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用于研究的人类输卵管模型 C. trachomatis 感染

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DOI：

10.3791/4036

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2012年8月11日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Lübeck, 2Institute of Anatomie, University of Lübeck, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck, 4Medical Clinic III, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck

本文内容

摘要

我们描述了一种 离体感染 用于可视化细菌病原体与人类输卵管细胞直接相互作用的模型。该全器官组织模型的建立旨在进行相关研究 C. trachomatis 在“类生命”条件下诱导女性输卵管的病理变化。

摘要

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，C. trachomatis）引起的生殖道感染是全球女性中最常见的性传播疾病。病原体清除不力或持续存在可能导致上生殖道的上行感染，并引发感染组织的慢性炎症性损伤1,2。因此，可能出现严重的临床后遗症，如盆腔炎性疾病（PID）、输卵管阻塞和不孕症3,4。

目前对C. trachomatis的大部分研究都是在上皮细胞系（例如 HEp-2 细胞和 HeLa-229 细胞）或小鼠中进行的。然而，与基于细胞培养的模型一样，这些模型既不能反映天然组织的生理状态，也无法真实再现C. trachomatis在生殖道感染中的体内病理生理过程5。此外，由于调控衣原体内在生长的关键信号通路（例如干扰素-γ介导的JAK/STAT信号通路）在小鼠与人类之间存在根本性差异，进一步限制了这些模型的应用6,7。因此，我们及其他研究团队建立了完整的输卵管器官模型，以在离体条件下研究C. trachomatis与人类输卵管细胞之间的直接相互作用8,9。

为此，收集了接受子宫切除术女性的人类输卵管组织，并用沙眼衣原体D血清型（C. trachomatis serovar D）进行感染。感染后24小时内，采用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）分析样本，以检测沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）引起的上皮损伤以及输卵管组织中C. trachomatis包涵体的形成情况。

方案

1. 准备 沙眼衣原体 D型血清型菌株

  1. 在SPG缓冲液中，用4 ml C. trachomatis D感染含有HeLa-229细胞的175 cm2细胞培养瓶（细胞已长满单层）。
  2. 在37 °C条件下振荡培养1小时。
  3. 加入20 ml含10%胎牛血清（FCS）和240 μl环己酰亚胺的DMEM培养基。
  4. 在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养48小时。
  5. 加入5 ml无菌玻璃珠，剧烈振荡以使含有C. trachomatis的HeLa-229细胞脱落并破碎。
  6. 收集上清液，并再加入5 ml无菌玻璃珠。
  7. 摇动三次，每次1分钟，以彻底破坏所有HeLa-229细胞并释放C. trachomatis。
  8. 在4 °C条件下以1000 rpmi离心5分钟，去除细胞碎片。
  9. 收集上清液，用于感染8至10个已长满HeLa-229细胞的175 cm2细胞培养瓶。
  10. 每个培养瓶中加入4 ml SPG缓冲液和4 ml前次感染所得的上清液，在37 °C持续振荡培养1小时。
  11. 1小时后，加入15 ml含10% FCS和230 μl环己酰亚胺的DMEM培养基，随后在37 °C、5% CO2条件下继续培养48小时。
  12. 加入5 ml无菌玻璃珠，振荡使含有C. trachomatis的HeLa-229细胞脱落并破碎。
  13. 收集上清液，并再加入5 ml无菌玻璃珠。
  14. 摇动三次，每次1分钟，以彻底破坏所有HeLa-229细胞并释放C. trachomatis。
  15. 在4 °C条件下以1000 rpmi离心5分钟，去除细胞碎片。
  16. 收集上清液。
  17. 将40 ml上清液分装至50 ml Falcon管中，在4 °C以11000 rpmi离心99分钟。
  18. 离心后弃去上清液，用1 ml SPG缓冲液洗涤沉淀。
  19. 将沉淀重悬于1 ml SPG缓冲液中，分装为每管20 μl至1.5 ml Eppendorf管中，于-70 °C保存备用。所制备的储备液的生物学活性已在建立的HeLa-229细胞感染模型中得到验证。

2. 人类输卵管的制备

  1. 女性因子宫切除术而切除的输卵管组织（HFT），术后应立即置于含有5% FCS但不含抗生素的RPMI培养基中，于4 °C保存直至处理。本研究方案已获吕贝克大学伦理委员会批准（编号09-153）。纳入研究的女性年龄为34至53岁，既往无C. trachomatis感染史。输卵管组织于剖宫产术中应产妇要求行围产期绝育时，或因黄体期出现症状性子宫肌瘤行子宫切除术时采集。所有HFT样本均经PCR检测确认C. trachomatis阴性。
  2. 在含有5% FCS但不含抗生素的RPMI培养基的培养皿中解剖HFT。整个操作过程中，组织必须始终浸没在培养基中，以防干燥。
  3. 切除并弃去结缔组织及手术过程中受损的组织。
  4. 解剖后，用小型手术刀小心切开HFT。
  5. 为后续实验准备大小为0.5 cm × 0.5 cm至1 cm × 1 cm的组织块。
  6. 进行感染实验时，将HFT样本置于含5% FCS但不含抗生素的1 ml RPMI培养基中。使用5.5×105 IFU（包涵体形成单位）的C. trachomatis对HFT样本进行感染。
  7. 将HFT样本分别在37 °C、5% CO2和21% O2条件下，以及37 °C、5% CO2和2% O2条件下孵育24小时。
  8. 孵育结束后收集样本，并置于Monti固定液中，在4 °C下固定至少三天，随后进行扫描电镜（SEM）/透射电镜（TEM）制样。

3. 透射电镜用HFT样本的制备

  1. 进行透射电镜观察时，将样品从Monti's固定液中取出，切成2 × 2 mm至4 × 5 mm大小的组织块。剩余组织可用于扫描电镜。
  2. 用pH 7.35的二甲胂酸钠缓冲液洗涤组织块1小时。
  3. 在1% (w/v) 四氧化锇水溶液中4℃过夜孵育。
  4. 用pH 7.35的二甲胂酸钠缓冲液清洗6次，每次5分钟，以去除多余的四氧化锇。
  5. 使用梯度浓度的乙醇水溶液（v/v）进行脱水：30%乙醇2小时，40%乙醇2小时，50%乙醇2小时，60%乙醇2小时，70%乙醇过夜，80%乙醇2小时，90%乙醇1小时，95%乙醇1小时，100%乙醇1小时。
  6. 用环氧丙烷洗涤2次，每次15分钟，随后转移至50% (v/v) 新鲜配制的Araldite（包含所有组分）与环氧丙烷的混合液中，4℃过夜孵育。
  7. 转移至新鲜配制的Araldite（包含所有组分）中，至少孵育1小时。
  8. 将样品转移至平底包埋模具中，并用Araldite充满模具。
  9. 在60 °C下使Araldite至少固化48小时。
  10. 包埋块修整后，在超薄切片机上使用玻璃刀或Histodiamond刀切取半薄切片（700 nm），并用Richardson染色法染色。
  11. 使用金刚石刀切取超薄切片（约70 nm），并转移至铜网上（例如150目方格铜网）。
  12. 在自动切片染色仪中，用0.5% (w/v) 醋酸铀在纯水中的溶液染色，随后用3% (w/v) 柠檬酸铅在纯水中的溶液染色。或者，可手动染色：将铜网置于经离心饱和的醋酸铀水溶液中染色15分钟，随后在0.3% (w/v) 柠檬酸铅水溶液中染色。

4. 扫描电镜用HFT样本的制备

  1. 进行扫描电镜观察时，将样品从Monti's固定液中取出，将其上皮面朝上置于1.5 × 1 cm的软木片上，并用昆虫针固定位置。
  2. 将带有样品的软木片转移至合适的金属篮中，用pH 7.35的二甲胂酸钠缓冲液清洗30分钟。
  3. 通过将样品依次浸入浓度递增的丙酮/水混合液（v/v）中去除水分：30%丙酮处理6小时，40%处理6小时，60%处理8小时，70%过夜，80%处理2小时，90%处理2小时，100%丙酮过夜（务必确保样品始终完全浸没）。
  4. 将样品转移至新鲜的100%丙酮中，随后采用临界点干燥法进行干燥（温度40 °C，压力80 bar）。
  5. 取出昆虫针和软木片，将样品上皮面朝上用导电碳胶粘附于配备导电碳片的扫描电镜样品台，并使用液态导电银胶增强样品台与导电碳片之间的导电性。
  6. 使用溅射镀膜仪在样品表面制备一层导电的铂、金或钯镀层。

5. 使用Richardson染色法对半薄切片进行染色

  1. 将半薄切片在载玻片上晾干。
  2. 在60 °C条件下，用染色液对切片染色1-2分钟。
  3. 用去离子水清洗。
  4. 干燥切片并封片。

6. 代表性结果

在人类输卵管感染模型中，我们能够在常氧条件下观察到未感染对照组（图1）与C. trachomatis感染的输卵管（图2）之间上皮形态的差异。特征性的形态学变化提示病原体诱导了输卵管上皮细胞的肿胀和裂解，而这些现象在未感染的对照组中未被检测到。通过半薄切片和透射电子显微镜观察，我们证实了在ex vivo感染的人类输卵管组织中存在C. trachomatis的胞内包涵体形成（图3, 5），而在未感染的对照组中则未见此现象（图4）。由于女性生殖道在生理状态下氧浓度已较低11，且在炎症过程中会进一步下降，因此我们也在低氧条件下对本模型进行了研究。初步结果表明，该模型可用于分析不同氧浓度下沙眼衣原体的生长及其子代产生情况。由衣原体引起的上皮细胞损伤需与感染前因输卵管操作或处理不当所导致的人为假象相区分（图6）。

花粉粒的扫描电子显微镜图像，展示其表面纹理和形态。
图1. 人类未感染输卵管在对照培养基中孵育一天后的扫描电子显微镜（SEM）图像（绿色箭头指示纤毛细胞，蓝色箭头指示非纤毛细胞）。

扫描电镜图像，细胞膜结构，3 μm 比例尺。
图 2. 感染后一天的人类输卵管组织中ex vivo C. trachomatis感染的扫描电镜（SEM）图像（白色箭头标记破裂的包涵体）。

组织学，细胞样本显微镜图像；细胞结构和形态分析，比例尺为10µm。
图3. 半薄切片显示人输卵管在体外感染C. trachomatis后1天典型的细胞内包涵体（白色箭头）。

电子显微镜下的细胞结构，显示细胞器和细胞膜，比例尺为5 µm。
图4. 对照培养基中孵育一天后的非感染人输卵管组织的透射电子显微镜（TEM）图像。

细胞结构显微镜图像，超微结构，透射电镜分析，细胞器，细胞生物学。
图 5. 感染后一天的人类输卵管组织中ex vivo C. trachomatis感染的透射电子显微镜（TEM）分析结果（白色箭头指示沙眼衣原体包涵体）。

显微镜，电子显微照片；细菌生物膜结构；表面形态；微生物研究；500 µm 比例尺。
图6. 由于标本制备和处理不当导致的输卵管上皮损伤的扫描电子显微镜（SEM）图像（白色箭头标记破坏的上皮组织）。

讨论

病原体感染组织所导致的损伤可视化十分困难，通常仅限于小鼠的实验性研究。我们建立了一种人输卵管组织的ex vivo感染模型，用于分析沙眼衣原体（C. trachomatis）对女性上生殖道的感染。利用该方法，我们能够在感染后一天内观察到C. trachomatis对人输卵管上皮造成的损伤。细胞肿胀和裂解是感染组织中典型的形态学改变，在C. trachomatis感染的输卵管中可见，但在未感染的对照组中则不存在。透射电镜（TEM）分析显示，衣原体在感染组织内表现出典型的胞内发育周期，可见含有再分化为原体（elementary bodies）的大包涵体，同时也存在含有体积增大的网状体（reticulate bodies）的小包涵体，后者可能提示持续性感染状态。然而，仅凭形态学特征尚不足以区分复制性感染与持续性感染，后者以代谢降低和对抗微生物药物的耐受性增强为特征10。

感染输卵管上皮细胞的破坏，是由于C. trachomatis感染的上皮细胞在完成胞内发育周期后破裂并释放出具有感染性的原体，或由于促炎性细胞因子的释放所致8。病原体引起的组织损伤以及宿主针对C. trachomatis产生的免疫反应，被认为是导致上皮细胞功能丧失、成纤维细胞重构以及最终引发输卵管性不孕的主要因素in vivo8,11。

该模型的主要局限性之一是缺乏炎症细胞，这阻碍了对C. trachomatis初次感染输卵管上皮后继发效应的分析。然而，该模型适用于研究不同环境条件（如氧含量）以及急性C. trachomatis感染中初始的宿主免疫反应8,9。下一步计划是建立一个在完整的人类输卵管中测试抗微生物药物对抗C. trachomatis的模型，并通过双光子激光扫描显微镜对在输卵管上皮中观察到的不同发育阶段的代谢状态进行表征。

致谢

本工作由德国研究基金会（DFG）卓越集群“界面炎症”（RA-If, RA-D）资助。我们感谢Kristin Wischnat提供的出色技术协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMPAAE15-843
RPMI PAAR15-802
FCSPAAA15-101
放线菌酮Sigma - Aldrich
SPG缓冲液多种来源见下方配方
Monti固定液多种来源见下方配方
二甲胂酸钠缓冲液多种来源见下方配方
Richardson染色液多种来源见下方配方

配方：

1. SPG缓冲液

  1. 加入75 g蔗糖。
  2. 加入2.47 g磷酸氢二钠。
  3. 加入0.36 g磷酸二氢钠。
  4. 加入0.72 g谷氨酸。
  5. 用去离子水定容至1 L。
  6. 调节pH至7.3。

2. 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液，pH 7.35。

  1. 加入42.80 g二甲基胂酸钠。
  2. 加入68.46 g蔗糖。
  3. 用去离子水定容至1 L，得到0.2 M二甲胂酸钠缓冲液。
  4. 使用前用去离子水稀释至所需浓度，必要时调节pH至7.35。

3. Monti固定液

  1. 加入156 ml 0.12 M二甲胂酸钠缓冲液。3.2 加入25 ml 25%戊二醛水溶液。
  2. 加入19 ml 10%多聚甲醛水溶液。
  3. 加入3 ml 3% CaCl2水溶液。
  4. 调节pH至7.35，并用去离子水定容至312 ml终体积。

4. Richardson染色液

  1. 将1%亚甲蓝的1%硼砂水溶液与1%伊红II的去离子水溶液等体积混合。

参考文献

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