基础 Caenorhabditis elegans 实验方法：同步化与观察

摘要

秀丽隐杆线虫（C. elegans）易于培养和扩增，是一种理想的研究用模式生物。通过同步化线虫发育阶段，可获得大量处于相同发育时期的个体，从而便于在多个动物中研究特定的生物学过程。

摘要

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的分子与发育生物学研究始于20世纪70年代初，由悉尼·布伦纳（Sydney Brenner）开创，此后该生物被广泛用作模式生物¹。C. elegans具有结构简单、通体透明和生命周期短等关键特性，使其多年来成为进行基础生物学研究的理想实验体系²。该线虫中的许多发现具有广泛意义，因为调控动物发育的众多细胞和分子过程在进化上是保守的³。

C. elegans 的生命周期在发育至成虫前需经历胚胎期和四个幼虫期。发育时间根据温度不同，通常需要 2 到 4 天。在各个发育阶段均可观察到若干特征性表型。其完整的细胞谱系^4,5以及基因组的深度注释，使这种线虫成为神经生物学⁶、衰老^7,8、干细胞生物学⁹和生殖系生物学¹⁰等多个研究领域的理想模式生物。

另一个使其具有优势的特点 秀丽隐杆线虫 一个极具吸引力的实验模型是可通过相对简单的方案获得特定发育阶段同步化的线虫群体。该线虫易于培养和扩增，结合同步化处理的可行性，为获取大量线虫提供了强有力的工具，可用于多种低通量或高通量实验，如RNAi筛选、微阵列、大规模测序、免疫印迹等 原位 杂交等。

由于其透明性，可以使用微分干涉差显微镜（也称为诺马尔斯基显微镜）在显微镜下区分 C. elegans 的结构。例如，使用荧光DNA结合染料DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚），可实现对单个细胞的特异性识别和定位，以及与这些细胞相关的亚细胞结构或缺陷的观察。

方案

1. 方案A：用于漂白的线虫培养 ¹¹

通过在液体培养基或平板上的固体培养基中培养，可以获得大量秀丽隐杆线虫（C. elegans）。通常将其培养在固体NGM（线虫生长培养基）上，并以大肠杆菌（E. coli）作为食物来源，该细菌可通过紫外线¹²、加热¹³或低温¹⁴处理使其失活后添加至平板中。最常用的方法是使用活的OP50大肠杆菌（E. coli），该菌株缺乏尿嘧啶合成能力，因此不会过度生长形成厚层菌苔而遮蔽线虫。

1. 称取3 g NaCl、17 g 琼脂和2.5 g 蛋白胨，加入975 ml H₂O。121 °C高压灭菌50分钟。
2. 将锥形瓶冷却至55 °C。
3. 加入1 ml 1 M CaCl₂、1 ml 5 mg/ml 乙醇溶解的胆固醇、1 ml 1 M MgSO₄ 和25 ml 1 M KPO₄ 缓冲液（除胆固醇外，其余试剂均预先灭菌）。
4. 在无菌条件下将NGM培养基分装至培养皿中，填充量不超过培养皿体积的2/3。
5. 待培养基凝固干燥后，建议将培养皿在室温放置2–3天以检测污染。从甘油保存菌种中划线接种OP50 E. coli....

讨论

线虫同步化

已有多种漂白溶液被报道。我们尝试了五种不同的配方（表 I），在我们的实验条件下，这些配方在同步线虫群体方面未显示出显著差异（图 1）。然而，我们的实验结果表明，温度（图 2）、漂白液与线虫体积的比值（图 3）以及用于孵化胚胎的M9缓冲液体积（图 4）等参数确实会影响线虫的存活率，这些因素与培养过程中的充分通气有关。在我们的振荡条件下，15 ml离心管中若加入1 ml液体可保证所有线虫存活，而5 ml的体积已足以影响胚胎正常孵化，其效果与最大体积15 ml相当（未显示）。

C. elegans 发育

在发育过程中，C. elegans 会经历四个幼虫阶段（图5），然后进入成虫阶段。生殖系是判断 C. elegans 发育.......