建立永生化的小鼠脑微血管内皮细胞系作为 体外 血脑屏障模型

摘要

本方法描述了如何从小鼠脑组织中分离并永生化微血管内皮细胞。我们介绍了一套从脑组织匀浆、消化处理、细胞接种到细胞永生化的逐步实验方案。通常需要约五周时间获得均一的、可永生化的微血管内皮细胞系。

摘要

上皮细胞和内皮细胞（EC）构成细胞旁屏障，保护组织免受外界和内部环境的影响。血脑屏障（BBB）由内皮细胞、星形胶质细胞终足、周细胞以及基底膜组成，负责脑实质的保护和稳态维持。体外 BBB 模型是研究 BBB 在细胞水平上结构与功能的常用工具。迄今为止，不同实验室已建立了大量不同的体外 BBB 模型。通常，这些细胞来源于牛、猪、大鼠或小鼠的脑组织（详见 Wilhelm 等¹ 的综述）。人源组织样本仅在少数实验室或公司中可获得^2,3。由于原代细胞制备耗时，且内皮细胞培养批次间可能存在差异，因此建立永生化内皮细胞系成为当前科学研究的关注重点。

本文介绍了一种从小鼠新生脑组织中建立永生化脑微血管内皮细胞（EC）系的方法，并逐步描述了所用试剂和溶液。本实验室建立的方法可在4至5周内分离获得均一的永生化内皮细胞系。Förster实验室根据该方法分离得到了命名为cEND⁴（源自大脑皮层）和cerebEND⁵（源自小脑皮层）的脑微血管内皮细胞系，并已成功应用于血脑屏障（BBB）多种生理与病理过程的研究。利用cEND和cerebEND细胞系，我们已证实这些细胞可响应糖皮质激素^4,6-9和雌激素处理¹⁰，以及TNFα等促炎介质^5,8。此外，我们还在内皮细胞水平上研究了多发性硬化¹¹和缺氧^12,13的病理机制。cEND和cerebEND细胞系可作为研究血脑屏障结构与功能、内皮细胞对不同刺激的细胞反应，以及内皮细胞与淋巴细胞或肿瘤细胞相互作用的良好工具。

方案

1. 脑微血管的分离

1. 每次制备使用五至十只任一性别的新生小鼠（3-5日龄）。
2. 根据当地IACUC/兽医建议对小鼠实施安乐死，立即取出脑组织，并转移至含有以下溶液的培养皿中：15 mM Hepes（pH 7.4）、153 mM NaCl、5.6 mM KCl、2.3 mM CaCl₂x 2H₂O、2.6 mM MgCl₂x 6H₂O、1% (w/v) BSA（以下简称缓冲液A）。
3. 除非另有说明，所有分离操作均应在室温（RT）（22-24 °C）下于超净工作台内进行。用无菌手术刀在缓冲液A中将脑组织（去除小脑和脑干的大脑部分）切碎，同时去除脑膜和毛细血管碎片。用10 ml移液器反复吹打组织碎片，直至无明显团块。将悬液转移至50 ml Falcon管中，在室温下以250 x g离心5分钟。

注意：脑膜可被识别为脑组织表面的薄而透明的膜。可用无菌镊子小心去除。

4. 弃去上清液。
5. 将沉淀物溶于 4.5 ml 缓冲液 A 中，并加入 1.5 ml 0.75% (w/v) 胶原酶/分散酶（Roche），在 37 °C 水浴中孵育 45 分钟（期间偶尔振荡）。
6. 同时，通过在四个孔中包被 IV 型胶原蛋白（0.1 mg/ml 溶于 50 mM 乙酸）来准备 12 孔板。室温孵育 1 小时使其贴壁。
7. 加入 15 ml 冰冷的缓冲液 A 终止消化反应，并充分重悬沉淀物。
8. 在室温下以 250 × g 离心 10 分钟。
9. 弃去上清液。
10. 为去除髓鞘，加入 10 ml 25% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA，Sigma，纯度 > 98%），并在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 20 分钟。25% BSA 应溶于 1× PBS（PAA Laboratories）中，并通过 0.2 μm 滤膜过滤。
11. 小心弃去上清液，将沉淀物溶于 10 ml 缓冲液 A 中，并转移至新的 Falcon 管中。
12. 在室温下以 250 × g 离心 5 分钟。所得沉淀物含有内皮细胞。
13. 用 PBS 清洗 IV 型胶原蛋白包被的 12 孔板两次。
14. 将沉淀物重悬于 4 ml 生长培养基中（DMEM 含 10% 胎牛血清、50 U/ml 青霉素/链霉素、1% L-谷氨酰胺），并将细胞悬液接种至两个孔中，每孔 2 ml。加入嘌呤霉素至终浓度为 4 μg/ml，并在 37 °C 细胞培养箱中孵育 45 分钟。此步骤可去除快速贴壁的细胞。注意：嘌呤霉素持续作用 24 小时。只有脑内皮细胞（ECs）能够代谢该药物，对其他类型的细胞而言，嘌呤霉素具有毒性¹⁴。
15. 将步骤 1.14 中含有未贴壁细胞的 2 ml 培养基转移至两个新的孔中（这些孔含有内皮细胞组分）。向步骤 1.14 中已贴壁细胞的孔中补充 2 ml 新鲜培养基（这些孔含有其他细胞类型，例如 成纤维细胞、星形胶质细胞，可平行培养并用于形态学比较）。
16. 次日更换培养基。

2. 永生化脑微血管内皮细胞

1. 在明胶包被的培养瓶中，使用含10%热灭活胎牛血清（FCS）、50 U/ml青霉素/链霉素和2 mg/ml G418（PAA Laboratories）的DMEM培养基培养分泌携带多瘤病毒中T癌基因的复制缺陷型病毒的GP + E-86 Neo（GPENeo）¹⁵成纤维细胞。注意：多瘤病毒中T癌基因转染可使内皮细胞（ECs）相对于非内皮细胞具有生长优势，从而在培养4至6周后形成具有内皮细胞形态的均一单层。GPENeo细胞未商业化供应，可作为共享公共材料获取（详见原始文献^4,16）。
2. 为用于永生化目的的含病毒培养基，将GPENeo细胞在不含G418的培养基中培养24小时。
3. 收集10 ml GPENeo上清液，加入Polybrene（聚凝胺，即己二甲溴铵）（Sigma），使其终浓度为8 μg/ml，并通过0.45 μm滤器过滤除菌，以去除细胞碎片。
4. 移除第1部分中准备的内皮细胞培养物的生长培养基，每孔加入2 ml GPENeo上清液与Polybrene的混合物。次日重复一次，使用新鲜配制的GPENeo上清液/Polybrene混合物。注意：Polybrene用于在细胞膜上形成孔道，以促进病毒颗粒的感染。
5. 次日移除GPENeo上清液/Polybrene混合物，用PBS洗涤细胞两次，并将细胞维持在生长培养基中，每3天更换一次培养基。当细胞达到汇合时，以1:2比例传代至IV型胶原包被的培养板上。
6. 通常在4至5周后可获得稳定的脑微血管内皮（cEND）细胞系。

3. 培养脑微血管内皮细胞

1. 从冻存管中取出细胞，在水浴中解冻后转移至15 ml离心管中，加入10 ml预热的培养基。
2. 在室温下以250 × g离心5分钟。
3. 吸除培养基，将细胞沉淀转移至预先用IV型胶原蛋白包被的T_{25 cm}² 细胞培养瓶中，并加入预热的生长培养基（接种细胞密度应至少为1×10⁴个细胞/ml）。
4. 次日更换培养基，待细胞达到汇合状态后（通常在5天后）进行传代。

4. cEND细胞的传代（注意：每周仅传代一次，传代比例不应高于1:4）。

1. 移除培养基，用 PBS 洗涤细胞。
2. 加入 3 ml 温热的胰蛋白酶-EDTA 溶液（PAA Laboratories）（用于 T_{75 cm}² 培养瓶），于 37 °C 培养，直至细胞层完全分散（通常在 5 至 15 分钟内）。
3. 加入 5 ml 生长培养基，反复吹打混匀，转移至新的经 IV 型胶原蛋白包被的培养瓶中。

5. cEND 细胞的冻存

1. 按照步骤4所述方法获得细胞悬液
2. 在室温下以250 × g离心5分钟。
3. 将细胞沉淀（来自1个T_{75 cm}²培养瓶）重悬于6 ml冻存液（95%生长培养基，5% DMSO）中。
4. 将细胞悬液分装为四份，每份1.5 ml，置于冻存管中。注意：一份冻存液可接种于T_{25 cm}²培养瓶中。
5. 将冻存管置于液氮蒸气相温度中保存。

cEND生长培养基：450 ml DMEM，10% FCS，10 ml L-谷氨酰胺，2% MEM-Kit，2% NEAA，10 ml 丙酮酸钠，50 U/ml 青霉素/链霉素

6. 代表性结果

通过内皮细胞和血脑屏障（BBB）标志物的免疫染色，以及跨内皮电阻（TEER）和通透性的测定，对cEND和cerebEND细胞进行了表征。cEND和cerebEND细胞的形态与脑内皮细胞（ECs）的原代培养物相似，表现为紧密排列的长梭形细胞单层，在汇合时表现出生长抑制现象。免疫荧光结果显示，这些细胞在细胞间连接处表达可清晰检测水平的claudin-5、occludin和VE-cadherin蛋白（图3）^4,5。将cEND细胞在血清减量培养基中培养可提高TEER值（从含10%血清时的150 Ωcm²升高至含2%血清时的500 Ωcm²），而加入氢化可的松后TEER进一步增强至800 Ωcm²，或加入胰岛素后达到1,000 Ωcm²）⁴。cEND细胞在血清减量培养基中培养21天后，其单层TEER值可达900 Ωcm²（图4）。TEER值使用包含通电电极和电压测量电极的装置（World Precision Instruments）进行测定。作为比较，已有报道显示原代脑微血管内皮细胞的TEER值为200–600 Ωcm²，而一种 commercially available 的小鼠细胞系bEnd.3的TEER值为100–140 Ωcm²（详见Abbot 2005年和Toth 等., 2011年^17,18的近期综述）。此外，在含2% FCS的分化培养基中培养4小时后，大分子物质（如不带电荷的FITC-葡聚糖，分子量分别为4、10、70和500 kDa，或分子量为300 Da的荧光素）穿过cEND单层的通透性，相较于在含10% FCS生长培养基中维持的对照细胞显著降低：荧光素的旁细胞通量降至对照细胞的30%，FITC-葡聚糖10和70 kDa的通量降至26%，而FITC-葡聚糖500 kDa的通量则降至对照细胞的4.5%。与TEER值类似，在添加糖皮质激素（GC）的培养条件下，细胞的通透性达到最低水平⁴。在进一步的研究中，我们鉴定出脑血管内皮中糖皮质激素的靶基因，包括occludin、claudin-5和VE-cadherin^4,7,9。GC处理可上调这些蛋白的表达，并促使VE-cadherin重排至细胞骨架。GC对紧密连接蛋白occludin和claudin-5的直接调控机制似乎是通过其启动子区域中的糖皮质激素反应元件实现的^4,7,19。此外，claudin-5还被鉴定为血管内皮中一种新的雌激素作用靶点¹⁰。

内皮功能障碍是多种不同疾病的基础。我们在氧糖剥夺（OGD）条件下培养cEND细胞。OGD导致血脑屏障（BBB）功能受损，而联合使用GC和蛋白酶体抑制剂硼替佐米可恢复该功能¹²。OGD条件显著增加了脑微血管内皮细胞（cerebEND）的葡萄糖摄取以及葡萄糖转运蛋白的表达，而加入NMDA受体非竞争性抑制剂MK801可减轻这一效应¹³。

图1. 脑微血管内皮细胞（cEND）分离后一周的形态学特征。 光学显微镜图像在6倍（A）和15倍（B）放大倍数下拍摄。可见呈岛状分布的内皮细胞集落。

图 2. 脑微血管内皮细胞（cEND）在分离和永生化一个月后的形态学特征。 光学显微镜图像在15倍放大倍数下拍摄。可见融合、均一的内皮细胞单层。

图3. 永生化脑微血管内皮细胞表达claudin-5、occludin和VE-cadherin。CEND细胞培养于IV型胶原包被的盖玻片上，并用针对claudin-5（A）、occludin（B）和VE-cadherin（C）的抗体进行染色。图像使用蔡司Axioscop2显微镜在40倍放大倍数下拍摄。

图 4. cEND 单层细胞跨内皮电阻（TEER）的测定。 将 cEND 细胞培养在经 IV 型胶原包被的 Transwell 小室滤膜上（孔径 0.4 μm）。待细胞达到融合状态后，使用含 2% FCS 的培养基维持培养。分别在培养 7、14 和 21 天后，利用包含通电电极和电压测量电极的装置测定 TEER 值。

讨论

所述方法可用于从不同品系的小鼠以及不同基因敲除小鼠品系中分离微血管内皮细胞，以研究血管内皮功能的特定变化。 作为一种永生化方法，我们采用了鼠多瘤病毒的癌蛋白——多瘤病毒中T抗原进行转化。该抗原可快速转化未成熟的内皮细胞 体内 和 体外 ^20,21,22文献中描述的其他内皮细胞永生化方法包括例如使用猴空泡病毒40（SV40）的大T抗原进行永生化 ²³腺病毒基因产物 E1A ²⁴ 或人端粒酶催化亚基的过表达 ³.PymT 的永生化作用特异性针对小鼠未成熟内皮细胞，可在短时间内从新生小鼠获得均一的内皮细胞培养物。永生化会改变细胞的特性，因此使用永生化细胞系获得的结果应与原代细胞或相关实验进行比较 体内 与小鼠相关。已报道PymT永生化内皮细胞表达高水平的纤维蛋白溶解活性，这是由于尿激酶型纤溶酶原激活物的产生增加以及纤溶酶原激活物抑制剂的产生减少所致。 ²⁵. 对PymT永生化bEND5细胞系与原代ECs的直接比较表明，两者均 体外 血脑屏障模型非常适合用于T细胞黏附研究 ²⁶.

根据所述方法建立的细胞系可在低代次时使用，以通过高表达血脑屏障（BBB）和内皮细胞连接蛋白来维持屏障特性，因为细胞在传代过程中会逐渐丧失这些特性。因此，当细胞失去屏障特性后，应考虑重新制备新的细胞系。内皮细胞的接种密度应较高，因为这对细胞增殖至关重要。在原代细胞分离过程以及永生化内皮细胞的培养维持过程中均需考虑这一点。每一批新建立的细胞系都应检测其屏障特性，并检测是否存在其他细胞类型的污染。可使用抗半乳糖脑苷脂、抗胶质纤维酸性蛋白和抗平滑肌抗原抗体作为一抗对内皮细胞单层进行染色，以排除少突胶质细胞、星形胶质细胞和周细胞的污染^4,27。为排除脑膜血管来源的污染，可检测血栓调节蛋白（thrombomodulin）的表达，该蛋白在全身各血管床中均有表达，唯独脑血管中不表达²⁸。

有趣的是，从不同脑区分离得到的永生化微血管内皮细胞系在屏障特性和对促炎刺激的敏感性方面存在差异。例如，可提及大脑来源的 cEND 细胞系和小脑来源的 cerebEND 细胞系^4,5。与 cEND 相比，cerebEND 中主要紧密连接组分 claudin-1 和 occludin 的表达水平较低，而 claudin-3 和 -12 的表达水平则更高。在炎症介质 TNFα 处理下，cerebEND 细胞的屏障功能受损程度显著大于 cEND 细胞⁵。小脑对炎症刺激更高的易损性在多发性硬化症患者以及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎中均可在in vivo条件下观察到²⁹。这些有趣的发现表明，有必要针对不同脑区建立并表征各自的in vitro模型，以促进未来药物向脑组织的靶向递送。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A7906	纯度 > 98%
IV型胶原蛋白	Sigma-Aldrich	C5533	50 μg/ml 溶于50 mM乙酸
胶原酶/分散酶	Roche	10269638001
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Sigma-Aldrich	D5796
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650
胎牛血清（FCS）	PAA Laboratories	A15110-1333	终浓度10%，56 °C加热灭活30分钟
L-谷氨酰胺	Biochrom AG	K0282	储存条件：≤ -15 °C
MEM维生素	Biochrom AG	K0373	储存条件：≤ -15 °C
丙酮酸钠	Biochrom AG	L0473
新霉素（G418）	PAA Laboratories	P11-012
非必需氨基酸（NEA）	Biochrom AG	K0293	4 °C保存
青霉素/链霉素	Biochrom AG	A2212	储存条件：≤ -15 °C
磷酸盐缓冲液（PBS）	Biochrom AG	L1825
聚凝胺（六亚甲基溴化铵）	Sigma-Aldrich	107689	0.8 mg/ml 溶于PBS，-20 °C保存
嘌呤霉素	Sigma-Aldrich	P8833
胰蛋白酶/EDTA	Biochrom AG	L1825	0.05% 胰蛋白酶，0.02% EDTA 溶于PBS