本文介绍一种目前常规用于分离稳定结合的核糖体新生肽链复合物（RNCs）的技术。该技术利用了以下发现：当一段长为17个氨基酸的SecM“阻滞序列”被插入（或融合至C末端）几乎任何蛋白质时，可在原核生物（E. coli）系统中阻断翻译延伸过程。
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摘要
摘要
大量研究提供了充分证据，表明蛋白质在细胞内的折叠是一个共翻译过程1-5。然而，多肽链在共翻译折叠过程中如何逐步形成其功能性结构的具体路径仍是一个未解之谜。为了深入理解这一过程，并确定共翻译折叠中间体的确切构象，必须建立能够分离携带预定长度新生肽链的核糖体-新生肽链复合物（RNCs）的技术，以便对其进行进一步的结构分析。
SecM（分泌监控蛋白）是一种含有170个氨基酸的 E. coli 蛋白，可调控 secM-secA 操纵子中下游SecA（驱动分泌的）ATP酶的表达6。Nakatogawa和Ito最初发现，SecM蛋白C端区域一段长为17个氨基酸的序列（150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166）足以且必需引起SecM在Gly165位点的翻译延伸停滞，从而产生稳定结合于核糖体P位点的肽基甘氨酰-tRNA7-9。更重要的是，研究发现这段17个氨基酸的序列几乎可以融合至任何全长和/或截短蛋白的C末端，从而实现携带预定长度新生肽链的核糖体-新生肽复合物（RNCs）的制备7。因此，当该序列融合或插入目标蛋白时，SecM停滞序列可导致多肽链延伸的中止，并可在 E. coli 细胞内的 in vivo 条件下以及无细胞的 in vitro 系统中生成稳定的RNCs。随后可通过蔗糖梯度离心法进一步分离纯化RNCs。
分离的核糖体-新生链复合物（RNCs）可用于分析共翻译折叠中间体的结构与功能特征。最近，该技术已成功用于揭示多种核糖体结合新生链的结构。10,11. 本文描述了在体外系统中生成的、与SecM融合的牛γ-B晶状体蛋白核糖体新生肽链复合物（RNCs）的分离方法 体外 翻译系统。
方案
1. DNA模板的制备与 体外 转录
- 目的基因被克隆至任意基于T7和/或例如SP6启动子的质粒中。为获得目标核糖体-新生肽复合物（RNCs），需在目标多肽的C末端添加SecM的阻滞诱导序列FXXXXWIXXXXGIRAGP进行延伸7为了确保目标多肽片段能够从核糖体通道中伸出，目标蛋白的C端必须至少延伸30个氨基酸。12-14可在蛋白质与SecM阻滞序列之间引入一段富含甘氨酸-丝氨酸的柔性连接子，以避免可能存在的构象限制。
- 对于 体外 转录时，应在开放阅读框（ORF）下游使用限制性内切酶对模板DNA进行线性化。需通过琼脂糖凝胶电泳检测限制性酶切产物，以确认质粒DNA完全线性化。
- 线性化质粒进一步用于 体外 转录反应。可测试不同浓度的模板DNA，以确定该反应所需的最适DNA浓度 体外 转录。通常使用 Ambion 的 MEGAscript High Yield Transcription Kit（Ambion/Life Technologies，Grand Island，NY）， 1 μg 线性化DNA可产生40-60 μg mRNA 体外 按照制造商说明进行转录（Ambion/Life Technologies，美国纽约州格兰岛）。
- 随后 体外 转录后，根据制造商说明（Ambion's MEGAscript High yield Transcription Kit, Ambion/Life Technologies, Grand Island, NY），使用氯化锂沉淀法纯化mRNA。
- 通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳进一步验证 mRNA 的完整性。
2. 体外 翻译
对于 体外 使用 RTS 100 E. coli HY 试剂盒（5 Prime，Gaithersburg，MD）进行翻译，请遵循以下步骤：
- 准备 100 μl 的 体外 根据制造商说明书进行翻译反应。简言之，将以下成分加入无核酸酶的水中 24 μl 甲硫氨酸缺失的氨基酸混合物（1 mM），10单位核糖核酸酶抑制剂（Invitrogen/Life Technologies，美国纽约州格兰岛） 20 μCi 放射性[35S]-甲硫氨酸（MP Biomedicals，Solon，OH）， 20 μl 反应混合液， 24 μl 重悬缓冲液和 24 μl 的 E. coli 裂解液
- 在指定条件下孵育反应体系 30 °C 5分钟以预热翻译反应。加入1-2 μg 将mRNA加入翻译反应体系，并在 30 °C 10-15 分钟
- 通过将翻译反应置于冰上以终止反应。
3. 新生多肽的分离 体外 翻译反应
- 为了分离核糖体-新生肽链复合物（RNCs），将翻译反应液铺在4.5 ml 5-30%蔗糖梯度溶液（含20 mM HEPES-KOH pH 7.5、15 mM MgCl2、100 mM 醋酸钾、1 mM DTT）上，使用Beckman Coulter SW55-Ti转子在4 °C条件下以41,000 rpm离心2小时。
- 离心后，通过分级收集蔗糖梯度中的各组分，以分离不同类型的核糖体群体及其相关的新生肽链。分离过程使用ISCO Programmable Density Gradient System进行监测，并通过ISCO UA-6吸光度检测器在254 nm处连续记录吸光值。
- 收集含有70S核糖体的组分，并根据实验目的进行后续分析。
4. 使用Tris-三氨酸SDS-PAGE观察与核糖体结合的蛋白质
为了检测SecM延伸蛋白是否仍与70S核糖体结合，收集梯度组分并按如下方式处理：
- 通过加入三氯乙酸（TCA）至终浓度为10%，在4 °C下过夜孵育，使各组分中的蛋白质沉淀。
- 过夜孵育后，样品在14,000 × g离心15分钟以收集蛋白质沉淀。离心后弃去上清液，并用丙酮：1 mM Tris-HCl pH 7.6（4:1）溶液洗涤沉淀两次。沉淀进一步风干后溶于SDS-PAGE上样缓冲液中。
- 处理后的样品通过Tris-三羟甲基甘氨酸（Tris-tricine）SDS-PAGE进行分离和分析。
- 电泳完成后，凝胶经固定后使用真空凝胶干燥仪干燥，并进行放射自显影。新生多肽的分布通过磷屏成像技术进行观察。
5. 代表性结果
本文介绍了一项实验，描述了从70S核糖体上稳定结合的全长牛Gamma-B晶状体蛋白的分离过程。 图1 描述了分离牛γ-B-晶状体蛋白核糖核蛋白复合物（RNCs）的步骤。γ-B-晶状体蛋白的C末端共延伸了32个氨基酸，以确保全长蛋白能够从核糖体通道中完全伸出；该延伸序列还包括位于融合多肽C末端的SecM停滞序列。随后 体外 通过蔗糖梯度离心法分离70S核糖体 （图 2.1）为了确保蛋白质稳定结合在核糖体上，将含有70S的组分合并，进行脱盐和缓冲液置换，随后再进行一轮蔗糖梯度离心 （图 2.2）. 结果显示在 图2 明确表明SecM能够高效诱导Gamma-B Crystallin核糖体新生肽链复合物（RNCs）的翻译停滞。
图1. RNCs分离过程中各步骤的示意图解。 牛γ-B晶状体蛋白的C末端被延长了32个氨基酸序列。该延长的C末端区域还包含SecM停滞序列。带有SecM序列的γ-B晶状体蛋白被克隆至pIVEX 2.3（基于T7）质粒中。为进行in vitro转录，模板DNA通过XbaI酶切线性化。线性化后的模板进一步用于in vitro转录。DNA模板中的T7启动子被T7 RNA聚合酶识别，从而转录位于T7启动子下游的γ-B晶状体蛋白基因。mRNA通过氯化锂沉淀法进行纯化。纯化后的mRNA随后用于体外翻译。孵育后，将翻译反应液铺在5-30%蔗糖梯度溶液上方，并在Beckman Coulter SW55-Ti转子中以41,000 rpm、4 °C离心2小时。
图 2. 稳定结合于 70S 核糖体的牛 Gamma-B 晶状体蛋白核糖体复合物（RNC）的分离。 将 1 μg mRNA 与 100 μl 反应体系中的 E. coli S30 提取物（如方案部分所述）混合，加入 20 μCi [35S]-甲硫氨酸，在 30 °C 下孵育 15 分钟。孵育后，将翻译反应液铺在含 20 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、15 mM MgCl2、100 mM 醋酸钾、1 mM DTT 的 5–30% 蔗糖梯度上，使用 Beckman Coulter SW55-Ti 转子在 41,000 rpm、4 °C 条件下离心 2 小时。经速度沉降后，收集梯度组分并获得核糖体图谱。数据由 PeakTrak 程序（ISCO 梯度密度梯度分级系统）记录。收集各组分，蛋白质经三氯乙酸（TCA）沉淀后，在 16.5% T、6% C 的 Tris-Tricine PAGE 凝胶上电泳分离15。凝胶干燥后进行放射自显影。曝光后使用 Typhoon 9410 成像扫描仪扫描凝胶。图 2.1 显示全长的 Gamma-B 晶状体蛋白存在于 70S 核糖体组分中。因此，SecM 停滞序列可实现稳定牛 Gamma-B 晶状体蛋白 RNC 的分离。图 2.2 中的数据明确表明所分离的 RNC 确实具有稳定性。在本实验中，第一轮蔗糖梯度离心后的 70S 组分被合并，使用 Amicon Ultra-4 离心过滤装置（Millipore）去除蔗糖，并置换为含 20 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、15 mM MgCl2、100 mM 醋酸钾、1 mM DTT 的缓冲液。该样品进一步通过 5–30% 蔗糖梯度进行第二轮离心和分级。每个组分的处理与分析方式同 图 2.1。
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讨论
为获得可重复的结果，所用组分的质量与浓度需严格控制 体外 转录和翻译至关重要。我们使用了商业可获得的 体外 转录与翻译提取物在谨慎操作下可获得高效且可重复的结果。mRNA的质量会影响翻译效果，因此在将其用于后续实验前，检测mRNA的完整性至关重要。 体外 翻译。孵育时间 体外 翻译会因蛋白质的长度不同而有所变化。此外，如果70S核糖体组分未能与50S充分分离，可相应调整离心的时间/速度。同时，应小心操作核糖体结合的蛋白质复合物，避免RNase污染。此外，应密切监控缓冲液条件，避免使用可能螯合Mg²⁺的螯合剂2+ 应避免。
SecM 停滞序列在翻译过程中会与核糖体隧道内的核糖体蛋白 L4 和 L22 以及 23S rRNA 相互作用7,8。构成 SecM 停滞基序的多个关键残基，即 FXXXXWIXXXXGIRAGP7（加粗部分），对于确保翻译停...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由人类前沿科学计划项目资助，项目编号 RGP0024。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MEGAscript T7 高产转录试剂盒 | Ambion | AM1333 | |
| RTS 100 E.coli HY 试剂盒 | 5 Prime | 2401100 | |
| 核糖核酸酶抑制剂 | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-标记物 | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Amicon Ultra-4 离心滤过装置 | Millipore | UFC801008 | |
| 储存磷屏自显影技术 | GE Healthcare | Typhoon 9410 多功能成像仪 | |
| 密度梯度分级系统 | Teledyne Isco, Inc. | ISCO 可编程密度梯度系统 | |
| 蔗糖梯度离心 | Beckman Coulter | Optima L-90 K 制备型超速离心机 |
参考文献
- Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).
- Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
- Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Protein folding on the ribosome. Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).
- Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon. J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol. Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.
- Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).
- Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).
- Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).
- Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, 905-920 (2000).
- Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. Cotranslational folding of globin. J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).
- Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 271, 990-993 (1996).
- Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro. Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).
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