系统性、大规模的合成遗传学（基因-基因或上位性）相互作用筛选可用于研究遗传冗余和通路间的串扰。本文中，我们介绍了一种高通量定量合成遗传阵列筛选技术，称为 eSGA，该技术由我们开发，用于阐明大肠杆菌（Escherichia coli）中的上位性关系并探索其遗传相互作用网络。
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方法文章
绘制细菌功能网络与通路 大肠杆菌 使用合成遗传阵列
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
表型由一系列复杂的物理（例如 蛋白质-蛋白质）和功能（例如 基因-基因或遗传相互作用（GI）1虽然物理相互作用可以揭示哪些细菌蛋白以复合物形式关联，但未必能反映通路水平上的功能关系1。基因相互作用（GI）筛选通过测量并比较双突变体（含有两个被敲除或失活的基因）与相应单突变体的生长情况，能够揭示位点间的上位性依赖关系，从而提供一种探究和发现新功能关系的方法2已有关于酵母等真核生物的大规模基因相互作用图谱的报道3-7，但原核生物的胃肠道信息仍然匮乏8，这阻碍了细菌基因组的功能注释。为此，我们及其他研究者已开发出高通量定量细菌基因相互作用（GI）筛选方法9, 10.
本文介绍了在基因组尺度上进行大肠杆菌合成遗传阵列（E. coli Synthetic Genetic Array, eSGA）定量筛选的关键步骤9，该方法利用天然细菌接合与同源重组，系统性地在菌落阵列格式中构建并测定大量双突变体的适合度。 简言之，通过机器人将经基因工程改造的Hfr（高频重组）供体菌株中标记有氯霉素（Cm）抗性基因的突变等位基因，经接合作用转移至有序排列的、带有卡那霉素（Kan）抗性标记的F⁻受体菌株阵列中。通常，我们使用功能缺失型单突变体，包括非必需基因的缺失突变（例如，“Keio”文库11）以及必需基因的低效突变（即导致蛋白表达量、稳定性或活性降低的等位基因9, 12, 13），分别用于探究非必需基因与必需基因之间的功能关联。在接合及随后由同源重组介导的遗传物质交换完成后，通过在含两种抗生素的固体培养基上筛选获得双突变体。培养扩增后，对平板进行数字化成像，并使用自主研发的自动化图像处理系统定量分析菌落大小14。当双突变体的生长速率显著优于或劣于预期时，即可揭示遗传互作（GIs）9。在两个补偿性通路中的基因上同时发生功能缺失突变时，常出现加剧型（或负向）遗传互作2。在此类情况下，单个基因的缺失可被其他通路缓冲，因此任一单突变体均可存活；但若两个通路均失活，则会导致合成致死或生长迟滞（即生长缓慢）。相反，同一通路或蛋白复合物中的基因之间可能发生缓解型（或正向）互作2，因为单独删除其中任一基因通常已足以破坏该通路或复合物的正常功能，因此进一步扰动不会进一步降低其活性与生长能力。总体而言，系统性地识别与分析遗传互作网络，可提供无偏倚、全局性的大量基因间功能关系图谱，并由此推断出其他方法可能遗漏的通路层级信息9。
方案
1. 通过重组工程构建Hfr Cavalli供体突变菌株15, 16
以下描述了构建eSGA供体菌株的步骤。简而言之，我们采用靶向的λ-Red介导的同源重组16，将通过PCR扩增的可筛选DNA标记盒片段导入菌株，以构建非必需基因缺失突变体（第1.1节）或必需基因功能减退突变体供体菌株（第1.2节），这些菌株随后作为“查询”菌株用于定义基因相互作用网络。
注意：在技术开发过程中，我们评估了使用Hfr介导的接合转移来组合突变的有效性，采用了一种定义明确的Hfr供体菌株（Hfr Cavalli、Hfr Hayes和Hfr 3000）。我们考察了以下三个方面：(i) 利用Yu等人（2000）开创的重组工程方法高效构建供体突变体的能力16；(ii) 不同染色体标记接合DNA转移的相对效率；以及(iii) 目标基因位置及其相对于Hfr转移位点oriT的染色体方向对接合的影响。我们发现，λ-Red介导的同源重组效率在Hfr Cavalli中显著高于Hfr Hayes或Hfr3000。如有需要，也可采用P1转导或伪Hfr菌株17来构建突变供体。我们已成功优化上述所有方法，用于大量供体菌株的构建与筛选。由于在初步接合实验中，Hfr Cavalli的....
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结果
基因相互作用（GI）可揭示基因之间的功能关系。类似地，由于同一通路中的基因会表现出相似的GI模式，而GI谱的相似性反映了表型的一致性，因此我们可以通过聚类GI谱将功能相关的基因归入同一通路。将GI网络和GI相关性网络与物理相互作用信息或其他关联数据（如基因组上下文（GC）关系）整合，还可以揭示细菌中定义核心生物系统（以及系统间串扰）的高阶功能模块的组织结构。例如，与酵母4, 6, 7, 26类似，E. coli中表现出缓解型相互作用且具有高度相关GI谱的基因对，通常编码彼此物理结合的蛋白质（例如，形成复合物；图4a），或在同一生化通路中协同作用的蛋白质（例如，线性级联反应中的组分）。一个代表性实例见图4b，其中功能上冗余的Isc和Suf通路的组分共同参与必需的铁硫（Fe-S）生物合成过程，各自形成独立的聚类簇，并通过广泛的加剧型相互作用（即合成致死性）相互连接。可利用统计学方法（例如超几何分布函数27）对GI或GI相关性数据进行分析，以发.......
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讨论
我们已概述了一种逐步的实验方案，通过机器人化电子合成遗传阵列（eSGA）筛选，以通路水平研究细菌基因功能，其核心在于探究基因互作（GI）。该方法可用于研究大肠杆菌（E. coli）中的单个基因以及完整的生物系统。成功实施eSGA并实现新功能发现的关键在于：严格遵循上述实验步骤，包括设置所有适当的对照，并对基因互作数据进行严谨分析和独立验证。除eSGA外，另一种在概念上相似、用于研究大肠杆菌（E. coli）基因互作的方法——GIANT-coli17，也可揭示其他方法常遗漏的新型功能关系，例如单独使用蛋白质组学23或表型筛选13难以发现的关联。然而，与所有全基因组范围的方法一样，eSGA和GIANT-coli的应用也存在局限性，例如难以直接推广至其他细菌物种。部分原因在于，大多数细菌物种尚缺乏全基因组范围的单基因缺失突变株文库，尤其在那些由于同源重组自然频率较低而难以实现靶向突变的物种中。在此类情况下，可考虑采用基于随机可追踪突变技术（如TnSeq31）的基因中断方法，以研究细菌基因功能。有关新兴替代性细菌遗传筛选技.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究工作获得了加拿大基因组中心、安大略基因组研究所及加拿大卫生研究院向 J.G. 和 A.E. 提供的资助。AG 是加拿大范尼尔研究生奖学金的获得者。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 一、抗生素 | |||
| 氯霉素 | Bioshop | #CLR201 | |
| 卡那霉素 | #KAN201 | ||
| 氨苄青霉素 | # AMP201 | ||
| 2. LB培养基 | |||
| LB粉末 | Bioshop | #LBL405 | |
| 琼脂 | Bioshop | #AGR003 | |
| 3. 细菌菌株与质粒 | |||
| Hfr Cavalli菌株 λ红色 系统（JL238） | Babu 等14. | ||
| pKD3 | 大肠杆菌 耶鲁大学遗传资源中心 | ||
| 基奥 大肠杆菌 F- 受体菌株集合 | 日本国家生物资源项目（NBRP）11 | ||
| 功能减退型 大肠杆菌 F- SPA标签菌株 | 开放生物系统；Babu 等人14 | ||
| 4. 引物 | |||
| 基于 pKD3 的脱盐恒定引物 | F1：5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3'' R1：5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3' | ||
| 脱盐定制引物 | Cm-R：5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3'' Cm-F：5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3' | ||
| 脱盐定制引物 | F2 和 R2：基于 pKD3 序列的 20 nt 恒定区域和 45 nt 定制同源区域 F2 恒定区 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' R2 恒定区 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 和 S2：27 nt 的恒定区域用于引物扩增 SPA-Cm 盒，以及 45 nt 的定制同源区域 S1 恒定区 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' S2 恒定区 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F 和 KOCO-C：位于非必需基因缺失位点或必需基因 基因SPA标签插入位点 | ||
| 5. PCR与电泳试剂 | |||
| Taq DNA聚合酶 | Fermentas | # EP0281 | |
| 10X PCR缓冲液 | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| 琼脂糖 | Bioshop | # AGA002 | |
| 上样染料 | NEB | #B7021S | |
| 溴化乙锭 | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE 缓冲液 | Bioshop | # ETB444.10 | |
| Tris碱 | Bioshop | # TRS001 | |
| 硼酸 | Sigma | # T1503-1KG | |
| 0.5 M EDTA（pH 8.0） | Sigma | # B6768-500G | |
| DNA 标准参照物 | NEB | #N3232L | |
| 6. DNA 提取与纯化试剂盒 | |||
| 基因组DNA提取与纯化试剂盒 | Promega | #A1120 | |
| 质粒中量提取试剂盒 | Qiagen | # 12143 | |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | #28104 | |
| 7. PCR、转化与复制点种所需的设备 | |||
| 热循环仪 | BioRad, iCycler | ||
| 琼脂糖凝胶电泳 | BioRad | ||
| 电穿孔仪 | Bio-Rad GenePulser II | ||
| 0.2 cm 电穿孔比色皿 | Bio-Rad | ||
| 42 °C 水浴摇床 | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 离心机 | Beckman Coulter | ||
| 32 °C 摇床 | 新不伦瑞克科学公司，美国 | ||
| 32 °C板培养箱 | Fisher Scientific | ||
| RoToR-HDA 台式机器人 | Singer Instruments | ||
| 96、384 和 1,536 密度针垫 | Singer Instruments | ||
| 96 或 384 长针 | Singer Instruments | ||
| 8. 成像设备 | |||
| 相机支架 | Kaiser | ||
| 数码相机，1000万像素 | 任何供应商 | ||
| 光源箱，Testrite 16" ×24" 单位 | Testrite | ||
| 9. 培养垫或培养皿的重复利用 | |||
| 10% 次氯酸钠溶液 | 任何供应商 | ||
| 70% 乙醇 | 任何供应商 | ||
| 无菌蒸馏水 | 任何供应商 | ||
| 超净工作台 | 任何供应商 | ||
| 紫外灯 | 任何供应商 | ||
| 10. 实验耗材 | |||
| 50 ml 聚丙烯管 | 任何供应商 | ||
| 1.5 ml 微型离心管 | 任何供应商 | ||
| 250 ml 锥形瓶 | VWR | # 29140-045 | |
| 15 ml 无菌培养管 | 赛默飞世尔科技 | # 366052 | |
| 冷冻管 | VWR | # 479-3221 | |
| 矩形培养皿 | Singer Instruments | ||
| 96孔和384孔微孔板 | Singer Instruments | Nunc | |
| 用于多孔板密封的滚板机 | Sigma | #R1275 | |
| 平板 | ABgene | # AB-0580 | |
| 粘性板密封膜 | Fisher Scientific | # 13-990-14 | |
| -80 °C 冷冻柜 | 任何供应商 |
参考文献
- Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data. PLoS Comput. Biol. 4, e1000065(2008).
- Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Charting the genetic interaction....
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重印与许可
