入唾液的血浆），从而可以测定有活性的α₁PI，并且该测定值的相关性表明这是一种准确计算CD4细胞计数的可靠方法。简而言之，通过使用口香糖或柠檬酸等促唾剂刺激，可促使血清渗出至全口唾液中。在诱导血清渗出后，通过检测血清α₁PI抑制弹性蛋白酶活性的能力来测定其在唾液中的活性。猪胰弹性蛋白酶（PPE）是一种易得且成本低廉的弹性蛋白酶来源。PPE可与α₁PI结合形成一对一的复合物，从而阻止PPE切割其特异性底物之一——比色肽类底物琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-对硝基苯胺（SA³NA）。将唾液与饱和浓度的PPE在室温下孵育10分钟，可使PPE与唾液中所有有活性的α₁PI充分结合。随后通过加入PPE底物SA³NA，即可测定活性α₁PI对PPE的抑制程度。（图1）。尽管CD4计数是以血液体积为单位（CD4细胞/μl）进行测量的，但唾液中α₁PI的浓度与唾液中血清的浓度相关，而非与唾液体积相关，因为唾液体积在一天内以及个体之间可能存在显著差异⁶。然而，唾液中几乎所有的蛋白质均来源于血清，且唾液蛋白质含量是可测量的⁷。因此，唾液中活性α₁PI以相对于唾液总蛋白含量的比值形式计算，称为α₁PI指数。本文展示的结果表明，α₁PI指数是一种准确且精确的生理学方法，可用于推算CD4细胞计数。

方案

1. 准备新鲜工作液

1. TBS： 0.05 M Tris 缓冲盐水，pH 7.8（TBS）。每块微孔板准备 60 ml TBS。
2. 个人防护装备： 1型猪胰弹性蛋白酶（PPE）以混悬液形式提供。充分振荡混匀后，用TBS将PPE稀释至约0.01 U/ml。每微孔板准备6 ml工作液。
3. SA³NA： 琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酸对硝基苯胺（SA³NA）。配制 0.1 M 的 SA 储存液³NA溶液置于二甲基亚砜（DMSO）中，立即使用或储存于-20 °C. 通过稀释储备液 SA，为每微孔板配制 6 ml 工作液³TBS 中 1/100 的 NA 溶液。
4. 考马斯亮蓝： 配制10%考马斯亮蓝R-250（Coomassie Blue）在TBS中的储备液，立即使用或于-20 °C保存20 °C. 按1/1000比例将储备液稀释于TBS中，配制6 ml工作液。

2. 准备唾液

1. 唾液采集： 受试者取直立位，在口中放置促唾剂（如柠檬酸或口香糖）以刺激血清渗入唾液。对于常无牙且无法咀嚼口香糖的 HIV-1 患者，使用无糖柠檬硬糖较为方便。前 3 分钟根据需要吞咽，随后 3 分钟将全口唾液收集至带盖杯子中。此过程可获得约 2 ml 唾液。应立即使用或储存于 -80 °C。
2. 唾液处理： 若样本已冷冻，请在 37 °C 下解冻并置于冰上。新鲜或解冻后的样本可在 2–4 °C 下储存，但不超过 3 天。禁止涡旋震荡唾液，并避免吸取含有黏蛋白的部分，因其不含血清渗出物。处理唾液时应采取标准防护措施 http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf。

3. 微孔板设置

1. 缓冲液： 每个实验重复三次。向微孔板的每个孔中加入 130 μL TBS。
2. 样本： 向每个检测孔中加入 20 μL 唾液，终体积为 150 μL/孔。通过移液混匀，避免产生气泡。
3. 对照： 阳性对照含有 PPE，但不加唾液；阴性对照含有唾液，但不加 PPE。向阳性对照孔中加入 20 μL TBS，向阴性对照孔中加入 20 μL 唾液。
4. PPE 孵育： 充分振荡混匀 PPE 工作液。除阴性对照孔外，向其余各孔加入 50 μL PPE 工作液；向阴性对照孔中加入 50 μL TBS。于 23 °C 孵育 10 分钟。
5. 底物孵育： 向每个孔中加入 50 μL SA³NA 工作液。于 23 °C 孵育 45 分钟。
6. 考马斯亮蓝： 向每个孔中加入 50 μL 考马斯亮蓝工作液。
7. 检测： 使用酶标仪读取吸光度，A_{405 nm} 用于检测 SA³NA 的裂解，代表有活性的 α₁PI；A_{595 nm} 用于检测考马斯亮蓝，代表蛋白含量。

4. 计算 α₁PI 指数

1. 标准化平均 A_{405 nm} 和 A_{595 nm}：对每个三复孔计算平均值。用待测样本的平均值减去阴性对照的平均值。为尽量减少板间差异，通过将每个待测样本的平均值除以阳性对照的平均值来进行归一化处理，如下所示：
   

2. 计算 α₁PI INEX： 将归一化的 A_{405 nm} 除以归一化的 A_{595 nm}：
   

5. 典型结果

为了确定α检测是否适合作为在资源有限的流行地区用于监测CD4计数的即时检测筛查方法，研究人员从喀麦隆诊所接受常规护理的20名女性和11名男性HIV-1感染者中收集了刺激性唾液样本。与在纽约市采集唾液开发α检测时的初步观察结果一致，在喀麦隆采集的唾液中α₁PI指数与CD4计数呈显著相关性（r²=0.91，p<0.0001，n=31）。该关系符合三参数S型曲线，符合剂量-反应关系特征（图2A）。95%的置信区间和预测区间分别以蓝色和红色线条表示（图2B）。

在之前的一项研究中，我们确定了在 HIV-1 感染者以及遗传性 α₁PI 缺乏症（PIZZ 型）受试者中，CD4⁺ T 细胞表现出周期为 23±3.5 天的正弦波动规律³。此处展示的是计算机生成的正弦曲线分析的一个代表性示例，显示一名非 HIV-1 健康对照者中 CD4 波动的周期为 27 天 （图 3A）。

计算机生成的CD4正弦曲线分析⁺ 6名受试者的T细胞变化产生了振幅峰峰值和振荡轴的数值³. 与预期一致，振荡轴与振幅呈正相关（r²=0.96，p=0.009，n=6）（图3B）。在CD4 T细胞计数较低的患者中⁺ 细胞计数，CD4 T细胞数量的周期性变化较小，且在CD4水平较高的患者中⁺ T细胞计数呈现显著的周期性波动。

由于图2中所示的回归线估计了振荡轴，而振荡轴与振幅相关，因此可以计算回归线的振幅，从而估计CD4⁺ T细胞因周期性波动而偏离回归线上下范围的程度（图3C）。将图3C中计算的振幅与图2B中计算的置信区间叠加后发现，振幅（绿色线）位于95%置信区间（蓝色线）之内（图3D）。

图1. 实验流程概要： 将柠檬酸置于口中并采集唾液。将稀释后的唾液以每组三个复孔的方式加入微孔板的孔中。向每个孔中加入PPE，并在23 °C孵育15分钟。向每个孔中加入PPE底物，并在23 °C孵育45分钟。加入考马斯亮蓝，在405 nm处读取吸光度以检测PPE活性，在595 nm处读取吸光度以检测蛋白质。

图 2. α 检测法与标准 CD4 计数法的比较。A) 通过定量刺激后全口唾液中的 α₁PI 指数进行 α 检测。CD4 计数由独立医学实验室采用标准流式细胞术完成。用于流式细胞术的血液和唾液在同一临床就诊期间采集。α₁PI 指数与 CD4 计数之间的关系由三参数S型曲线定义（r²=0.91，p<0.0001，n=31）。B) 95% 置信区间和预测区间分别以蓝色和红色线条表示。

图3. 使用α1PI指数计算CD4计数的准确性。A) 在一名非HIV-1健康对照者中，CD4⁺ T细胞呈现周期为27天的正弦波动。振荡轴如图中红色虚线所示。B) 采用计算机生成的正弦波分析法，分析4名HIV-1感染者、1名非HIV-1的PIzz受试者以及A部分所示的非HIV-1健康对照者的CD4 T细胞波动，用于计算峰-峰值振幅和振荡轴。CD4 T⁺细胞振幅与振荡轴之间的关系由三参数S型曲线定义（r²=0.96，p=0.009，n=6）。C) 利用B部分得出的振幅与振荡轴之间的S型关系，计算沿图2回归线（黑线）各点的预期振幅（绿色线）。D) 预期振幅区间（绿色线）与95%置信区间（蓝色线）之间存在显著差异，Mann Whitney秩和检验结果显示差异具有统计学意义（基于95%置信区间与回归线之间的中位数差异（63个细胞/μl）与振幅线与回归线之间的中位数差异（37个细胞/μl）的比较；p=0.001）。

讨论

未稀释血清中α的中位浓度为36 μM₁PI 和 3.6 μM α₂巨球蛋白（α₂M）10 倍差异 ⁸两种蛋白质竞争结合PPE。这两种特性，即浓度和对PPE的亲和力，已被用于开发一种能够特异性检测α的方法₁正常血清中存在竞争性α时的PI₂M ⁸该方法可检测低至 50 nM 的 μ₁PI在含0.3%血清的条件下。在2.5%血清稀释度下，α的结合₂M 到 PPE 的信号变得不可检测，且该稀释液中含有约 900 nM α₁PI 和 90 nM α₂M.

与血清中α₁PI含量比α₂M高10倍不同，全口唾液中两者的差异可达20倍⁹。本研究发现，未经稀释的刺激性唾液中α₁PI含量约为血清中的1/30，即约1200 nM α₁PI，据此推算α

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
促唾液分泌剂，0.05 M 柠檬酸	Eda’s Sugarfree Candies，宾夕法尼亚州费城北20街4900号，邮编19144	无糖柠檬硬糖
猪胰弹性蛋白酶，1型（EC 3.4.21.36）	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，邮编63103	E1250
琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-对硝基苯胺	Sigma-Aldrich	S4760
考马斯亮蓝R-250	Sigma-Aldrich	B7920
组织培养处理的96孔微孔板	Becton Dickinson，新泽西州富兰克林湖，邮编07417-1886	35-3072
配备405 nm和595 nm滤光片的微孔板读板仪	MTX Lab Systems，弗吉尼亚州维也纳泰科路8456号D座，邮编22182	Dynex P97277