理解脊椎动物中枢神经系统功能需要对大量神经元进行记录，因为皮层功能是在神经元群体水平上产生的。本文描述了一种光学方法，可实现单细胞和单动作电位分辨率的阈上神经活动记录，即抖动式随机访问扫描技术。该方法能够以高时间分辨率记录多达100个神经元的胞体荧光钙信号。通过最大似然算法，从胞体荧光钙信号中反卷积出潜在的阈上神经活动。该方法可高效率、低假阳性率地可靠检测动作电位，适用于神经元群体活动的研究 关键词：中枢神经系统，神经元群体，光学记录，单细胞分辨率，单动作电位检测，钙成像，抖动式随机访问扫描，最大似然反卷积 体外 和 在体.
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本文内容
摘要
摘要
脊椎动物中枢神经系统中的信息传递通常由神经元群体而非单个神经元完成。此外，高于阈值的放电活动传播也涉及神经元群体。因此，直接研究皮层功能的实证研究需要以高分辨率记录神经元群体的活动。本文描述了一种光学方法及去卷积算法，可实现对多达100个神经元的单细胞和单峰电活动分辨率的神经活动记录。该方法依赖于检测皮层神经元在高于阈值的电峰（动作电位）期间伴随发生的细胞内胞体钙浓度瞬时升高。通过使用声光偏转器（AODs）的快速随机访问扫描技术，实现了光学记录的高时间分辨率。1双光子激发钙敏感染料可在不透明的脑组织中实现高空间分辨率2通过最大似然法从荧光钙信号记录中重建动作电位。同步进行的电生理与光学记录结果表明，该方法能够可靠地检测动作电位>97% 的峰电位检测效率），且假阳性峰电位检测率较低（< 0.003 峰电位/秒），且具有高时间精度（约 3 毫秒） 3. 这种光学尖峰检测方法可用于记录神经活动 体外 在麻醉动物中 体内3,4.
方案
1. 光学装置（图1）
- 进行双光子激发时，需使用具有飞秒脉冲的红外脉冲激光系统。由于光学元件会引入较大的损耗，因此需要较高的激光输出功率（在某些情况下，波长为890 nm时输出功率>2W）以补偿这些损耗。
- 预啁啾系统由两个棱镜组成，可在声光偏转器（AODs）之前为激光脉冲施加负群速度色散（GVD），以补偿AODs引入的时间色散1。
- 两个具有大孔径的声光偏转器（AODs）（对于数值孔径NA为0.8的40倍水浸物镜，孔径为10 mm）可在二维方向上偏转激光束。
- 在AODs后方13 cm处放置一个每毫米100条刻线的反射式衍射光栅，用于在使用短激光脉冲时补偿AODs引入的空间色散。
- 通过两个中继望远镜将激光束导入直立显微镜的相机端口。
- 在光路中定期放置光阑，用于对光学元件进行对准。
- 物镜前方的二向色分光镜将红外激发光透射至样品，并将样品发出的荧光反射至探测器。
- 背向和透射荧光探测器（光电倍增管，PMTs）通过物镜收集荧光信号，若适用，也可通过聚光镜收集。
- 在探测器前方放置彩色玻璃滤光片（BG-39，3–5 mm），以防止激发光到达探测器。
- AOD偏转角度由配备有数模转换器板卡（时钟频率为156.25 kHz）的计算机控制，该板卡进而驱动压控振荡器。
- 光电倍增管输出的信号经由一个低通巴特沃斯滤波器....
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讨论
抖动式随机访问扫描通过检测神经元胞体内每个动作电位所引发的细胞内钙离子浓度升高，间接探测超阈值放电活动。细胞内钙离子浓度的升高由荧光钙染料进行检测。抖动式随机访问扫描的局限性主要源于钙荧光信号的信噪比较低。而信噪比又受到光损伤的限制，因此无法使用高激发频率。由于信噪比有限，某些神经元中的动作电位检测会失败，且在持续性或高频放电活动中的检测也可能失败。例如，在记录过程中 体内，当放电频率在 40 Hz 及以上时，尖峰检测显著降低 4尖峰检测减少的原因在于，随着峰间间隔变短，正确模型与错误模型之间的似然性差异变得越来越小。此外，抖动式随机访问扫描仅适用于胞体钙信号升高与放电活动高度相关的神经元群体7 这并不适用于所有脑区和细胞类型（例如蝌蚪嗅球中的颗粒细胞）8).
作为此处所用光学设计的替代方案，可以使用单个棱镜来补偿声光偏转器（AOD）的空间和时间色散，而无需使用两个棱镜和一个衍射光栅4,9。单棱镜设计的优点是激光功率的透过率更高。作为此处所用频率发生器模拟控制的替代方案，也可采.......
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致谢
感谢 Randy Chitwood 博士对稿件的审阅。本工作由 Whitehall 基金会和 Alfred P. Sloan 基金会授予 HJK 的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 光学元件按从激光器开始的顺序列出 | |||
| 钛：蓝宝石激光器 | Coherent 公司 | Chameleon Ultra 2 | 建议使用高功率输出（>2W，900 nm） |
| 消色差透镜 f = 30 mm | Thorlabs 公司 | AC254-030-B | 650–1050 nm 范围的抗反射（AR）涂层 |
| 消色差透镜 f = 100 mm | Thorlabs 公司 | AC254-100-B | AR 650–1050 nm |
| 透镜 f = 75 mm | Thorlabs 公司 | LA1608-B | AR 650–1050 nm |
| 透镜 f = 175 mm | Thorlabs 公司 | LA1229-B | AR 650–1050 nm |
| 消色差透镜 f = 300 mm | Thorlabs 公司 | AC254-300-B | AR 650–1050 nm |
| 消色差透镜 f = 100 mm | Thorlabs 公司 | AC254-100-B | AR 650–1050 nm |
| 消色差透镜 f = 100 mm | Thorlabs 公司 | AC254-100-B | AR 650–1050 nm |
| 声光偏转器 | IntraAction 公司 | ATD 6510CD2 | |
| 反射式衍射光栅 | Newport 公司 | 53-011R | 100 条/mm，适用于带宽为 65 MHz、扫描角为 45 mrad 的声光偏转器 |
| 21.6 mm 布儒斯特棱镜 | Lambda Research Optics 公司 | IBP21.6SF10 | |
| 有色玻璃 | Schott 公司 | BG-39 | |
| 二向色镜 | Chroma Technology 公司 | Z532RDC | |
| 光电倍增模块 | 滨松公司 | H9305-03 | |
| DAC-ADC 板卡 | 国家仪器公司 | PCI-6115 | |
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen 公司 | O-6807 |
参考文献
- Iyer, V., Hoogland, T. M., Saggau, P. Fast functional imaging of single neurons using random-access multiphoton (RAMP) microscopy. J. Neurophysiol. 95, 535-545 (2006).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science<....
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