秀丽隐杆线虫（C. elegans）易于培养和扩增，是一种理想的研究用模式生物。通过同步化线虫发育阶段，可获得大量处于相同发育时期的个体，从而便于在多个动物中研究特定的生物学过程。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的分子与发育生物学研究始于20世纪70年代初，由悉尼·布伦纳（Sydney Brenner）开创，此后该生物被广泛用作模式生物1。C. elegans具有结构简单、通体透明和生命周期短等关键特性，使其多年来成为进行基础生物学研究的理想实验体系2。该线虫中的许多发现具有广泛意义，因为调控动物发育的众多细胞和分子过程在进化上是保守的3。
C. elegans 的生命周期在发育至成虫前需经历胚胎期和四个幼虫期。发育时间根据温度不同，通常需要 2 到 4 天。在各个发育阶段均可观察到若干特征性表型。其完整的细胞谱系4,5以及基因组的深度注释，使这种线虫成为神经生物学6、衰老7,8、干细胞生物学9和生殖系生物学10等多个研究领域的理想模式生物。
另一个使其具有优势的特点 秀丽隐杆线虫 一个极具吸引力的实验模型是可通过相对简单的方案获得特定发育阶段同步化的线虫群体。该线虫易于培养和扩增，结合同步化处理的可行性，为获取大量线虫提供了强有力的工具，可用于多种低通量或高通量实验，如RNAi筛选、微阵列、大规模测序、免疫印迹等 原位 杂交等。
由于其透明性，可以使用微分干涉差显微镜（也称为诺马尔斯基显微镜）在显微镜下区分 C. elegans 的结构。例如，使用荧光DNA结合染料DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚），可实现对单个细胞的特异性识别和定位，以及与这些细胞相关的亚细胞结构或缺陷的观察。
方案
1. 方案A：用于漂白的线虫培养 11
通过在液体培养基或平板上的固体培养基中培养，可以获得大量秀丽隐杆线虫（C. elegans）。通常将其培养在固体NGM（线虫生长培养基）上，并以大肠杆菌（E. coli）作为食物来源，该细菌可通过紫外线12、加热13或低温14处理使其失活后添加至平板中。最常用的方法是使用活的OP50大肠杆菌（E. coli），该菌株缺乏尿嘧啶合成能力，因此不会过度生长形成厚层菌苔而遮蔽线虫。
- 称取3 g NaCl、17 g 琼脂和2.5 g 蛋白胨，加入975 ml H2O。121 °C高压灭菌50分钟。
- 将锥形瓶冷却至55 °C。
- 加入1 ml 1 M CaCl2、1 ml 5 mg/ml 乙醇溶解的胆固醇、1 ml 1 M MgSO4 和25 ml 1 M KPO4 缓冲液（除胆固醇外，其余试剂均预先灭菌）。
- 在无菌条件下将NGM培养基分装至培养皿中，填充量不超过培养皿体积的2/3。
- 待培养基凝固干燥后，建议将培养皿在室温放置2–3天以检测污染。从甘油保存菌种中划线接种OP50 E. coli（OP50菌株可从线虫遗传学中心获得）。
- 挑取单菌落，于LB液体培养基中37 °C振荡培养过夜。
- 打开培养皿盖，在超净工作台中使培养基表面多余水分挥发，然后用无菌巴斯德吸管将OP50菌液加至培养皿中央。
- 将OP50 E. coli 菌苔在室温下培养过夜，或在37 °C培养8小时。
- 将所需数量的线虫接种至培养皿中（若培养皿曾于37 °C孵育，使用前需先冷却至室温）。
提示：
- 使用移液器或泵式分液器将相同体积的培养基倒入培养皿中，可确保各培养皿中琼脂体积一致，并便于移动培养皿时无需重新对立体显微镜聚焦。
- 培养皿（无论是否接种细菌）在室温或 4 °C 容器中保存后，可在制备后数周内继续使用。
- 避免将细菌涂布至培养皿边缘。若菌苔延伸至培养皿边缘，线虫可能沿侧壁爬出，导致脱水死亡。
- 若接种在培养皿上的细菌已失活，线虫的寿命会更长15。
2. 方案B：碱性次氯酸盐溶液处理（“漂白”）11
漂白技术用于将秀丽隐杆线虫（C. elegans）培养物同步在第一幼虫阶段（L1）。该方法的原理在于，成虫对漂白剂敏感，而卵壳可保护胚胎免受其影响。经碱性次氯酸盐溶液处理后，将胚胎在无食物的液体培养基中孵育，以使其孵化但阻止进一步发育。
- 让线虫生长至成虫阶段。
- 用 M9 缓冲液冲洗培养板，将怀卵成虫收集到 15 ml 离心管中。
- 在室温下以 400×g（在标准台式离心机上约为 1500 rpm）离心 2 分钟，使线虫沉淀，并弃去上清液。
- 进行 1–3 次洗涤，直至缓冲液中无可见细菌。
- 加入所需的漂白液（表 I），并振荡数分钟（应在解剖显微镜下监测成虫组织的裂解情况，并在仍可见少量成虫残迹时停止反应，通常需要 3 至 9 分钟，具体时间取决于多种因素，如线虫沉淀体积，详见讨论部分）（图 3）。
- 加入 M9 缓冲液至管满，以终止反应。
- 快速离心（因处理可能仍在进行）1 分钟（400 × g），并弃去上清液。
- 用 M9 缓冲液将管加满，再洗涤沉淀三次。
- 向沉淀中加入 1 ml M9 缓冲液，或将卵转移至未接种的 NGM 平板，于所需温度下轻轻振荡培养。应提供适当的通气条件（图 4）。
提示：
- 存在多种漂白溶液，可根据实际操作效果选择最适合的一种（表1，图1）。
- 已产在培养板上的卵可通过使用柔软材料（如X光片碎片）刮取琼脂表面进行回收。
- 成虫残留物过多可能影响同步化效果，因其可作为新孵化幼虫的食物来源。
- 较高温度会略微加快发育速度，若部分线虫跳过同步化过程，则高温下同步化与非同步化个体间的发育差异将更为显著，因此不利于实验。
- 漂白溶液应在使用前新鲜配制。此外，次氯酸钠溶液在开封后会因光照等因素逐渐失效。建议将新开封的试剂分装至小型棕色瓶中，以减少光暴露，防止活性下降。
3. 实验方案C：线虫接种
- 漂白处理后等待12至24小时（胚胎发育完成时间取决于温度），通过离心（400 × g，2分钟）回收线虫。
- 弃去上清液，将线虫接种至所需培养板，并让残留液体自然干燥。
- 将培养板置于所需温度下培养。
提示：
- 在M9缓冲液中的L1幼虫可在15 °C条件下轻轻摇动保存至少一周，无明显变化。
- 计算接种线虫数量时需谨慎，因为数量过多可能导致食物消耗速度超出预期，从而影响实验结果。约500条L1幼虫可在55 mm培养皿中发育至成虫而不会耗尽食物。
4. 方案 D：C. elegans 观察
D.1 诺马尔斯基观察
微分干涉差显微镜是一种光学显微镜照明技术，用于增强未染色透明样本的对比度。“诺马尔斯基”（Nomarski）一词指的是该技术所使用的棱镜，以发明者命名。通过观察活体动物，我们能够研究其生理状态，唯一的改变仅来自于固定造成的限制。此外，由于未添加任何固定剂，可在活体（in vivo）条件下观察荧光标记。这一特点，加上将荧光标记与目标基因融合的可能性，使得追踪研究蛋白可能参与的生物学过程成为可行。通过采用本实验方案中描述的技术，不仅可以观察活体线虫，还可将其回收并再次接种培养。
琼脂平板制备（使用前进行）：
- 准备2%的琼脂糖水溶液并融化，保持在65 °C下熔融状态。
- 将两张带有胶带的载玻片分别置于另一张干净载玻片的两侧。
- 使用巴斯德移液管将一滴琼脂滴加到干净的表面上。
- 将另一张干净的载玻片垂直盖在三张叠放的载玻片上方，覆盖琼脂滴。
- 轻轻按压，使琼脂滴被压平至与胶带间隔厚度一致。
- 待琼脂凝固后，轻轻抽出带胶带的载玻片，并通过相对滑动分离剩余的两张载玻片。
活体动物的固定
- 在垫片中央加入一滴（10 μl）1 mM 的左旋咪唑或 10-30 mM 的叠氮化钠。
- 使用线虫挑取工具将线虫转移至液滴中。
- 轻轻盖上盖玻片，并在两侧使用指甲油或硅胶固定。
提示：
- 将 2% 琼脂糖分装后保存于 4 °C。
- 熔化的琼脂糖可在 65 °C 下保存至少一天。
- 注意：左旋咪唑是一种烟碱型受体激动剂，可引起痉挛性肌肉麻痹16。
- 注意，叠氮化钠具有极高毒性！
D.2 乙醇固定和 DAPI 染色
本文所述方案提供了一种快速使用DAPI对线虫染色的方法，但由于线虫在解剖过程中可能受到损伤，某些结构可能会出现一定改变。在进行DAPI染色前，还有多种其他固定线虫的方法，例如使用卡诺氏液（Carnoy's solution）或甲醛固定，这些方法能更好地保持线虫的完整性17。
乙醇固定（改良自18）
- 在显微镜载玻片上放置约 10 μl M9 缓冲液（或水）。
- 使用线虫挑针小心地将 10–25 条线虫转移至液滴中。
- 使用滤纸或微量移液器尽可能吸除 M9 缓冲液，注意不要吸走线虫或使其干燥。
- 加入约 10 μl 90% 乙醇，静置使其干燥。
- 重复步骤 4 一至两次。
4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色
- 将 DAPI 与所需的封片剂混合，使其终浓度为 2 ng/μl。
- 待乙醇完全挥发后，加入 7 μl 的 DAPI:封片剂混合液。
- 盖上盖玻片，并用指甲油或硅胶在两侧固定。加入 DAPI 后约 5 分钟，载玻片即可用于观察。
提示：
- 封片剂含有甘油，因此只需少量即可覆盖整个样本。
- 市面上有多种商用封片剂（例如 Fluoromount 或 Prolong），其质量和价格取决于您希望保存样本的时间长短。
- 注意：DAPI 是一种已知的诱变剂，可强烈结合 DNA 中富含 A-T 的区域。
配方
线虫生长培养基（NGM）
1.7% (w/v) 琼脂
50 mM NaCl
0.25% (w/v) 蛋白胨
1 mM CaCl2
5 μg/ml 胆固醇
25 mM KPO4
1 mM MgSO4
M9 缓冲液
22 mM KH2PO4
42 mM Na2HPO4
86 mM NaCl
1 mM MgSO4
测试的漂白溶液
| 配方 #1 | 配方 #2 | 配方 #3 | 配方 #4 | 配方 #5 | |
| 水 (ml) | 2.75 | 3.5 | 0.5 | 0.5 | 1.5 |
| 氢氧化钠 (ml) | 1.25 (1M) | 0.5 (5M) | 2.5 (1M) | 2.5 (2M) | 2.5 (1M) |
| 次氯酸钠 ~ 4% (ml) | 1 | 1 | 1 | 2 | 1 |
| 总量 (ml) | 5 | 5 | 4 | 5 | 5 |
表 I. 本文测试的不同漂白溶液配方。配方 #3 和 #4 为 2 倍浓度，使用时应加入等体积的 M9。配方 #1、#2 和 #5 之前已有报道2, 11, 19。最终浓度：#1 NaOH 0.25 M，NaOCl ~0.8%；#2 NaOH 0.5 M，NaOCl ~0.8%；#3 NaOH 0.625 M，NaOCl ~1%；#4 NaOH 1 M，NaOCl ~1.6%；#5 NaOH 0.5 M，NaOCl ~0.8%。
5. 代表性结果
图1. 五种不同漂白溶液在两个不同孵育时间下的比较。 将N2线虫用M9缓冲液洗涤两次后，分入五个含有不同漂白溶液的15 ml圆锥管中。剧烈振荡试管，于指定时间点取出1 ml转移至含M9的新试管中以终止反应。漂白处理后，线虫在20 °C下用1 ml M9缓冲液孵育24小时。每种情况下，下方图像为漂白后立即拍摄，上方图像为24小时后拍摄。
图2. 漂白液的温度影响处理效果。 使用相同体积的N2线虫，分别用经冰上预冷20分钟或在25 °C下保存相同时间的漂白液进行漂白处理。左侧两列显示漂白刚结束时的图像。处理后，线虫在15 ml锥形管中，加入1 ml M9缓冲液，于20 °C培养24小时。右侧两列显示24小时后的图像。
图3. 蠕虫沉淀物与碱性次氯酸盐孵育时间的比值影响处理效果。 将50、100、250和500 μl的蠕虫沉淀物分别与2 ml漂白溶液#3混合，孵育3、6和9分钟。在20 °C下于15 ml锥形管中用1 ml M9缓冲液孵育24小时后，对孵化出的L1幼虫、死亡胚胎以及成虫残留碎片进行定量统计。获取100 μl蠕虫沉淀物大约需要三块长满成虫的55 mm培养板。
图 4. C. elegans 胚胎的孵化与存活需要充分通气。 取 100 μl N2 线虫沉淀，经 6 分钟次氯酸钠处理后，于 15 ml 圆锥管中分别加入 1、5 或 10 ml M9 缓冲液（如图所示），在 20 °C 下孵育 24 小时。图的上半部分显示了 24 小时后各培养物的照片，箭头指示未孵化的卵。图的下半部分为柱状图，显示在指定条件下漂白后 48 小时的幼虫数量（浅灰色）和死亡胚胎数量（深灰色）。
图5. 生命周期 C. elegans。a 不同发育阶段线虫的大致体长。在不同温度下达到各阶段所需的时间（改编自 20). b. 微分干涉（上）和 DAPI（下）显微图像显示处于不同指定发育阶段的线虫。各阶段最显著的特征已放大展示。 L1: 箭头指示体性性腺和生殖细胞系的前体。 早期L4： 黑色箭头（Nomarski）指示发育中的外阴；白色箭头（DAPI）指示两个性腺臂。 中晚期L4： 箭头指示处于所谓圣诞树期的发育中阴门。 青年成人： 黑色箭头指示子宫内的胚胎，箭头指向受精囊，白色箭头指示卵母细胞。 产卵成虫： 箭头（DAPI）指示受精胚胎。DAPI图像中的箭头指示受精囊。
图6. L3、L4和成虫期的阴门形态。 在L3阶段，仅能观察到形成阴门位置的一个微小管腔。在L4阶段，该管腔扩张，形成所谓的“圣诞树”结构。在成虫期，阴门已闭合。黄色线条标示了这三个阶段阴门的位置。
图7. L3、早期L4、晚期L4及成虫阶段的DAPI染色结果。 在L3阶段，生殖系呈伸长形态；在L4阶段，性腺臂呈现U形结构；在晚期L4阶段，可在性腺远端观察到精子；年轻成虫中可见卵母细胞；成虫生殖系中则同时存在卵母细胞和胚胎。黄色线条标示了各指定发育阶段生殖系的边界。
图8. C. elegans 在15°C和25°C下的发育情况。 N2线虫经漂白处理后，在M9培养基中于15°C振荡培养过夜，随后转移至培养板，并在指定温度下生长指定时间。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
线虫同步化
已有多种漂白溶液被报道。我们尝试了五种不同的配方（表 I），在我们的实验条件下，这些配方在同步线虫群体方面未显示出显著差异（图 1）。然而，我们的实验结果表明，温度（图 2）、漂白液与线虫体积的比值（图 3）以及用于孵化胚胎的M9缓冲液体积（图 4）等参数确实会影响线虫的存活率，这些因素与培养过程中的充分通气有关。在我们的振荡条件下，15 ml离心管中若加入1 ml液体可保证所有线虫存活，而5 ml的体积已足以影响胚胎正常孵化，其效果与最大体积15 ml相当（未显示）。
C. elegans 发育
在发育过程中，C. elegans 会经历四个幼虫阶段（图5），然后进入成虫阶段。生殖系是判断 C. elegans 发育...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
作者感谢MICINN（通过PTA项目支持Montserrat Porta de la Riva）、AGAUR（为Laura Fontrodona提供博士奖学金）、Carlos III健康研究所（通过Miguel Servet项目支持Julián Cerón）以及Marie Curie IRG、ISCIII和IDIBELL对本实验室的经费资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
参考文献
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Wood, W. B. The nematode Caenorhabditis elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1988).
- Potts, M. B., Cameron, S. Cell lineage and cell death: Caenorhabditis elegans and cancer research. Nat. Rev. Cancer. 11, 50-58 (2011).
- Kimble, J., Hirsh, D. The postembryonic cell lineages of the hermaphrodite and male gonads in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 70, 396-417 (1979).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-24 (2010).
- Depuydt, G., Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Protein metabolism and lifespan in Caenorhabditis elegans. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 81-107 (2010).
- Jia, K., Levine, B. Autophagy and longevity: lessons from C. elegans. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 47-60 (2010).
- Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev. Dyn. 239, 1539-1554 (2010).
- Waters, K. A., Reinke, V. Extrinsic and intrinsic control of germ cell proliferation in Caenorhabditis elegans. Mol. Reprod. Dev. 78, 151-160 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Wormbook. , (2006).
- Smith, E. D. Age- and calorie-independent life span extension from dietary restriction by bacterial deprivation in Caenorhabditis elegans. BMC Dev. Biol. 8, 49(2008).
- Olahova, M. A redox-sensitive peroxiredoxin that is important for longevity has tissue- and stress-specific roles in stress resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19839-19344 (2008).
- Voisine, C. Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans. PLoS One. 2, e504(2007).
- Garigan, D. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, 1101-1112 (2002).
- Aceves, J., Erlij, D., Martinez-Maranon, R. The mechanism of the paralysing action of tetramisole on Ascaris somatic muscle. Br. J. Pharmacol. 38, 602-607 (1970).
- Shaham, S. Methods in cell biology. Wormbook. , (2006).
- Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbardm, E. J. Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition. Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10417-10422 (2002).
- Protocols [Internet]. , Available from: http://protocols.mmml.nl (2012).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
