以单细胞和单峰分辨记录超阈值神经活动的光学成像

摘要

理解脊椎动物中枢神经系统功能需要对大量神经元进行记录，因为皮层功能是在神经元群体水平上产生的。本文描述了一种光学方法，可实现单细胞和单动作电位分辨率的阈上神经活动记录，即抖动式随机访问扫描技术。该方法能够以高时间分辨率记录多达100个神经元的胞体荧光钙信号。通过最大似然算法，从胞体荧光钙信号中反卷积出潜在的阈上神经活动。该方法可高效率、低假阳性率地可靠检测动作电位，适用于神经元群体活动的研究 关键词：中枢神经系统，神经元群体，光学记录，单细胞分辨率，单动作电位检测，钙成像，抖动式随机访问扫描，最大似然反卷积 体外 和 在体.

摘要

脊椎动物中枢神经系统中的信息传递通常由神经元群体而非单个神经元完成。此外，高于阈值的放电活动传播也涉及神经元群体。因此，直接研究皮层功能的实证研究需要以高分辨率记录神经元群体的活动。本文描述了一种光学方法及去卷积算法，可实现对多达100个神经元的单细胞和单峰电活动分辨率的神经活动记录。该方法依赖于检测皮层神经元在高于阈值的电峰（动作电位）期间伴随发生的细胞内胞体钙浓度瞬时升高。通过使用声光偏转器（AODs）的快速随机访问扫描技术，实现了光学记录的高时间分辨率。¹双光子激发钙敏感染料可在不透明的脑组织中实现高空间分辨率²通过最大似然法从荧光钙信号记录中重建动作电位。同步进行的电生理与光学记录结果表明，该方法能够可靠地检测动作电位>97% 的峰电位检测效率），且假阳性峰电位检测率较低（< 0.003 峰电位/秒），且具有高时间精度（约 3 毫秒） ³. 这种光学尖峰检测方法可用于记录神经活动 体外 在麻醉动物中 体内^3,4.

方案

1. 光学装置（图1）

1. 对于双光子激发，需使用具有飞秒脉冲的红外脉冲激光系统。由于系统光学元件会引入较大的损耗，因此需要较高的激光输出功率（在某些情况下，在890 nm波长下超过>2 W）以补偿这些损耗。
2. 由两个棱镜组成的预啁啾系统在声光偏转器（AODs）之前对激光脉冲施加负的群速度色散（GVD），以补偿AODs引入的时间色散¹。
3. 两个具有大孔径（对于数值孔径NA为0.8的40倍水浸物镜，孔径为10 mm）的AODs在二维方向上偏转激光束。
4. 在AODs后方13 cm处放置一个每毫米100条刻槽的反射式衍射光栅，用于在使用短激光脉冲时补偿AODs引入的空间色散。
5. 通过两个中继望远镜将激光束导入直立显微镜的相机端口。
6. 在光学元件之间定期放置光阑，用于对光学元件进行对准。
7. 物镜前方的二向色镜将红外激发光透射至样品，并将样品发出的荧光反射至探测器。
8. 背向和透射荧光探测器（光电倍增管，PMTs）通过物镜收集荧光信号，若适用，也通过聚光镜收集。
9. 在探测器前方放置彩色玻璃滤光片（BG-39，3–5 mm），以防止激发光到达探测器。
10. AOD偏转角度由配备数字-模拟转换器板（时钟频率为156.25 kHz）的计算机控制，该转换器板进而驱动压控振荡器。
11. 光电倍增管输出的信号经由低通巴特沃斯滤波器（截止频率100 kHz）传递，并通过模拟-数字转换器（时钟频率156.25 kHz）进行数字化，随后存储于计算机中以供分析。
12. 通过记录在有无激光照射、光电倍增管高低增益设置以及有无指示剂条件下的荧光信号分布，来检测对准情况和电噪声。当在高增益且存在指示剂条件下荧光信号分布的宽度明显大于其他条件下荧光信号分布的宽度时，表明扫描系统已正确设置并得到良好屏蔽（图2）。

2. 实验步骤

1. 抖动式随机访问扫描依赖于细胞内钙离子浓度升高的检测。可通过团注法将钙离子指示剂的酯化形式（例如 Oregon Green 488 Bapta-1 AM）注入神经组织，从而对大量神经元进行染色⁵。
2. 从每个神经元胞体的多个位置进行记录，每个位置记录短暂时间（“抖动”，4 个位置，每个位置 6.4 μsec = 每个周期中每个神经元的记录时间为 25.6 μsec，图 3C）。为选定目标神经元，首先获取一个由 256×256 像素组成的全帧图像（图 3A）。在此图像中手动选择待记录的每个神经元胞体的中心位置，控制软件将自动在该中心周围距离 2 μm 处添加三个点。
3. 在每个周期中，从 40 个神经元分别记录荧光信号（图 3B）。此过程在整个记录期间重复进行（5 秒记录 = 3,255 个周期，1 个周期 = 1.536 msec）。

3. 用于提高尖峰检测效率的在线软件工具

1. 从荧光胞体钙信号中检测尖峰依赖于胞体荧光钙信号的高信噪比（S/N）。通过提高激发强度可实现高信噪比，但激发强度的增加受限于光损伤效应，只能在一定范围内进行。仅在激发强度的一个极小范围内，才能实现高效的尖峰检测，此时荧光信号具有高信噪比，同时几乎不产生光损伤³。为确保记录期间信号始终处于高尖峰检测效率的范围内，我们通过在线分析监测光子速率（见公式3.2）以及基线荧光的下降情况。
2. 单个神经元的近似光子速率通过基线噪声的短时间窗口（100–200 ms）计算获得。通过将相对荧光变化的分布（σ）拟合至以下公式，由荧光值计算出光子数（N_λ）和光子速率（λ = N_λ / Δt）：

该方程表示光子散粒噪声的泊松分布，通过变量变换表示为相对荧光变化：ΔF/F = (G*N_λ(t)-G*N_λ,0)/G*N_λ,0 其中 G 表示光电倍增管及所有其他电子组件的总增益。需要注意的是，该方程无法准确确定所探测光子的数量 体内 记录，因为除了光子散粒噪声外，还存在其他噪声来源（如运动伪影）。尽管如此，该方程仍有助于 体内 记录以估算噪声。

3. 基线荧光根据相同的时间窗口计算，并作为时间或试验次数的函数进行绘制。通过调节激光功率，使基线的平均下降速率保持在每秒0.0002以下，因为超过此限值时，动作电位检测效率会迅速下降。
4. 每10至20分钟，通过重新获取全帧图像来确认神经元胞体的位置。如有需要，可对记录位置进行调整。位置调整可同时针对所有神经元，也可针对单个神经元进行。

4. 从荧光信号重建尖峰时间（反卷积）

1. 由神经活动引起的荧光信号常在时间上发生叠加，因为钙瞬变的衰减时间较长（数百毫秒）。去卷积方法可从荧光信号中重建出动作电位及其发生时间。
2. 为确定最可能产生所记录荧光信号的动作电位序列，需比较不同模型。本文采用遗传算法确定具有最大似然性的模型——从而确定对应的动作电位序列及其发生时间。
3. 在异质性神经元群体中，动作电位引发的钙信号在不同神经元之间可能存在差异。为实现对数据集的无监督分析，我们设计了一种算法，可考虑神经元之间动作电位引发钙信号的变异情况。
4. 为避免大量假阳性检测结果，有必要限制动作电位引发钙信号模型中允许的振幅和衰减时间常数范围。单次动作电位引发的钙瞬变的振幅与衰减时间常数的联合分布，需在相同类型神经元、相同实验条件下，通过同步的电生理与光学记录在独立实验中获取。
5. 为校正缓慢的基线漂移并降低去卷积长时程记录的计算成本，较长的记录被分割为多个1-5秒的较短片段。
6. 对每个神经元和每次记录，去卷积算法可能需测试大量模型（多达1,000,000个或更多）。为加快去卷积速度，单个实验可在最多10台计算机上并行处理。
7. 去卷积完成后，对动作电位数据进行分析与检查。自动计算每神经元的刺激前-后时间直方图、动作电位概率及放电率（单位神经元平均动作电位数）。

5. 代表性结果

成功的动作电位检测依赖于记录到的荧光胞体钙信号具有较高的信噪比。单纯使用高激发速率（高激光功率）可能会对生物样本产生光效应的不利影响（光损伤）。在抖动式随机访问扫描中，光损伤表现为基线荧光的降低以及动作电位诱发的钙荧光信号减弱。诱发信号的下降可迅速导致动作电位无法被检测到。只有在很小的激发强度范围内，才能实现从荧光信号中高效检测动作电位。该范围的上限受光损伤限制，下限则因荧光信号信噪比较低而受限。对于急性脑片中的皮层神经元，我们在距离脑片表面约100 μm深处进行记录时，所使用的激光功率可产生大约400,000–1,500,000 光子/秒的光子速率。当使用高亲和力指示剂（如 Oregon Green 488 BAPTA-1）时，该信号强度足以检测单个动作电位。图3E展示了在极低激发速率下记录的荧光信号示例、处于检测窗口范围内的记录示例，以及在极高激发速率下的记录示例。

与其他能够以单细胞和单峰电活动分辨率记录神经活动的技术相比，抖动式随机访问扫描可以从相同局部神经元群体中记录更多数量的神经元，且相较于螺旋电极/多电极记录更具较低的侵入性。因此，抖动式随机访问扫描可用于记录大量神经元的神经活动，以测量由超阈值活动所传递的互信息⁶（图4A）、神经元群体中神经活动的变化（皮层可塑性），以及超阈值活动在神经元群体中的传播过程¹⁴（图4B）

图 1. 抖动式随机访问扫描装置的光学设计。

图 2. 校准与测试：在不同条件下记录的荧光信号分布。A) 无激光照射且光电倍增管（PMT）增益较低时的信号分布；B) 在较高PMT增益下但无激光照射时，由于光电倍增管的暗电流，信号分布更宽；C) 开启激光并在高PMT增益下记录的信号分布。若此分布与B图所示分布之间存在差异，则表明激发光已到达PMT探测器；D) 从神经元胞体在高增益下记录的荧光信号分布。若无其他噪声源贡献，该分布仅由光子散粒噪声产生。

图 3. A) 全视野荧光图像，用于检测并选择神经元胞体的位置；B) 一个周期的扫描路径；C) 抖动原理示意图：在每个胞体（圆形）内，光束移动至下一个胞体前会记录多个位置的数据；D) 两个D/A通道输出的示意图。对于每个神经元胞体，从胞体内4个不同位点（s1-s4）记录荧光信号。每个位点的位置由其x和y坐标确定。所有位点及所有神经元的x和y坐标按顺序发送至数模转换器。当光束在两个神经元胞体之间移动时，不采集信号（空白）；E) 荧光信号示例。注意，每个示例显示的是单个动作电位的响应（通过细胞贴附式电生理记录测得）。

图 4. 使用抖动式随机访问扫描研究皮层功能。A) 测量由神经元群体传递的互信息。上方图像显示急性脑切片的显微照片，以及两个刺激电极放置在同一皮层第4层（L4）的同一皮层柱内。中间图表显示每次刺激重复时的神经响应。下方图表显示记录到的神经元群体所传递的香农互信息。B) 测量皮层神经元群体之间超阈值放电活动（信号传播）的传播。上方图表说明实验设计，中间图像显示荧光图像，虚线表示桶状结构边界，下方图表显示对丘脑皮层纤维电刺激（三角形）所引发的检测到的放电事件。

讨论

抖动式随机访问扫描通过检测神经元胞体内每个动作电位所引发的细胞内钙离子浓度升高，间接探测超阈值放电活动。细胞内钙离子浓度的升高由荧光钙染料进行检测。抖动式随机访问扫描的局限性主要源于钙荧光信号的信噪比较低。而信噪比又受到光损伤的限制，因此无法使用高激发频率。由于信噪比有限，某些神经元中的动作电位检测会失败，且在持续性或高频放电活动中的检测也可能失败。例如，在记录过程中 体内，当放电频率在 40 Hz 及以上时，尖峰检测显著降低 ⁴尖峰检测减少的原因在于，随着峰间间隔变短，正确模型与错误模型之间的似然性差异变得越来越小。此外，抖动式随机访问扫描仅适用于胞体钙信号升高与放电活动高度相关的神经元群体⁷ 这并不适用于所有脑区和细胞类型（例如蝌蚪嗅球中的颗粒细胞）⁸).

作为此处所用光学设计的替代方案，可以使用单个棱镜来补偿声光偏转器（AOD）的空间和时间色散，而无需使用两个棱镜和一个衍射光栅^4,9。单棱镜设计的优点是激光功率的透过率更高。作为此处所用频率发生器模拟控制的替代方案，也可采...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
光学元件按从激光器开始的顺序列出
钛：蓝宝石激光器	Coherent 公司	Chameleon Ultra 2	建议使用高功率输出（>2W，900 nm）
消色差透镜 f = 30 mm	Thorlabs 公司	AC254-030-B	650–1050 nm 范围的抗反射（AR）涂层
消色差透镜 f = 100 mm	Thorlabs 公司	AC254-100-B	AR 650–1050 nm
透镜 f = 75 mm	Thorlabs 公司	LA1608-B	AR 650–1050 nm
透镜 f = 175 mm	Thorlabs 公司	LA1229-B	AR 650–1050 nm
消色差透镜 f = 300 mm	Thorlabs 公司	AC254-300-B	AR 650–1050 nm
消色差透镜 f = 100 mm	Thorlabs 公司	AC254-100-B	AR 650–1050 nm
消色差透镜 f = 100 mm	Thorlabs 公司	AC254-100-B	AR 650–1050 nm
声光偏转器	IntraAction 公司	ATD 6510CD2
反射式衍射光栅	Newport 公司	53-011R	100 条/mm，适用于带宽为 65 MHz、扫描角为 45 mrad 的声光偏转器
21.6 mm 布儒斯特棱镜	Lambda Research Optics 公司	IBP21.6SF10
有色玻璃	Schott 公司	BG-39
二向色镜	Chroma Technology 公司	Z532RDC
光电倍增模块	滨松公司	H9305-03
DAC-ADC 板卡	国家仪器公司	PCI-6115
Oregon Green 488 Bapta-1 AM	Invitrogen 公司	O-6807