卵巢切除术与17β-雌二醇替代在大鼠和小鼠中的可视化演示

摘要

本文演示了在大鼠和小鼠中进行卵巢切除术，以及通过硅胶胶囊和口服 Nutella 补充 17β-雌二醇的方法。

摘要

雌激素是一类具有极其广泛生理效应的女性性激素。在使用大鼠和小鼠开展雌激素研究时，通常需要对其进行卵巢切除术，以消除体内快速波动的激素分泌，并通过外源方式补充17β-雌二醇。然而，目前对于如何给药才能达到生理性的血清激素浓度仍缺乏共识。这一点至关重要，因为17β-雌二醇的给药水平和给药方式会显著影响实验结果^1-3。我们在一系列研究中系统比较了不同17β-雌二醇给药方式，发现皮下植入硅胶管胶囊和口服榛子酱（Nutella）在产生生理性17β-雌二醇血清浓度方面优于市售的缓释颗粒（由Innovative Research of America公司生产）以及每日注射给药方式^4-6。其中，口服榛子酱的方法此前已被用于布托啡诺的给药⁷，其优势在于用于雌激素给药时可模拟临床上的口服激素替代疗法，且具有非侵入性的特点；而皮下硅胶胶囊则操作简便，并能提供最稳定的血药浓度。本视频文章逐步演示了在大鼠和小鼠中实施卵巢切除术以及通过硅胶胶囊和口服Nutella进行17β-雌二醇替代的实验操作流程，随后讨论了这些给药方法中的关键注意事项。

方案

1. 通过背部入路进行卵巢切除术

1. 使用1.5%异氟烷（诱导时使用4%）与氧气/氧化亚氮30%/70%混合气体对动物进行麻醉。将动物俯卧位放置于连接直肠温度计的加热板上。动物与加热板之间应保留一层薄的隔离材料，并通过温度计反馈系统将体温维持在37 ± 0.5 °C范围内。在动物眼睛上涂抹保护性凝胶，并在术后于颈部侧面皮下注射5 mg/kg体重的卡洛芬（Rimadyl），用生理盐水稀释后给药，以缓解疼痛。
2. 在髂嵴头侧剃除4×4 cm（小鼠为3×3 cm）的毛发区域。使用例如Jodopax彻底清洗剃毛区域，然后覆盖带有4×4 cm开口的手术巾。
3. 沿中线做2–3 cm长的切口，并钝性分离皮肤与下方筋膜。在中线外侧1 cm处，通过筋膜再做一切口。在此筋膜下尽可能表浅地向侧方钝性分离，直至进入腹腔。
4. 使用镊子夹住腹腔内包裹卵巢的脂肪组织，轻柔地将其拉出。辨认卵巢结构，在该结构近端0.5–1 cm处结扎子宫角及其血管。切除卵巢及已结扎的脂肪组织，将剩余组织放回腹腔。在对侧筋膜做另一切口，并重复上述操作。
5. 使用单股缝合线缝合伤口为宜，并让动物从麻醉中自然苏醒。术后至少2小时内将动物置于加热笼中（25–27 °C）。术后最初几天应将动物单独饲养。恢复期间必须频繁清洁或更换笼具。术后24小时，再次皮下注射5 mg/kg体重的卡洛芬（Rimadyl），用生理盐水稀释后给药。

2. 通过硅胶胶囊皮下给予17β-雌二醇

1. 将所需量的17β-雌二醇与芝麻油充分混合。对于大鼠和小鼠的生理浓度，我们分别推荐180 μg/mL和18–36 μg/mL。安慰剂胶囊则仅填充纯芝麻油。
2. 剪取3 cm（小鼠为2 cm）长的硅胶管，以及5 mm（小鼠为3 mm）长的木制涂抹棒作为塞子。用镊子将一根木塞压入硅胶管一端，然后注入17β-雌二醇/芝麻油溶液，使其充满整个管腔。在开口端轻轻塞入另一根木塞以封闭硅胶胶囊（木塞应永久保留在胶囊内）。植入前，将胶囊在剩余的17β-雌二醇溶液中孵育过夜。
3. 胶囊的植入可在大鼠行卵巢切除术时所使用的麻醉状态下进行。然而对于小鼠，强烈建议在卵巢切除术后恢复14天，以尽量降低胶囊从脆弱皮肤处突出的风险。
4. 按照步骤1.1进行手术准备，或在关闭卵巢切除切口后，剃除并清洗动物颈部背侧约2×2 cm的区域。做1 cm切口，并向尾外侧钝性分离皮下 pockets，留出足够空间容纳胶囊。取出此前一直孵育在17β-雌二醇溶液中的硅胶胶囊，擦拭后经切口轻轻置入，随后缝合切口。关键是要确保胶囊对皮肤的张力尽可能小，特别是靠近伤口的区域。从胶囊制备到植入的整个过程，都必须避免污染。

3. 通过能多益巧克力酱经口给予17β-雌二醇

1. 将17β-雌二醇充分溶解于芝麻油中，然后将芝麻油与能多益（Nutella）混合。建议每只大鼠每日剂量为每千克体重含17β-雌二醇28 μg、芝麻油5 μL和能多益1 g；每只30 g小鼠每日剂量为17β-雌二醇1.12 μg、芝麻油0.312 μL和能多益60 mg。安慰剂组的坚果奶油除不含17β-雌二醇外，其余制备方法相同。
2. 在实验开始前5天，训练动物食用不含激素的坚果奶油。训练的前3天，应尽量将大鼠分组（约0.5 g能多益供2–5只动物）在其饲养笼内进行训练。训练的第4天和第5天，动物应在给予每日剂量前移至单独的笼子中，以模拟实验时的条件。
3. 实验期间，每次喂食时均将动物置于单独的笼子中，随后将能多益涂抹于小型陶瓷片上供其食用。若按上述方法完成训练，根据我们的经验，超过95%的大鼠和小鼠均可接受该坚果奶油；一旦完全适应，大多数动物可在数秒内完成摄食。

4. 代表性结果

当前方法旨在模拟的生理范围内血清17β-雌二醇浓度，在大鼠中约为5-140 pg/mL，在小鼠中约为5-35 pg/mL^4,6。按照上述说明制备的皮下硅胶胶囊，给予体重300 g的雌性Sprague-Dawley大鼠后，血清17β-雌二醇浓度从第2天的约40 pg/mL缓慢下降至第35天的10 pg/mL。然而，在给药后立即会出现一个约1000 pg/mL的血清浓度峰值，并在8小时内迅速降至生理范围（图1A）^4,5。上述含有36 μg 17β-雌二醇/mL的硅胶胶囊给予体重25 g的雌性C57BL/6小鼠后，血清浓度从第2天的约90 pg/mL缓慢下降至第35天的25 pg/mL。在浓度开始下降前，可能也会出现与大鼠类似的峰值，但该现象尚未被研究证实（图1B）⁶。

当以所述剂量对300 g雌性Sprague-Dawley大鼠经口给予Nutella法时，可使17β-雌二醇水平维持在生理范围内，每日波动于10–70 pg/mL之间（图2A）⁴。在小鼠中使用上述剂量时，每日激素水平在约20至120 pg/mL之间波动（图2B）⁶。

图1. 植入胶囊后大鼠（A；前24小时时间点n=10，后续时间点n=15）^4,5和小鼠（B；n=10）⁶体内17β-雌二醇浓度的示意图。硅胶胶囊在植入初期会引起血清浓度短暂升高，最高可达1000 pg/mL，但在数小时内迅速下降至100 pg/mL以下。在随后的4至5周内，胶囊可维持相对稳定但呈持续缓慢下降的血清浓度。阴影区域分别代表完整雌性大鼠和小鼠体内的生理性17β-雌二醇血清浓度水平。尽管图中未直观显示，采用硅胶胶囊法个体间17β-雌二醇浓度存在差异，大鼠的变异系数为27%至183%，小鼠为28%至115%（极低的平均浓度通常会导致较高的变异系数）。

图 2. 以Nutella载体每日给予激素后，大鼠（A；n=15）⁴和小鼠（B；n=10）⁶体内17β-雌二醇浓度的示意图。经口给予Nutella的方法会产生每日浓度峰值，但远低于皮下或静脉给药所产生的峰值。该方式模拟了人类激素替代治疗的药代动力学特征，且经口给药可长期持续进行，尽管上图仅展示了最初的96小时数据。阴影区域分别代表完整雌性大鼠和小鼠体内的生理性17β-雌二醇血清浓度范围。尽管图中未直观显示个体间差异，但采用Nutella方法时，大鼠17β-雌二醇浓度的变异系数为40%至132%，小鼠为13%至219%（极低的平均浓度常导致较高的变异系数）。

讨论

上述给药方式在早期研究中已被证明在产生生理水平的17β-雌二醇血清浓度方面优于商用缓释颗粒和注射剂。缓释颗粒会导致血清浓度峰值过高且持续时间过长，而注射给药则会引起剧烈的每日激素波动，并需要反复对动物进行操作，造成应激^4-6。近期研究进一步强调了选择合适给药方式的重要性：低剂量17β-雌二醇给药方案（如本文所述技术）可对脑缺血起到保护作用^8-10，而商用缓释颗粒所产生的17β-雌二醇浓度反而可能加重脑损伤^1,2,11-14。此外，也有研究尝试过饮水给药和灌胃两种较少使用的方法。饮水给药的最大优势在于其高度非侵入性，几乎无需对动物进行操作。然而，17β-雌二醇在无乳化剂的情况下难溶于水，个体饮水量难以控制，且若目标是模拟口服药片的摄入模式，则该方法存在另一缺陷：小鼠在24小时内持续饮水。灌胃法最主要的缺点是对动物造成较大应激，并可能引起食管损伤，从而影响其摄食行为。

本文所述的方法——硅胶胶囊和经口Nutella给药——均适用于短期雌激素给药，也可用于长达5至6周的较长期给药。若使用的剂量高于上述描述，无论采用何种给药...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
利马多尔，50 mg/mL	Pfizer Pharma GmbH	462986	卵巢切除术后镇痛。
卢布里塔尔眼用凝胶	Leo Laboratories		手术期间眼部保护。
碘帕克斯兽用	Pharmaxim		手术消毒。
薇乔4-0缝线	Johnson & Johnson		伤口缝合及卵巢结扎。
17β-雌二醇，>98%	Sigma-Aldrich	E8875-1G	溶于芝麻油用于硅胶胶囊及能多益。
芝麻油	Sigma-Aldrich	S3547-1L	溶解17β-雌二醇。
硅胶管，内径/外径：1.575/3.175 mm	Dow Corning	508-008	硅胶胶囊制备。
木制涂药棒	Selefatrade	12-0783	硅胶胶囊封口。
能多益（Nutella）	Ferrero		口服17β-雌二醇的载体。