流感病毒在与宿主细胞染色质相关联的情况下复制其RNA基因组。本文介绍一种从感染细胞的染色质中纯化完整病毒核糖核蛋白复合物的方法。所获得的纯化病毒复合物可通过Western blot检测其蛋白质组分，或通过引物延伸法分析其RNA组分。
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摘要
摘要
与其他负链RNA病毒一样，流感病毒的基因组以病毒核糖核蛋白复合物（vRNP）的形式包装，其中单链基因组被核蛋白（NP）包裹，并与由PA、PB1和PB2亚基组成的三聚体聚合酶复合物结合。然而，与大多数RNA病毒不同的是，流感病毒在感染细胞的细胞核内进行病毒RNA的合成。有趣的是，病毒mRNA的合成以宿主细胞的前体mRNA作为引物，已有研究提出该过程可能在染色质上进行1。此外，病毒聚合酶与宿主RNA聚合酶II之间的相互作用，以及NP与宿主核小体之间的相互作用也已被表征1,2。
近期已有研究报道，成功构建了编码重组流感病毒，该病毒的RNA聚合酶PB2亚基C末端通过基因融合方式连接了一个Strep标签（rWSN-PB2-Strep3）。这类重组病毒可用于从感染细胞中亲和纯化包含PB2的复合物，包括病毒核糖核蛋白复合体（vRNPs）。为获得纯化的vRNPs，需先感染细胞培养物，再从这些细胞的裂解物中进行亲和纯化。然而，迄今为止所使用的细胞裂解方法均基于一步式去垢剂裂解法，尽管该方法含有通用核酸酶，但仍常难以有效提取与染色质结合的物质。
我们前期的研究表明，在传统的细胞裂解过程中，大部分核内病毒核糖核蛋白复合物（vRNP）未能被提取出来，因此无法进行亲和纯化。为了提高提取效率，并分离染色质结合型与非染色质结合型的核内vRNP，我们对流感病毒感染的细胞采用了一种逐步的亚细胞提取方案。简而言之，该方法首先将细胞核从细胞中分离，然后提取可溶性核蛋白（此处称为“核质”组分）。对于剩余的不溶性核物质，使用苯甲酸酶（Benzonase，一种非特异性的DNA/RNA核酸酶）进行消化，随后进行两步盐梯度提取：首先使用150 mM NaCl（称为“ch150”），然后使用500 mM NaCl（“ch500”）（图1）。选择这些盐提取步骤是基于我们的观察结果，即500 mM NaCl足以溶解超过85%的核内vRNP，同时仍能允许带标签的vRNP与亲和基质结合。
在对感染细胞进行亚细胞分级分离后，可从各个单独的组分中亲和纯化带有PB2标签的病毒核糖核蛋白（vRNP），并分别通过Western印迹和引物延伸实验分析其蛋白质和RNA组分。近期，我们利用该方法发现，vRNP出核复合物在感染后期形成于用500 mM NaCl提取的染色质组分（ch500）上3。
方案
方案的示意图流程图见图1，试剂信息表如下所示。
1. 感染（16 - 24 小时）
- 在5个150 mm的塑料细胞培养皿中接种HeLa细胞，使用含高糖的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），使细胞在次日达到约80%的融合度（约5 × 108个细胞）。注意细胞不应达到100%融合度。
- 次日，将Strep标签标记的流感病毒原液用含0.3%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，使感染复数（MOI）为3。
- 移除细胞的生长培养基，用PBS洗涤一次，然后向细胞中加入含有病毒的10 ml PBS。在室温下孵育1小时。
- 将感染液更换为含高糖的DMEM培养基，并在37 °C继续孵育。
孵育时间的长短取决于所要研究的感染阶段（参见讨论部分）。
2. 亚细胞组分分离（3 小时）
- 用预冷的 PBS 洗涤细胞一次，然后用橡胶刮刀将细胞重悬于预冷的 PBS 中，并转移至 50 ml 锥形管中。
- 在台式离心机中以 1,000 rpm 离心 5 分钟使细胞成团，随后吸除 PBS。
- 将细胞沉淀重悬于 10 ml 预冷的蔗糖缓冲液（10 mM HEPES pH 7.9，10 mM KCl，2 mM 醋酸镁（MgOAc），3 mM CaCl2，340 mM 蔗糖，1 mM 二硫苏糖醇（DTT），1% 蛋白酶抑制剂混合物）中。悬浮后，使用连接 10 ml 塑料血清移液管的 200 μl 移液器吸头反复吹打，以打散细胞团块。
- 冰上孵育 10 分钟，期间轻轻颠倒混匀以重新悬浮细胞。
- 加入 Nonidet P-40（NP-40）至终浓度为 0.5%，高速涡旋振荡 15 秒。立即在 4 °C 下以 3,500 x g 在台式离心机中离心 10 分钟。
- 移除上清液并保存于 4 °C。此为细胞质组分。沉淀应比原始细胞沉淀更小且颜色更白。所有组分可在 4 °C 下保存至少 4 小时。
- 用 5 ml 预冷的蔗糖缓冲液洗涤沉淀，参照步骤 2.5 重新离心，并弃去上清液。
- 将沉淀（含细胞核）重悬于 1.5 ml 预冷的核质提取缓冲液（50 mM HEPES pH 7.9，150 mM KOAc，1.5 mM MgCl2，0.1% NP-40，1 mM DTT，1% 蛋白酶抑制剂混合物）中。
- 转移至预冷的 4 ml 玻璃 Dounce 匀浆器（配 tight-fitting 研杵），匀浆 20 次。
匀浆过程中避免产生泡沫。大约 10 次后阻力应有所增加。可通过相差显微镜观察确认匀浆效率。
- 将匀浆后的细胞核转移至 1.5 ml 微量离心管中，在 4 °C 下于旋转仪上孵育 20 分钟。
- 在 4 °C 下以 16,000 x g 在微量离心机中离心 10 分钟。
- 移除上清液并保存于 4 °C。此为核质组分。
- 将沉淀重悬于 1.5 ml 预热至 37 °C 的消化缓冲液（50 mM HEPES pH 7.9，10 mM NaCl，1.5 mM MgCl2，1 mM DTT，1% 蛋白酶抑制剂混合物，100 U/ml Benzonase（若用于 RNA 分析，则替换为 20 U/ml 无 RNase 的 DNase I））中，并在 37 °C 孵育 10 分钟。
- 加入 42 μl 5 M NaCl（使 NaCl 终浓度为 150 mM），继续在 4 °C 孵育 20 分钟。
- 在 4 °C 下以 16,000 x g 在微量离心机中离心 10 分钟。
- 移除上清液并保存于 4 °C。此为 ch150 组分。
- 将沉淀重悬于 1.5 ml 预冷的高盐缓冲液（50 mM HEPES pH 7.9，500 mM NaCl，1.5 mM MgCl2，0.1% NP-40，1 mM DTT，1% 蛋白酶抑制剂混合物）中，冰上孵育 20 分钟。
- 在 4 °C 下以 16,000 x g 在微量离心机中离心 10 分钟。
- 移除上清液并保存于 4 °C。此为 ch500 组分。
3. Strep-tag 纯化（2 小时）
- 向细胞质组分中加入 300 μl 的 5 M NaCl（使终浓度为 150 mM NaCl）。
- 将每份 Strep-Tactin Sepharose 珠子各 100 μl 分装至 15 ml 圆底离心管中。
- 向珠子中加入 10 倍体积的 Strep 洗涤缓冲液（20 mM HEPES pH 7.9，150 mM NaCl（ch500 样品为 500 mM NaCl），1 mM EDTA），倒置混匀，然后在台式离心机中以 1,000 × g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液，重复步骤 3.3 两次，然后将珠子沉淀重悬于等体积的 Strep 洗涤缓冲液中。
- 将 200 μl 洗涤后的 Strep-Tactin 珠子悬液分别加入各组分中（核质、ch150 和 ch500 组分使用 1.5 ml 微离心管，细胞质组分使用 15 ml 圆底离心管）。
- 在 4 °C 下旋转孵育 1 小时。
- 在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 1 分钟，弃去上清液。
- 向每管中加入 1 ml 冷的 Strep 洗涤缓冲液。将珠子从 15 mL 管（细胞质组分）转移至 1.5 mL 管中。在 4 °C 下洗涤 1 分钟，然后按步骤 3.7 进行离心。重复此洗涤步骤两次。
- 最后一次洗涤后，用平头吸头彻底去除残留的洗涤缓冲液。加入 100 μl 洗脱缓冲液（含 2.5 mM desthiobiotin 的 Strep 洗涤缓冲液），轻轻混匀。
- 冰上孵育 15 分钟，期间轻弹管底以偶尔混匀珠子。
- 在 4 °C 下以 1,000 × g 在微量离心机中离心 1 分钟，收集含有洗脱的 Strep 标签 vRNPs 的上清液。
4. 代表性结果
通过使用针对亚细胞标志物的特异性抗体对分步裂解液进行蛋白质印迹分析，是评估分步分离效率的最佳方法（图2）。具体而言，成功的核内分步分离应显示细胞RNA聚合酶II（Pol II）在核质（即可溶性核组分）中极少或几乎不存在4，而大部分Pol II应被150 mM NaCl提取出来5。与未感染细胞相比，流感病毒感染细胞中Pol II的降解现象也能够被重复观察到，这与已有文献报道一致6。
vRNP 的纯化效果最好通过银染或考马斯亮蓝染色来评估，如图3中细胞质洗脱液所示。根据我们的经验，大多数 Strep-PB2 会以完整 vRNP 的形式被纯化出来，即几乎不会捕获游离的可溶性聚合酶。这一点在银染或考马斯亮蓝染色中观察到的高 NP:PA/PB1/PB2 比例上得以体现。若该比例较低，则提示缓冲液可能被 RNase 污染，因为一些常见的 RNase（例如 RNase A）已知会以特定方式切割病毒 RNA，导致聚合酶从 NP 多聚体上解离7。有趣的是，单独使用苯扎酶（Benzonase）处理虽足以消化病毒 RNA，但对 vRNP 蛋白的化学计量比并无影响。尽管我们尚不能解释这一现象，但我们观察到使用其他 RNase 消化后 vRNP 会发生解离（数据未显示），提示苯扎酶可能保留了某些结构上重要的 RNA 区域。在从细胞质和核质（未进行核酸酶消化）纯化 vRNP 后，银染可检测到8条微弱但清晰的高分子量条带，其分子量与流感病毒8个基因组片段的预测分子量相符（见参考文献3）。
感染后9小时从各组分纯化的vRNP相对含量如图4所示。vRNP的分布随感染进程而变化，在早期时间点主要富集于ch150组分，而在晚期时间点则在核质和细胞质中的富集增加。
图1. 亚细胞分级分离流程图。改编自参考文献3。
图2. 流感病毒感染细胞亚细胞组分的Western印迹分析。将109个HeLa细胞用流感病毒株WSN感染9小时，随后进行亚细胞分级分离。每条泳道上样等量的总蛋白，并使用所示抗体进行分析。RNA聚合酶II（Pol II）使用克隆8WG16进行检测，该克隆可识别C端结构域的所有形式（其中低磷酸化条带最明显）。改编自参考文献3。
图 3. 纯化的病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）的银染分析。HeLa 细胞感染 rWSN（作为阴性对照）或 rWSN-PB2-Strep 9 小时后，从细胞质组分中进行 Strep 标签纯化。星号表示 RNase 消化后不可见的条带。改编自参考文献 3。
图4. 从不同细胞组分中纯化的vRNP的银染分析。将109个HeLa细胞用rWSN-PB2-Strep或rWSN感染9小时，随后进行亚细胞分离和Strep亲和纯化。每个组分的等量洗脱液上样。改编自参考文献3。
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讨论
尽管最近许多研究已鉴定出参与流感病毒感染的个别蛋白质或细胞网络8，但这些相互作用中大多数的功能意义仍不明确。鉴于流感病毒RNA合成对染色质相关功能的绝对依赖性，以及细胞核复杂的生物物理和生化特性9，阐明这些功能需要新的技术。本文所介绍的亚核组分分离方法，结合病毒核糖核蛋白复合物（vRNP）的亲和纯化，能够对先前难以触及的关键病毒RNA合成工厂进行表征。
文献中已描述多种亚细胞组分分离方案。我们发现，大多数传统方法会导致vRNP过早地从细胞核中泄漏，这一现象在Pol II中也有报道10。通过使用低浓度弱去垢剂NP-40对预先膨胀的细胞进行短时间孵育，可有效裂解细胞膜，同时不会引起明显的细胞核内容物泄漏。有趣的是，若使用A549和HEK293T细胞而非HeLa细胞进行亚细胞分离，则在这两种细胞系中均出现vRNP显著的核泄漏现象。将NP-40浓度降低至约0.2%可减轻该问题；然而，由于这些细胞系存在一定的变异性，最佳实验条件应通过经验确定。另一种可能的替代方案是使用非人类的流感病毒易感细胞系，例如MDCK或Vero细胞。<...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢巴斯德研究所（Institut Pasteur）的 Nada Naffakh 和 Marie-Anne Rameix-Welti 提供 rWSN-PB2-Strep 病毒。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM-高糖 | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 G | SERVA Electrophoresis | 39101 | |
| 苯甲酸酶核酸酶 | Novagen, EMD Millipore | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I，无RNase | Thermo Fisher Scientific, Inc. | EN0523 | 50 U/μl |
| 杜恩斯匀浆器 | Wheaton | 432-1271 | 使用型号 "B" 研杵 |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 也可使用50%悬浮液柱形式 |
| 脱硫生物素 | IBA GmbH | 2-1000-002 |
参考文献
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