利用超声波血脑屏障破坏结合锰增强磁共振成像进行功能性神经影像学研究

摘要

本文描述了一种利用微泡和超声在小鼠中广泛开放血脑屏障的技术。通过该技术，可将锰递送至小鼠脑内。由于锰是一种可在去极化神经元中蓄积的磁共振成像（MRI）对比剂，该方法可实现对神经元活动的成像。

摘要

尽管小鼠是研究神经科学遗传和分子基础的主要模型系统，但在小鼠中进行功能性神经成像仍面临技术上的挑战。其中一种方法——激活诱导的锰增强磁共振成像（Activation-Induced Manganese-enhanced MRI, AIM MRI）已成功用于绘制啮齿类动物的神经元活动^1-5。在AIM MRI中，Mn²⁺作为钙的类似物，在去极化的神经元中积累^6,7。由于Mn²⁺可缩短组织的T₁弛豫时间，因此神经元活动增强的区域在磁共振成像中会表现出信号增强。此外，Mn²⁺从激活区域清除较慢，因此可在成像前于磁体外进行刺激，从而提高实验的灵活性。然而，由于Mn²⁺难以穿过血脑屏障（BBB），必须打开血脑屏障的操作限制了AIM MRI的应用，尤其是在小鼠中的使用。

开放血脑屏障（BBB）的一种工具是超声。尽管超声可能具有损伤性，但如果将其与充满气体的微泡（即超声造影剂）联合使用，则打开BBB所需的声压显著降低。这种超声与微泡的组合可被用于可靠地开放血脑屏障，同时不引起组织损伤^8-11。

本文介绍了一种利用微泡和超声波开放血脑屏障（BBB）来实施活体脑功能磁共振成像（AIM MRI）的方法。在静脉注射全氟丁烷微泡后，对剃毛的小鼠头部施加非聚焦脉冲超声束，持续3分钟。为简便起见，我们将这种利用微泡和超声开放血脑屏障的技术简称为BOMUS¹²。通过BOMUS技术开放双侧大脑半球的血脑屏障后，使锰离子进入全脑。在对轻度镇静的小鼠进行实验刺激后，采用AIM MRI来绘制神经元反应图谱。

为了验证该方法，本文采用BOMUS和AIM MRI技术，在轻度镇静的小鼠中绘制单侧胡须机械刺激的脑激活图谱¹³。由于BOMUS可使双侧半球的血脑屏障均开放，因此未受刺激的大脑半侧可用于控制非特异性背景刺激的影响。所得的三维激活图谱与已发表的桶状皮层胡须区分布图高度一致¹⁴。超声开放血脑屏障具有快速、无创和可逆的特点，因此该方法适用于清醒小鼠的高通量和/或纵向研究。

方案

1. 组装并校准超声系统

1. 超声系统采用一个单元素超声换能器，其直径足以覆盖小鼠脑部，中心频率在2 MHz范围内。该换能器由一个50 dB功率放大器驱动，放大器连接至信号发生器，由后者产生超声脉冲序列。
2. 为校准超声系统的声压，使用水听器将施加的电压与产生的声压相关联。将换能器置于水箱中，并位于水听器正上方。向换能器施加一个简单脉冲（例如，以换能器频率产生的10周期正弦波，脉冲重复频率为10 Hz）。利用三轴平移台寻找峰值响应，该峰值应位于超声波束中心、换能器自然焦距处（对于本实验所用直径为13 mm、频率为2.15 MHz的换能器，焦距约为60 mm）。
3. 在输入电压范围（例如 50–400 mV）内进行多次测量_pp）以验证系统的线性度。采用简单的线性回归方法估算输入电压与声压之间的关系。在本系统中，输入电压分别为 258 和 167 mV_pp 对应于峰值负声压为0.52和0.36 MPa。
4. 将信号发生器设置为产生超声脉冲序列，该序列为在换能器频率下的正弦脉冲串，每串包含50000个周期，脉冲串周期为64 ms。根据校准测量结果，调节脉冲幅度，使换能器自然焦点中心处的峰值负声压达到0.36 MPa。

2. 准备试剂

1. 将四水合氯化锰（MnCl₂·4H₂O）溶于无菌水中，配制成100 mM（300 mOsM）浓度的溶液，并通过滤膜除菌。
2. 使用厂家提供的振荡器“激活”试剂瓶中的全氟丙烷脂质微球，振荡时间为45秒。在实验当天，可在开始时激活一瓶试剂，之后当天其余时间使用时无需再次激活。
3. 在注射微球前立即用手振荡试剂瓶1分钟，以重新悬浮微球。从瓶中抽取微泡时，切勿向瓶内注入室温空气，以免破坏剩余的微泡。试剂瓶在当天最后一次使用前应保持在室温下，当天使用结束后应置于冰箱中保存。按此方式保存时，单瓶试剂可使用数天。在后续使用日的首次使用前，需将储存的试剂瓶重新放入振荡器中激活。

3. 动物准备

1. 使用鼻罩输送异氟烷对动物进行麻醉。鼻罩装置应能够每次都将动物头部精确且稳定地固定在相同位置。我们的设备¹⁵可使头部保持在“颅骨水平”位置（即背侧颅骨表面水平），该位置与Paxinos脑图谱¹⁶中所采用的位置一致。调整麻醉剂量以维持呼吸频率在每分钟85至125次之间。使用加热灯或吹暖风维持动物体温。用润滑剂保护眼睛。
2. 使用电动剃毛器去除小鼠头皮上的毛发。
3. 放置尾静脉导管和腹腔（IP）导管。对于需存活的实验，务必采用适当的无菌技术；本文视频中展示的腹腔导管放置方法仅适用于非存活实验。
4. 进行神经刺激实验所需的其他准备工作。若需绘制胡须刺激对桶状皮层的激活图谱，可使用解剖显微镜和显微外科剪刀，尽可能贴近皮肤表面剪除胡须，避免刺激毛囊或周围皮肤。
5. 在头皮上涂抹超声耦合凝胶，然后将由一层薄塑料膜（例如厚度为7.6 μm的垃圾袋衬里）包裹的水柱轻轻置于头部。通过水柱用棉签伸入并排出超声凝胶中可能滞留的气泡。将超声换能器置于其自然焦距（58 mm）处，正对小鼠脑部，并位于水柱正上方，用指尖擦拭换能器表面以去除残留的气泡。

4. 采用微泡与超声波开放血脑屏障（BOMUS）

1. 以 0.5 mmol/kg 的剂量经腹腔注射锰溶液。封闭腹腔导管以防止锰溶液流出，等待 10 分钟使其充分分布（图 1）。
2. 为开放血脑屏障，通过尾静脉导管注射 30 μL 全氟丁烷脂质微球（激活的 DEFINITY），同时启动超声脉冲序列。持续超声照射 3 分钟。

5. 神经元刺激

1. 在开始神经刺激前，留出约 40 分钟时间，使脑内 Mn²⁺ 水平趋于稳定。这样可将因 Mn²⁺ 经血脑屏障（BBB）扩散所致的显著基础增强信号，与刺激引起的细微差异性增强信号区分开来。随后，采用选定的刺激范式开始刺激（图 1）。
2. 进行胡须刺激时，关闭异氟烷，移除鼻罩。用手持软毛画笔，在距离皮肤约 2–5 mm 处，以圆形轨迹（1–5 Hz）穿过胡须阵列进行手动刺激，持续 90 分钟。锰具有镇静作用，因此可对动物进行无束缚刺激。若动物出现躁动，可通过鼻罩给予 5% 异氟烷，持续约 15 秒。

6. 磁共振成像

1. 刺激后，通过鼻罩恢复麻醉。继续维持体温，并调整异氟烷浓度，使呼吸频率保持在每分钟85至125次。
2. 将小鼠放入磁共振成像线圈中，并转移至MRI系统。采集高分辨率三维T₁加权磁共振图像。例如，采用三维扰相梯度回波（SPGR）序列，参数如下：重复时间为25 ms；回波时间为2 ms；翻转角为30度；带宽为15.63 kHz；视野为20 × 20 × 12 mm；矩阵为128 × 128 × 60。

7. 图像分析

1. 图像分析需根据所采用的刺激范式进行特定处理。对于胡须刺激实验（图2），将多个动物的图像导入合适的分析环境。若部分动物为右侧刺激，而另一些为左侧刺激，需对部分图像进行翻转，使所有图像均等效为“左侧刺激”。随后，为比较每个大脑的刺激侧与其对侧未刺激侧，需创建一组复制并镜像的左侧未刺激图像。将所有图像配准至同一空间，并使用3 × 3 × 3像素的高斯核进行平滑处理。
2. 将数据导出至数学分析环境（如MATLAB）。可选地，对数据集中无关解剖结构进行掩膜处理。采用Venot et al.^17,18 提出的迭代法对图像进行强度归一化。
3. 采用配对单尾t检验，比较每个大脑刺激侧的每个体素与其对应对侧未刺激侧的相应体素。
4. 显示所得p值图，以识别差异性活动区域（图3）。

8. 代表性结果

本文介绍的方法包含两个基本步骤：（1）利用微泡和超声波开放血脑屏障（BOMUS）；（2）激活诱导的锰增强磁共振成像（AIM MRI）。由于后一步骤依赖于前一步骤，因此验证BOMUS是否成功实施至关重要。

注射T₁弛豫缩短型对比剂（如锰剂或基于钆的对比剂）后，血脑屏障被破坏，与未进行BOMUS处理的脑组织相比，T₁加权成像上脑实质信号增强（图4）。这种锰增强效应的分布并非完全均匀，但在不同动物之间具有较高的一致性。该分布特征不仅反映了血脑屏障开放的不均一性，也体现了锰在脑内固有的非均匀分布特性¹⁹。血脑屏障开放的空间和时间动态特性此前已有进一步描述¹²。

在成功实施BOMUS后，下一步是进行AIM MRI。虽然可以采用多种实验范式，但由于存在诸多潜在的混杂因素，必须仔细设计对照和分析方法。混杂因素包括血脑屏障（BBB）开放不均、锰（Mn）在脑内蓄积不均、Mn扩散的时间动力学以及非特异性神经元活动。在本演示中，通过单侧刺激胡须来映射神经元反应。为校正不均匀性和Mn通量的影响，每个大脑未受刺激的一侧被用作内部对照。为消除可能在不同动物间变化的非特异性神经元活动的影响，分析采用统计检验以识别在各动物间具有一致差异的脑区（图2）。结果得到一个三维差异图和一个三维p值图（图3），其中右侧显示的是相对于刺激侧胡须对侧信号更高的脑区，左侧则显示相对于刺激侧同侧信号显著更高的脑区。p值图识别出一个在对侧显著增强的信号区域，该区域对应于初级感觉皮层的桶状皮层（barrel field），其对胡须刺激的反应已在电生理学^20,21和2-脱氧葡萄糖研究中被广泛记录。这些结果的更详细讨论此前已有发表¹³。

图1. 采用BOMUS与AIM MRI进行功能神经成像的实验流程时间线（改编自Howles et al. ¹³）。

图 2. 用于识别每个大脑受刺激侧与未受刺激侧之间信号强度差异区域的分析方案。为了将每个大脑的受刺激侧与其对侧未受刺激侧进行比较，需创建一组复制并镜像的左侧未受刺激图像。这些图像经过配准、滤波和归一化处理。最后，通过t检验比较左侧受刺激图像与左侧未受刺激图像。该t检验为“配对”设计，即每个大脑的受刺激侧仅与其自身同一大脑的未受刺激侧进行比较。t检验采用“单尾”检验，因此p值图的一侧表示大脑受刺激侧信号显著升高，而p值图的另一侧则表示未受刺激侧信号显著升高（改编自 Howles et al. ¹³）。

图3. 对7只动物在两个不同轴向位置进行汇总分析的结果。第一列显示所有配准图像的平均值，所有小鼠均接受左侧须部刺激。这些图像叠加了颜色图谱，表示每个体素相对于对侧半球信号的平均百分比增加，颜色条所示。图像右侧的着色区域表示刺激对侧半球信号较高；左侧的着色区域表示刺激同侧半球信号较高。第二列显示相同的图像，叠加了p值图谱，表示信号增加的统计学显著性。第三列显示相同的p值图谱叠加在Paxinos立体定位图谱¹⁶的相应图示上，感觉皮层的桶状区已标出阴影（改编自Howles et al. ¹³）。

图 4. 脑内 Mn²⁺ 的空间分布。图像采集于腹腔注射 0.5 mmol/kg MnCl₂ 后 170 分钟，来自 BOMUS 处理组（n=5）和对照组（n=4）的小鼠。归一化后，计算得到均值和标准差图谱（左图）。BOMUS 处理组小鼠的信号增强更明显。尽管这种增强在脑内并非完全均匀，但在脑边缘和脑室附近外，整体分布较为一致。通过在不同结构周围绘制感兴趣区域（ROIs），计算每组的平均信噪比（SNR，+1 SD）（右图）。BOMUS 处理组动物表现出更高的信噪比，但不同结构间及个体间的变异也更大（改编自 Howles et al. ¹³）。

图 5. 为评估 BOMUS 对组织的影响，将接受 BOMUS 处理的小鼠脑组织固定后，以 500-μm 间隔切片，并用苏木精和伊红染色。图中显示了在声学压力分别为 0.36 MPa（n = 3）、0.52 MPa（n = 4）和 5.0 MPa（n = 1）时，每张脑切片中平均出现的红细胞外渗数量。误差线表示标准误。第二幅图展示了暴露于 5.0 MPa 声学压力下脑组织中严重红细胞外渗的示例（改编自 Howles et al. ¹²）。

图6. 采用定量行为学测试评估动物在麻醉前以及麻醉后3小时和24小时的活动性、觉醒程度和反应性。所用评分系统此前已有描述¹²，其基于Irwin于1968年建立的小鼠定量行为评估方法²²。图中显示了对照组（n = 3）与BOMUS（0.36 MPa）处理组（n = 8）动物的平均行为评分（± SEM）。与麻醉前基线相比，所有动物在麻醉后3小时行为评分均下降，但在次日基本恢复。在各个时间点，两组之间均未观察到显著差异，表明BOMUS对动物行为无明显影响（改编自Howles et al. ¹²）。

讨论

本文介绍了一种利用超声波和微泡非侵入性开放小鼠全脑血脑屏障（BOMUS）的方法。在血脑屏障开放后，给予 Mn²⁺，并采用激活诱导的锰增强磁共振成像（AIM MRI）对轻度镇静小鼠在短时间刺激下的神经元反应进行成像。

通过0.36 MPa的负峰值声压实现了充分的血脑屏障开放。需注意，此压力值是指超声束中心在头皮表面处的压力。单阵元换能器声束剖面的测量结果表明，声束边缘处的声压仅为约0.12 MPa。随后，声波经颅骨衰减，预计到达脑组织的压力降低约25%（根据Choi et al. ²³ 的方法进行降额校正，并针对频率进行了调整）。这表明，血脑屏障的开放发生在0.09 MPa（位于声束中心）至0.03 MPa（位于声束边缘）的负峰值声压范围内。这些压力值低于文献中报道的其他研究通常采用的压力水平（通常为0.4至0.5 MPa）²⁴。这种较低的压力阈值可能是由于本研究中使用的脂质微泡剂量较高（约1.2 mL/kg）所致。尽管所用微泡剂量高于推荐的人体诊断剂量（10 μL/kg），但未观察到不良效应。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
水听器	Sonora Medical Systems, Longmont, CA	SN S4-251
平移台	Newport Corporation, Irvine, CA
超声换能器	Olympus NDT, Inc., Waltham MA	A306S-SU	查阅随换能器提供的制造商测试表，以确定该特定换能器的确切中心频率，该频率可能与目录中列出的标称频率不同。（例如，我们所用换能器的标称频率为 2.25 MHz，但实际中心频率为 2.15 MHz。）
Vevo 成像系统	VisualSonics, Inc. Toronto, Canada
50 dB 功率放大器	E&I, Rochester, NY	model 240L
信号发生器	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	model 33220A
MnCl2-(H2O)4	Sigma		分子量因批次而异，需联系制造商获取精确数值
全氟丁烷脂质微球	Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA	DEFINITY
微球振荡器	Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA	VIALMIX
MR 成像线圈	m2m Imaging Corp., Hillcrest, OH		直径 35 mm 的四通道发射/接收容积线圈
MRI 系统	GE Healthcare, Milwaukee, WI		配备 7-T 水平孔径磁体的 GE EXCITE 控制台
图像分析环境	Visage Imaging, San Diego, CA, MathWorks, Natick MA	Amira MATLAB