Method Article

作为一种工具来隔离核糖体的束缚多肽SECM逮捕序列

DOI:

10.3791/4027

⸱

June 19th, 2012

 , 
1Center for Gene Regulation in Health and Disease, Department of Biological, Geological and Environmental Sciences, Cleveland State University

In This Article

Summary

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我们在这里描述，现在经常使用的孤立稳定结合的核糖体新生肽链复合物（RNC）中的技术。这种技术发现了17个氨基酸长SECM"逮捕序列"可以停止在原核翻译延伸的优势（ E。大肠杆菌）系统，几乎所有的蛋白质（或C-末端融合）插入时。

Abstract

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广泛的研究提供了充足的证据表明，细胞中蛋白质折叠是合作转化过程1-5。不过，确切的途径来实现其功能的形式在合作转化折叠多肽链的如下仍然是一个谜。为了了解这个过程，以确定确切的翻译合作的折叠中间体构象，它是必不可少的开发技术，允许携带预定大小的新生链的RNC，让他们进一步的结构分析的隔离。

SECM（分泌显示器）是一个170个氨基酸E.大肠杆菌蛋白，调节下游SECA（SECM SECA操纵6分泌驾驶）在ATP酶的表达。 nakatogawa和伊藤最初发现了17个氨基酸组成的长序列中的SECM蛋白的C端区域（150-FSTPVWISQA QGIRAĞ的P-166）是足够的和必要的造成拖延在Gly165 SECM伸长，从而产生肽，甘氨酰-tRNA的稳定势必核糖体P位7-9。更重要的是，它被发现，这17个氨基酸的长序列可以融合到几乎所有的全长和/或截断，从而使生产的RNC携带新生链的预定大小7蛋白C-末端。因此，当融合或插入到目标蛋白质，SECM拖延序列产生的多肽链延伸逮捕，并在体内产生稳定在大肠杆菌中的RNC 大肠杆菌细胞和无细胞系统在体外 。进一步利用蔗糖密度梯度离心法分离的RNC。

孤立的RNC可以用来分析合作翻译的折叠中间体的结构和功能特点。最近，这项技术已成功地用于获得多个核糖体结合10,11新生链的结构见解。在这里，我们描述了隔离牛γ-B晶体RNCS融合SECM和在体外翻译系统生成的。

Protocol

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1。 DNA模板制备及体外转录

  1. 感兴趣的基因被克隆在任何T7和/或如SP6启动基于质粒。为了获得利益的RNC，C-末端的多肽的目标是扩大加入逮捕诱导序列的SECM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7。为了确保感兴趣的多肽片段，将挤出的核糖体隧道，目标蛋白C-末端的一部分被延长至少30个氨基酸12-14。可以推出一个灵活的富含甘氨酸，丝氨酸连接器之间的蛋白质和SECM逮捕序列，以避免任何可能的构象约束。
  2. 在体外转录，模板DNA应限制酶切割的ORF下游线性。一个需要验证完整的线性质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳上运行酶切产品。
  3. 线性血浆ID被进一步用于体外转录反应。不同浓度的DNA模板可以进行测试，以确定最佳的DNA浓度在体外转录。一般用Ambion公司的MEGAscript高产转录试剂盒（Ambion公司/生命科技，大岛，NY），1微克的线性的DNA产生40-60微克的mRNA 在体外转录完成后，制造商的指示（Ambion公司/生命科技，大岛，NY） 。
  4. 继在体外转录，mRNA的氯化锂沉淀纯化，根据制造商的指令（Ambion公司的MEGAscript高产转录试剂盒，Ambion公司/生命科技，大岛，NY）。
  5. 使用丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳进一步证实mRNA的完整性。

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Discussion

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对于重复性的结果，使用的组件， 在体外转录和翻译的质量和浓度是关键。我们已经用市售的体外转录和翻译提取的，他们给高效率和可重复性的结果，如果小心处理。质量可以影响mRNA的翻译，所以它是最重要的测试之前使用它在体外翻译的mRNA的完整性。 体外翻译的孵化时间随长度的蛋白质。此外，离心时间/速度可相应调整的情况下，70S核糖体的分数没有得到很好的解决，从50S分离。此外，核糖体结合蛋白复合物，应当谨慎处理，以避免RNase污染。此外，应仔细监测缓冲条件和螯合剂可能螯合镁+应避免。

SECM逮捕序列后，将其翻译与核糖体蛋白L4和L22的以及在核糖体23S rRNA的隧道7,8交互。一个关键的残留物，构成的SECM逮捕图案，数，F XXXX的威斯康星，XXXX GIRAGP 7（黑体字）是巨大的重要性，确保平移逮捕的效率。这些关键残基突变，或缺失可能会导致翻译延伸逮.......

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Disclosures

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没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

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这项工作是由人类前沿科学计划授予RGP0024。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
试剂名称/盒 公司 目录编号
MEGAscript T7高产转录试剂盒 Ambion公司 AM1333
转运站100大肠杆菌兴业套件 5总理 2401100
核糖核酸酶抑制剂 Invitrogen公司 15518012
反式[35]标签 MP的Biomedicals 0151006
amicon超4离心过滤单元 Millipore公司 UFC801008
存储荧光粉显影 GE医疗集团台风9410可变模式成像
密度梯度分离系统 Teledyne公司ISCO​​公司职业分类可编程密度梯度系统
蔗糖梯度岑trifugation 贝克曼舰L - 90 K制备超速离心机

References

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  1. Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).
  2. Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
  3. Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B.

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SecM Arrest SequenceRibosome Nascent Chain ComplexesIn Vitro TranslationSucrose Gradient CentrifugationCo translational FoldingBovine Gamma B CrystallinE coli Extract SystemRadioactive Amino Acid LabelingGel Electrophoresis AnalysisTranslational Arrest Technique

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