本文介绍一种目前常规用于分离稳定结合的核糖体新生肽链复合物（RNCs）的技术。该技术利用了以下发现：当一段长为17个氨基酸的SecM“阻滞序列”被插入（或融合至C末端）几乎任何蛋白质时，可在原核生物（E. coli）系统中阻断翻译延伸过程。
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摘要
摘要
大量研究提供了充分证据，表明蛋白质在细胞内的折叠是一个共翻译过程1-5。然而，多肽链在共翻译折叠过程中如何逐步形成其功能性结构的具体路径仍是一个未解之谜。为了深入理解这一过程，并确定共翻译折叠中间体的确切构象，必须建立能够分离携带预定长度新生肽链的核糖体-新生肽链复合物（RNCs）的技术，以便对其进行进一步的结构分析。
SecM（分泌监控蛋白）是一种含有170个氨基酸的 E. coli 蛋白，可调控 secM-secA 操纵子中下游SecA（驱动分泌的）ATP酶的表达6。Nakatogawa和Ito最初发现，SecM蛋白C端区域一段长为17个氨基酸的序列（150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166）足以且必需引起SecM在Gly165位点的翻译延伸停滞，从而产生稳定结合于核糖体P位点的肽基甘氨酰-tRNA7-9。更重要的是，研究发现这段17个氨基酸的序列几乎可以融合至任何全长和/或截短蛋白的C末端，从而实现携带预定长度新生肽链的核糖体-新生肽复合物（RNCs）的制备7。因此，当该序列融合或插入目标蛋白时，SecM停滞序列可导致多肽链延伸的中止，并可在 E. coli 细胞内的 in vivo 条件下以及无细胞的 in vitro 系统中生成稳定的RNCs。随后可通过蔗糖梯度离心法进一步分离纯化RNCs。
分离的核糖体-新生链复合物（RNCs）可用于分析共翻译折叠中间体的结构与功能特征。最近，该技术已成功用于揭示多种核糖体结合新生链的结构。10,11. 本文描述了在体外系统中生成的、与SecM融合的牛γ-B晶状体蛋白核糖体新生肽链复合物（RNCs）的分离方法 体外 翻译系统。
方案
1. DNA模板的制备与 体外 转录
- 目的基因被克隆至任意基于T7和/或例如SP6启动子的质粒中。为获得目标核糖体-新生肽复合物（RNCs），需在目标多肽的C末端添加SecM的阻滞诱导序列FXXXXWIXXXXGIRAGP进行延伸7为了确保目标多肽片段能够从核糖体通道中伸出，目标蛋白的C端必须至少延伸30个氨基酸。12-14可在蛋白质与SecM阻滞序列之间引入一段富含甘氨酸-丝氨酸的柔性连接子，以避免可能存在的构象限制。
- 对于 体外 转录时，应在开放阅读框（ORF）下游使用限制性内切酶对模板DNA进行线性化。需通过琼脂糖凝胶电泳检测限制性酶切产物，以确认质粒DNA完全线性化。
- 线性化质粒进一步用于 体外 转录反应。可测试不同浓度的模板DNA，以确定该反应所需的最适DNA浓度 体外 转录。通常使用 Ambion 的 MEGAscript High Yield Transcription Kit（Ambion/Life Technologies，Grand Island，NY）， 1 μg 线性化DNA可产生40-60 μg mRNA 体外 按照制造商说明进行转录（Ambion/Life Technologies，美国纽约州格兰岛）。
- 随后 体外 转录后，根据制造商说明（Ambion's MEGAscr....
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讨论
为获得可重复的结果，所用组分的质量与浓度需严格控制 体外 转录和翻译至关重要。我们使用了商业可获得的 体外 转录与翻译提取物在谨慎操作下可获得高效且可重复的结果。mRNA的质量会影响翻译效果，因此在将其用于后续实验前，检测mRNA的完整性至关重要。 体外 翻译。孵育时间 体外 翻译会因蛋白质的长度不同而有所变化。此外，如果70S核糖体组分未能与50S充分分离，可相应调整离心的时间/速度。同时，应小心操作核糖体结合的蛋白质复合物，避免RNase污染。此外，应密切监控缓冲液条件，避免使用可能螯合Mg²⁺的螯合剂2+ 应避免。
SecM 停滞序列在翻译过程中会与核糖体隧道内的核糖体蛋白 L4 和 L22 以及 23S rRNA 相互作用7,8。构成 SecM 停滞基序的多个关键残基，即 FXXXXWIXXXXGIRAGP7（加粗部分），对于确保翻译停.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由人类前沿科学计划项目资助，项目编号 RGP0024。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MEGAscript T7 高产转录试剂盒 | Ambion | AM1333 | |
| RTS 100 E.coli HY 试剂盒 | 5 Prime | 2401100 | |
| 核糖核酸酶抑制剂 | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-标记物 | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Amicon Ultra-4 离心滤过装置 | Millipore | UFC801008 | |
| 储存磷屏自显影技术 | GE Healthcare | Typhoon 9410 多功能成像仪 | |
| 密度梯度分级系统 | Teledyne Isco, Inc. | ISCO 可编程密度梯度系统 | |
| 蔗糖梯度离心 | Beckman Coulter | Optima L-90 K 制备型超速离心机 |
参考文献
- Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).
- Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
- Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B.
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