系统性、大规模的合成遗传学（基因-基因或上位性）相互作用筛选可用于研究遗传冗余和通路间的串扰。本文中，我们介绍了一种高通量定量合成遗传阵列筛选技术，称为 eSGA，该技术由我们开发，用于阐明大肠杆菌（Escherichia coli）中的上位性关系并探索其遗传相互作用网络。
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方法文章
绘制细菌功能网络与通路 大肠杆菌 使用合成遗传阵列
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
表型由一系列复杂的物理（例如 蛋白质-蛋白质）和功能（例如 基因-基因或遗传相互作用（GI）1虽然物理相互作用可以揭示哪些细菌蛋白以复合物形式关联，但未必能反映通路水平上的功能关系1。基因相互作用（GI）筛选通过测量并比较双突变体（含有两个被敲除或失活的基因）与相应单突变体的生长情况，能够揭示位点间的上位性依赖关系，从而提供一种探究和发现新功能关系的方法2已有关于酵母等真核生物的大规模基因相互作用图谱的报道3-7，但原核生物的胃肠道信息仍然匮乏8，这阻碍了细菌基因组的功能注释。为此，我们及其他研究者已开发出高通量定量细菌基因相互作用（GI）筛选方法9, 10.
本文介绍了在基因组尺度上进行大肠杆菌合成遗传阵列（E. coli Synthetic Genetic Array, eSGA）定量筛选的关键步骤9，该方法利用天然细菌接合与同源重组，系统性地在菌落阵列格式中构建并测定大量双突变体的适合度。 简言之，通过机器人将经基因工程改造的Hfr（高频重组）供体菌株中标记有氯霉素（Cm）抗性基因的突变等位基因，经接合作用转移至有序排列的、带有卡那霉素（Kan）抗性标记的F⁻受体菌株阵列中。通常，我们使用功能缺失型单突变体，包括非必需基因的缺失突变（例如，“Keio”文库11）以及必需基因的低效突变（即导致蛋白表达量、稳定性或活性降低的等位基因9, 12, 13），分别用于探究非必需基因与必需基因之间的功能关联。在接合及随后由同源重组介导的遗传物质交换完成后，通过在含两种抗生素的固体培养基上筛选获得双突变体。培养扩增后，对平板进行数字化成像，并使用自主研发的自动化图像处理系统定量分析菌落大小14。当双突变体的生长速率显著优于或劣于预期时，即可揭示遗传互作（GIs）9。在两个补偿性通路中的基因上同时发生功能缺失突变时，常出现加剧型（或负向）遗传互作2。在此类情况下，单个基因的缺失可被其他通路缓冲，因此任一单突变体均可存活；但若两个通路均失活，则会导致合成致死或生长迟滞（即生长缓慢）。相反，同一通路或蛋白复合物中的基因之间可能发生缓解型（或正向）互作2，因为单独删除其中任一基因通常已足以破坏该通路或复合物的正常功能，因此进一步扰动不会进一步降低其活性与生长能力。总体而言，系统性地识别与分析遗传互作网络，可提供无偏倚、全局性的大量基因间功能关系图谱，并由此推断出其他方法可能遗漏的通路层级信息9。
方案
1. 通过重组工程构建Hfr Cavalli供体突变菌株15, 16
以下描述了构建eSGA供体菌株的步骤。简而言之，我们采用靶向的λ-Red介导的同源重组16，将通过PCR扩增的可筛选DNA标记盒片段导入菌株，以构建非必需基因缺失突变体（第1.1节）或必需基因功能减退突变体供体菌株（第1.2节），这些菌株随后作为“查询”菌株用于定义基因相互作用网络。
注意：在技术开发过程中，我们评估了使用Hfr介导的接合转移来组合突变的有效性，采用了一种定义明确的Hfr供体菌株（Hfr Cavalli、Hfr Hayes和Hfr 3000）。我们考察了以下三个方面：(i) 利用Yu等人（2000）开创的重组工程方法高效构建供体突变体的能力16；(ii) 不同染色体标记接合DNA转移的相对效率；以及(iii) 目标基因位置及其相对于Hfr转移位点oriT的染色体方向对接合的影响。我们发现，λ-Red介导的同源重组效率在Hfr Cavalli中显著高于Hfr Hayes或Hfr3000。如有需要，也可采用P1转导或伪Hfr菌株17来构建突变供体。我们已成功优化上述所有方法，用于大量供体菌株的构建与筛选。由于在初步接合实验中，Hfr Cavalli的整体转移效率更高，且观察到的转化子数量显著更多，因此选择该特定遗传背景用于供体构建及大规模eSGA实验。本文详细描述了使用Hfr Cavalli供体进行eSGA筛选的全部操作步骤。
- 扩增用于后续重组工程以删除非必需基因的DNA片段
采用两步法巢式PCR扩增（图1) 构建基因缺失盒，用于以pKD3质粒（GI: 15554330；蛋白ID: AAL02033.1）中的Cm抗性标记替换目标开放阅读框15该标记两侧为FRT位点所包围11 必要时可在后续实验中移除抗性基因。
注意： 我们采用巢式两步PCR去除用于后续转化细菌细胞的扩增产物中的质粒。首先在第一轮PCR中去除质粒，然后在第二轮PCR中构建基因敲除盒，这一步骤是必要的，因为使用质粒进行转化的效率远高于重组工程，而我们的目标是尽可能获得仅成功用可筛选标记替换靶向基因组DNA的菌株。替代巢式PCR的方法是对第二轮PCR扩增区域以外的质粒进行限制性酶切消化，随后纯化酶切产物，并将其作为模板用于巢式PCR步骤（1.1.2）。该方法同样简便，但需要更长的前期准备时间。- 使用约45 ng的pKD3作为模板，采用F1正向引物和R1反向引物进行PCR扩增，获得1,070 bp的产物。按照Qiagen PCR纯化试剂盒说明书纯化PCR片段，并将纯化产物用无菌蒸馏水稀释至5 ng/μl的浓度。
- 以纯化的PCR产物为模板，使用基因特异性引物进行第二轮PCR扩增（例如 敲除）嵌套引物 F2 和 R2，其具有（i）位于 5'-端的 45 个核苷酸基因特异性同源区域，用于在目标基因的上下游立即发生同源重组，从而用氯霉素抗性标记替换目标基因；以及（ii）位于 3'-端的 20 个核苷酸，用于启动氯霉素抗性标记的合成。扩增产物片段大小为 1,123 bp。基因特异性同源区域的设计旨在移除目标开放阅读框，同时保留邻近或部分重叠的编码区段完整。完成此扩增后，进入步骤 1.3。
- 扩增用于构建必需基因功能缺失突变的标签盒
- 为构建功能部分缺失的供体突变菌株，添加C端串联肽亲和（SPA）融合标签，该标签通常通过降低转录本丰度而轻微影响必需蛋白的功能（即 蛋白质拷贝数）或蛋白质折叠/活性。为此，通过将 pJL148 质粒中的 Kan 抗性标记替换为 Cm 抗性标记，构建可筛选的 SPA 标签（SPA-Cm）DNA 模板18 通过 pJL148 中卡那霉素抗性基因（Kan标记）两侧的相同核苷酸序列与 pKD3 中氯霉素抗性基因（Cm标记）之间的重组工程，实现向 Cm 的转换15所得模板包含同框的SPA标签序列，其后为氯霉素抗性标记，适用于PCR扩增、重组工程及后续的eSGA实验。12.
注意： 必需基因在基因功能研究中可能具有最重要的意义。然而，由于这些基因无法被删除，因此必须开发创新的方法来研究必需基因的功能关系。一些极为成功的策略最初在酵母中得以建立。例如，Davierwala 等（2005）19 使用一组包含575个温度敏感型必需基因突变体的菌株进行了遗传互作筛选，发现必需基因的遗传互作数量约为非必需基因的五倍。同样，Breslow等（2008）20 开发了一种“通过mRNA扰动降低丰度”（DAmP）方法，用于构建覆盖约82%必需酵母基因的低效等位基因文库，以研究信号通路和蛋白复合物。DAmP方法通过修饰表达mRNA的3'端，降低目标基因的表达水平6，可能是由于mRNA去稳定化所致。与DAmP方法类似6我们的策略是利用干扰必需蛋白的mRNA 3'端所产生的细微效应。
正如我们下文所述，该标签本身不太可能影响蛋白质的折叠或功能，但标签对mRNA造成的细微扰动在与环境应激因素或其他突变共同作用时，足以揭示具有功能意义的基因-环境相互作用 13 以及基因-基因 9, 12 相互作用。
首先，迄今为止，我们已使用SPA标签纯化了约3,000种大肠杆菌的必需和非必需蛋白21-23，其中我们的SPA标签菌株涵盖了307种大肠杆菌必需蛋白中的80%以上8由于该标签已成功用于分离已知的蛋白质复合物，且这些复合物经过了相互验证（即 同一复合物可通过标记并纯化该复合物内的不同蛋白质而被分离；并且我们推断，所分离的复合物具有生物学相关性，因此标签通常不会影响蛋白质的折叠或功能12同样，我们未发表的观察结果表明，标签本身通常不会影响菌株的生长。然而，我们推断，通过整合标签和标记盒来改变3'-UTR，正如在DAmP菌株中所报道的那样6，可能在RNA水平上使某些转录本不稳定，或在少数情况下阻碍融合蛋白的正确折叠或功能。因此，我们预测，将这些必需基因的功能受损等位基因与基因组其他位置的功能相关突变相结合，会产生具有信息量的遗传相互作用，这一预测确实得到了证实9, 12此外，必需基因的SPA标签等位基因表现出基因-环境相互作用（例如 药物超敏反应）根据 Nichols 等人（2011）的表型分析研究13，对一组带有SPA标签的必需基因菌株施加了多种生长条件。该研究还证实，大多数（58个测试菌株中的54个）带有SPA标签的必需基因菌株在一种或多种培养条件下表现出适应性受损13，这支持了SPA标签通常在必需基因中产生轻度功能缺失等位基因的观点，这类等位基因可用于全基因组遗传相互作用筛选，包括eSGA。 - 使用基因特异性引物S1和S2从SPA-Cm模板中扩增标签盒，每个引物包含：(i) 位于5'端的45 nt基因特异性区域，用于在同源重组工程中定位；(ii) 位于3'端的27 bp SPA-Cm特异性序列。
- 为构建功能部分缺失的供体突变菌株，添加C端串联肽亲和（SPA）融合标签，该标签通常通过降低转录本丰度而轻微影响必需蛋白的功能（即 蛋白质拷贝数）或蛋白质折叠/活性。为此，通过将 pJL148 质粒中的 Kan 抗性标记替换为 Cm 抗性标记，构建可筛选的 SPA 标签（SPA-Cm）DNA 模板18 通过 pJL148 中卡那霉素抗性基因（Kan标记）两侧的相同核苷酸序列与 pKD3 中氯霉素抗性基因（Cm标记）之间的重组工程，实现向 Cm 的转换15所得模板包含同框的SPA标签序列，其后为氯霉素抗性标记，适用于PCR扩增、重组工程及后续的eSGA实验。12.
- 确认并纯化PCR产物
- 通过琼脂糖凝胶电泳对2-5 μl PCR产物进行检测，确认标签盒已正确扩增，并按照制造商的标准PCR纯化方案（Qiagen）纯化剩余DNA。用30 μl无菌蒸馏水洗脱PCR产物，并稀释至约50 ng/μl的浓度。纯化后的产物可立即用于转化（步骤1.5），或在-20 °C保存长达6个月以备后续使用。
- 制备Hfr Cavalli感受态细胞用于供体构建
- 将1 ml过夜培养的Hfr Cavalli菌株饱和培养物接种到装有70 ml新鲜LB培养基（含35 μl浓度为50 μg/ml的氨苄青霉素）的250 ml三角瓶中。在32 °C、220 rpm振荡条件下培养，直至菌液在600 nm处的光密度（OD）达到约0.5–0.6（约2小时）。
- 将培养物转移至水浴中进行热诱导以激活λ红色 重组系统16 在42 °C、160 rpm振荡条件下反应15分钟。将培养物转移至预冷的冰水浴中，在160 rpm振荡条件下孵育10–20分钟以终止诱导。从此步骤开始直至转化完成前，务必保持细胞处于低温状态；使用前应将离心管和比色皿预先置于冰上冷却至少15分钟。
- 将培养物均分为两份，分别加入两个预冷的50 ml聚丙烯管中（每管约35 ml），于4 °C、4,400 × g离心6 min。
- 弃去上清液，加入约 50 ml 冰冷的无菌蒸馏水，轻轻倒置重悬细胞沉淀。在 4 °C 条件下，以 4,400 x g 离心 6 min。弃去上清液，将每份细胞沉淀重悬于 20 ml 冰冷的无菌 10% 甘油中，并按上述条件再次离心。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500 μl预冷的10%甘油溶液中。将制备好的感受态细胞按50 μl每份分装至预先冷却的1.5 ml微量离心管中，用于立即进行转化。细胞可置于干冰或液氮中速冻，并于-80 °C保存长达3个月。然而，新鲜制备的感受态细胞转化效率最高。
- 转化
- 将1.3.1步骤中纯化的PCR产物100 ng加入感受态细胞中。轻弹试管，使悬浮液在冰上静置5分钟。
- 将冰上制备的感受态细胞悬液与DNA转移至预冷的电穿孔比色皿中。使用2.5 kV、25 μF、200 ohms参数设置，在2 mm间隙的比色皿中对细胞混合物进行电穿孔即 如果使用不同的比色皿，请参照制造商提供的电穿孔参数设置），并立即加入 1 ml 室温 SOC 培养基。将电穿孔后的细胞转移至 SOC 培养基中，放入 15 ml 培养管，于 32 °C、220 rpm 摇床中孵育 1 小时。
- 孵育后，在室温下以4,400 x g离心5分钟。弃去约850 μl上清液，将细胞沉淀物重悬于剩余液体中。
- 将细胞涂布于含有 17 μg/ml Cm 的预热 LB 平板上，于 32 °C 过夜培养。挑取两个单个转化子菌落，在 LB-Cm 平板上划线培养以确认突变体。建议避免挑取最大的转化子菌落，以降低获得携带稀有抑制性突变菌株的可能性。同时将相同转化子在 LB-Kan 平板上划线，以确认菌株不具有卡那霉素抗性。
注意： 由于使用了氯霉素抗性（Cm抗性）标记来构建供体菌株，我们不期望供体突变体具有卡那霉素抗性（Kan抗性）。通过将转化子分别划线接种至LB-Kan和LB-Cm平板，我们可以确认供体突变本身并未以某种方式导致Kan抗性。如果省略此步骤，而目标突变恰好影响菌株在卡那霉素条件下的存活能力，则在eSGA实验中将无法有效获得双突变体，因为供体菌株会在所有筛选步骤中存活下来。该步骤仅作为预防性逻辑控制，用于及早发现意外的表型或其他可能干扰eSGA筛选完成的问题。尽管跳过此步骤后，其他对照仍可识别失败的筛选，但若能更早发现具有Kan抗性的供体菌株，则可避免一系列无效且不必要的实验步骤。菌株在卡那霉素平板上生长的其他可能原因还包括抗生素过期、使用了错误的PCR产物或错误的转化菌株等。借助这一对照，尽管非强制要求，但建议在eSGA实验中实施，以便在实验早期识别并处理上述各类问题。
- 验证非必需基因的缺失（步骤 1.6.1）或必需基因的低效突变（步骤 1.6.2）
注意： 在通过 PCR 验证基因敲除时，应使用野生型菌株的基因组 DNA 作为对照。- 确认非必需基因的敲除
- 通过PCR验证基因敲除时，按照生产商说明（Promega），从在液体LB-Cm培养基中培养的转化后疑似敲除菌株中提取基因组DNA。
- 为验证重组工程是否成功，使用三组不同的敲除验证引物对每个转化子的DNA进行扩增。每反应使用约150 ng基因组DNA作为模板，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，确认片段大小是否正确。
- 第一对引物包含一个位于目标区域上游200 bp处的20 nt侧翼引物（KOCO-F）和一个与Cm盒序列互补的Cm-R引物。该扩增反应在突变株中预期产生一个445 nt的扩增片段，而在野生型菌株中则不会产生扩增产物。图1).
- 第二组引物包含一个与Cm盒序列结合的正向引物（Cm-F），以及一个20 nt的反向侧翼确认引物（KOCO-R），该引物设计为与被删除基因3'端下游200 bp处序列结合。在突变株中，此扩增反应预期产生一个309 nt的扩增子，而在野生型菌株中则不会产生。图1).
- 第三次PCR使用KOCO-F和KOCO-R引物。该反应用于确认所选菌株并非部分二倍体，即一个基因位点已被盒式结构替换，而另一个位点仍存在重复但未改变的野生型基因拷贝。在正确的缺失突变体中，此扩增预期产生一条1.4 kb的产物。图1).
注意： 当目标基因的碱基对长度与基因敲除盒大致相同时，无法通过大小区分基因座是否已被敲除盒替换。在此类情况下，为获得明确的验证结果，我们建议使用额外的引物，特异性扩增被删除基因内部的一段DNA片段。此时，若基因已被成功删除，则仅在野生型对照菌株中观察到扩增产物，而在突变体中则无。这些引ers可手动或通过计算方法设计，以特异性扩增缺失区域内的DNA片段。我们通常选择扩增约140 bp的片段。
- 确认必需基因的低效突变
- 为通过PCR确认低效突变，使用位于SPA标签插入位点上游和下游约200 bp处的基因特异性正向引物（KOCO-F）和反向引物（KOCO-R），引物长度均为20 nt（图2).
注意： 此扩增步骤用作对照，以确保目标必需基因的无标签拷贝不存在。当仅存在带标签的版本时，可观察到一条比 SPA-Cm 扩增产物大 310 bp 的单一条带。若出现 400 bp 的扩增产物，则表明该基因的无标签版本存在。 - 在进行PCR验证的同时，使用抗FLAG M2抗体通过Western blotting检测SPA标签的框内插入，该抗体特异性识别SPA标签中的FLAG表位21.
- 为通过PCR确认低效突变，使用位于SPA标签插入位点上游和下游约200 bp处的基因特异性正向引物（KOCO-F）和反向引物（KOCO-R），引物长度均为20 nt（图2).
- 确认非必需基因的敲除
- 保存确认的供体菌株
- 将经确认的重组供体突变菌株的过夜培养物转移至标记好的冻存管中，加入甘油至终浓度15%，充分混匀。用于长期保存时，将冻存管置于-80 °C保存。
2. 用于 eSGA 筛选的 E. coli F- 受体突变株的阵列
- 复制针接种 E. coli 由 Mori 构建的 Keio 单非必需基因缺失突变体文库 等 （3,968 株）11；F- BW25113；可从 Open Biosystems 获得）自动接种至24块每孔含80 μl液体LB培养基的384孔微孔板中，每孔培养基中添加50 μg/ml卡那霉素。
注意： 为系统评估含有必需基因的基因相互作用，采用受体Keio文库11 可补充带有C端SPA标签的F-Kan标记必需基因功能减弱型突变株22, 23. - 为给边境控制菌株（作为阳性对照，用于板内和板间标准化以及自动菌落定量）腾出空间，将上一步中每块平板最外侧孔内的接种培养基取出，并转移至新的平板中，同样保持最外侧孔为空。
注意： Keio文库中的边境控制菌株JW502811 删除了一个小的假基因，该假基因不应在全基因组筛选中与任何供体菌株表现出遗传互作（GIs）。因此，该菌株是一个良好的阳性对照，可用于识别接合、点种或筛选失败的罕见情况，这些情况会导致边界菌株生长缺失或零星出现。例如，若在双突变体筛选后边界对照菌落未生长，则可能表明查询菌株无法进行接合，或接合尝试所处的条件阻碍了接合的发生，例如 在含有抗生素的平板上）可能添加了错误的抗生素。同样，如果在整个平板（包括边缘）仅观察到极少且零星分布的菌落，则表明接合或点种可能失败，需要重复筛选实验。如果这种边缘零星生长现象可重复出现，则可能提示供体菌接合效率持续较低，因此未观察到双突变菌株的情况很可能是由于接合失败，而非真实的遗传互作（GIs）。此类筛选实验应从后续分析中剔除。此外，由于边缘对照菌株存在于所有平板上，菌落定量软件可据此自动确定双突变平板上菌落的位置，从而无需手动标注菌落位置。最后，边缘对照菌株有助于平板内菌落大小的归一化处理（例如 同一块板内的不同行）以及（板间例如 不同时间使用相同供体针接的不同受体板。 - 同样，通过从每块平板的非边缘区域（非边界位置）移除任意两种菌株，并将这些菌株转移至新平板，创建阴性对照点。用含有17 μg/ml 氯霉素（Cm）的LB培养基填充这些空孔。预期受体菌中这些阴性对照点应无生长，从而用于验证双突变平板，并确保在平板编号、成像或点样过程中未发生处理或操作误差。
注意： 这些空位是必需的阴性对照。阴性对照有助于识别筛选失败的情况——即在筛选过程中阴性对照菌株出现生长。我们建议不仅为每块受体平板选择独特的阴性对照点位，还应在平板的同一象限内选择阴性对照点位例如 右下角）。通过这种方式，阴性对照点的分布模式可识别可能的板条操作错误（例如 平板标签错误或倒置打点（即左上角的菌落被打点至右下角位置）。 - 接种Keio菌株JW502811，将含有假基因缺失的菌株接种于含50 μg/ml卡那霉素的200 ml LB培养基的500 ml三角瓶中。根据我们的全基因组eSGA筛选结果，该突变株的生长状态最接近野生型BW25113，因此被用作边界对照。
- 在32 °C、190 rpm振荡培养条件下，将阵列菌株及JW5028菌液培养过夜，至OD值约为0.4-600 nm 处的 OD 值为 0.6。过夜培养后，向边缘孔中加入约 80 μl JW5028 过夜培养物。
- 组装好的平板可用于步骤 3.2。或者，若需长期保存，向受体平板的每孔中加入 15% 甘油，混匀培养基与甘油后，将平板置于 -80 °C 保存。
3. 用于生成的高密度菌株交配程序 E. coli 双突变体
- 在含有氯霉素（Cm，17 μg/ml）的丰富LB液体培养基中，于32 °C、220 rpm振荡条件下，过夜培养携带待测突变并以Cm标记的Hfr供体菌株。
- 将有序排列的受体突变体文库以384菌落密度点种至添加了50 μg/ml卡那霉素（Kan）的固体LB平板上。同时，将供体待测突变菌株也以384菌落密度点种至相同数量的LB平板上，平板中添加17 μg/ml Cm。于32 °C过夜培养。
注意：用于点种的受体平板可能需要长达36小时才能获得足够大的菌落以进行后续步骤。当边缘菌落的平均直径约为2 mm（或更大）时，平板即可用于点种。 - 为进行接合，先将来自384菌落密度的过夜供体平板上的菌落点种至固体LB平板上。随后，将一张384菌落密度的受体平板直接点种到接合平板上新点种的供体菌落之上。重复此操作，直至所有供体-受体组合均通过点种完成在固体LB接合平板上的接合。将点种后的接合平板于32 °C培养16至24小时。
注意：由于突变可能影响接合效率、DNA转移效率或细胞适应性，不同单突变供体菌株在接合效率上可能存在基因间差异。当获得足够大的菌落以进行后续点种步骤时，可在16至24小时之间的任意时间终止培养。即使对于晚期转移基因的突变体或适应性略低的突变体，16至24小时的接合时间也足以产生足够数量的接合子，以获得可重复的eSGA结果。 - 将每张384密度的接合平板点种至一张含有氯霉素（17 μg/ml）和卡那霉素（50 μg/ml）的固体LB选择平板上，直至所有接合平板均完成点种。将新点种的第一轮选择平板于32 °C培养16–36小时。
注意：关于选择步骤，不同的供体筛选可能需要不同的培养时间。由于特定筛选中的所有双突变体均携带相同的供体突变，平均而言，生长较慢的供体突变体会导致双突变体生长也较慢。因此，根据供体的适应性，选择步骤可能需要16至36小时。当双突变体菌落足够大，能够满足后续操作（第一轮选择后的点种或第二轮选择后的成像）要求时，即可终止培养。通常这意味着边缘对照菌落的平均直径至少达到2 mm。 - 将每张第一轮选择平板以1,536菌落密度重新点种至第二张双抗生素（Cm和Kan）选择平板上，使每个第一轮选择菌落在第二张选择平板上对应四个菌落。于32 °C培养16–36小时。对最终的双突变体选择平板进行拍照，以定量测定突变体的生长适应性，并分析基因对之间的相互作用（图3）。
注意：尽管部分二倍体（merodiploidy，即染色体部分重复）的发生频率较低（约1/1,000个细胞）24，但其可能掩盖遗传互作（GI）。因此，我们建议在所有eSGA筛选中包含生物学重复。幸运的是，商用一次性平板和塑料点种垫可通过以下方式灭菌后重复使用最多三次：弃去平板上的琼脂，将平板和点种垫浸泡于10%次氯酸钠溶液中过夜，随后用蒸馏水冲洗，70%乙醇清洗，并在超净台内经紫外光照射下风干。灭菌后的点种垫和平板应储存于密封的无菌塑料袋中，直至使用。
4. 数据处理与GI评分的获取
- 使用专用的菌落成像软件以批量模式或逐个测量每块平板上的菌落数量3, 9。
注意： 一种基于 Java 的高通量菌落成像与评分应用程序现已免费向公众开放（http://srcollins77.users.sourceforge.net/）。该软件可在不同平台（即 Mac 或 PC）上运行，可通过可执行文件或终端窗口启动。 - 通过校正板内和板间的系统性偏差来归一化原始菌落大小测量值，这些偏差包括平板边缘效应、板间变异效应、图像光照不均、琼脂表面物理曲率引起的伪影、邻近菌落间的竞争效应以及可能的点样缺陷，还包括生长时间的差异9。这些系统性伪影与双突变体的适合度无关，必须予以校正，否则会导致错误的生长适合度估计。
- 由于边缘行和列的菌落所处区域对营养的竞争较低，其菌落通常比平板中心区域的更大。因此，为校正此效应，应调整边缘菌落的大小，使其所在行或列的菌落大小中位数等于平板中心区域菌落大小的中位数。
- 对结果进行统计学分析，以考虑重复测量菌落大小中位数时的可重复性及标准偏差。至少需要进行三次独立的生物学重复实验，以评估实验的可重复性。
- 最后，利用归一化的菌落生长适合度中位数，通过以下公式为每对基因计算基因互作得分（S）：
其中，Svar = (varExp × (nExp - 1) + varCont × (nCont - 1)) / (nExp + nCont - 2)；varExp = 双重突变体归一化菌落大小的最大方差；varCont = 参考数据集中归一化双重突变体菌落大小方差的中位数；nExp = 双重突变体菌落大小的测量次数；nCont = 所有实验中实验重复数的中位数；μExp = 双重突变体归一化菌落大小的中位数；μCont = 来自单个供体突变株的所有双重突变体归一化菌落大小的中位数。S-分数同时反映了假定双基因相互作用的统计置信度以及该相互作用的生物学强度。显著的正S-分数表明存在缓解效应，提示相互作用的基因可能参与同一条通路9，而显著的负S-分数则反映合成致死或合成病态效应，通常提示这些基因属于平行冗余通路9。为了确定通路水平的功能关系，每个被测基因对的最终数据集将生成一个单一的S-分数。
注意：在我们之前的研究9中发现，距离在30 kbp以内的基因之间发生重组的频率往往较低。因此，在归一化和评分生成后的下游分析中，我们会剔除彼此距离在30 kbp以内的基因之间的相互作用。除了基因相互作用（GI）本身外，还可以通过比较两个基因的GI谱的相似性来探究它们之间的功能关系。一个基因的GI谱是指该基因在其连锁区域外与基因组中所有其他基因发生的全部相互作用。功能相似的基因通常具有更高的遗传相互作用谱相关性12, 25。因此，通过计算实验数据集中所有基因的相关系数，即使对于染色体上位置相近的基因，也可利用eSGA来研究其功能关系。
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结果
基因相互作用（GI）可揭示基因之间的功能关系。类似地，由于同一通路中的基因会表现出相似的GI模式，而GI谱的相似性反映了表型的一致性，因此我们可以通过聚类GI谱将功能相关的基因归入同一通路。将GI网络和GI相关性网络与物理相互作用信息或其他关联数据（如基因组上下文（GC）关系）整合，还可以揭示细菌中定义核心生物系统（以及系统间串扰）的高阶功能模块的组织结构。例如，与酵母4, 6, 7, 26类似，E. coli中表现出缓解型相互作用且具有高度相关GI谱的基因对，通常编码彼此物理结合的蛋白质（例如，形成复合物；图4a），或在同一生化通路中协同作用的蛋白质（例如，线性级联反应中的组分）。一个代表性实例见图4b，其中功能上冗余的Isc和Suf通路的组分共同参与必需的铁硫（Fe-S）生物合成过程，各自形成独立的聚类簇，并通过广泛的加剧型相互作用（即合成致死性）相互连接。可利用统计学方法（例如超几何分布函数27）对GI或GI相关性数据进行分析，以发...
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讨论
我们已概述了一种逐步的实验方案，通过机器人化电子合成遗传阵列（eSGA）筛选，以通路水平研究细菌基因功能，其核心在于探究基因互作（GI）。该方法可用于研究大肠杆菌（E. coli）中的单个基因以及完整的生物系统。成功实施eSGA并实现新功能发现的关键在于：严格遵循上述实验步骤，包括设置所有适当的对照，并对基因互作数据进行严谨分析和独立验证。除eSGA外，另一种在概念上相似、用于研究大肠杆菌（E. coli）基因互作的方法——GIANT-coli17，也可揭示其他方法常遗漏的新型功能关系，例如单独使用蛋白质组学23或表型筛选13难以发现的关联。然而，与所有全基因组范围的方法一样，eSGA和GIANT-coli的应用也存在局限性，例如难以直接推广至其他细菌物种。部分原因在于，大多数细菌物种尚缺乏全基因组范围的单基因缺失突变株文库，尤其在那些由于同源重组自然频率较低而难以实现靶向突变的物种中。在此类情况下，可考虑采用基于随机可追踪突变技术（如TnSeq31）的基因中断方法，以研究细菌基因功能。有关新兴替代性细菌遗传筛选技...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究工作获得了加拿大基因组中心、安大略基因组研究所及加拿大卫生研究院向 J.G. 和 A.E. 提供的资助。AG 是加拿大范尼尔研究生奖学金的获得者。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 一、抗生素 | |||
| 氯霉素 | Bioshop | #CLR201 | |
| 卡那霉素 | #KAN201 | ||
| 氨苄青霉素 | # AMP201 | ||
| 2. LB培养基 | |||
| LB粉末 | Bioshop | #LBL405 | |
| 琼脂 | Bioshop | #AGR003 | |
| 3. 细菌菌株与质粒 | |||
| Hfr Cavalli菌株 λ红色 系统（JL238） | Babu 等14. | ||
| pKD3 | 大肠杆菌 耶鲁大学遗传资源中心 | ||
| 基奥 大肠杆菌 F- 受体菌株集合 | 日本国家生物资源项目（NBRP）11 | ||
| 功能减退型 大肠杆菌 F- SPA标签菌株 | 开放生物系统；Babu 等人14 | ||
| 4. 引物 | |||
| 基于 pKD3 的脱盐恒定引物 | F1：5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3'' R1：5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3' | ||
| 脱盐定制引物 | Cm-R：5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3'' Cm-F：5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3' | ||
| 脱盐定制引物 | F2 和 R2：基于 pKD3 序列的 20 nt 恒定区域和 45 nt 定制同源区域 F2 恒定区 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' R2 恒定区 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 和 S2：27 nt 的恒定区域用于引物扩增 SPA-Cm 盒，以及 45 nt 的定制同源区域 S1 恒定区 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' S2 恒定区 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F 和 KOCO-C：位于非必需基因缺失位点或必需基因 基因SPA标签插入位点 | ||
| 5. PCR与电泳试剂 | |||
| Taq DNA聚合酶 | Fermentas | # EP0281 | |
| 10X PCR缓冲液 | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| 琼脂糖 | Bioshop | # AGA002 | |
| 上样染料 | NEB | #B7021S | |
| 溴化乙锭 | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE 缓冲液 | Bioshop | # ETB444.10 | |
| Tris碱 | Bioshop | # TRS001 | |
| 硼酸 | Sigma | # T1503-1KG | |
| 0.5 M EDTA（pH 8.0） | Sigma | # B6768-500G | |
| DNA 标准参照物 | NEB | #N3232L | |
| 6. DNA 提取与纯化试剂盒 | |||
| 基因组DNA提取与纯化试剂盒 | Promega | #A1120 | |
| 质粒中量提取试剂盒 | Qiagen | # 12143 | |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | #28104 | |
| 7. PCR、转化与复制点种所需的设备 | |||
| 热循环仪 | BioRad, iCycler | ||
| 琼脂糖凝胶电泳 | BioRad | ||
| 电穿孔仪 | Bio-Rad GenePulser II | ||
| 0.2 cm 电穿孔比色皿 | Bio-Rad | ||
| 42 °C 水浴摇床 | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 离心机 | Beckman Coulter | ||
| 32 °C 摇床 | 新不伦瑞克科学公司，美国 | ||
| 32 °C板培养箱 | Fisher Scientific | ||
| RoToR-HDA 台式机器人 | Singer Instruments | ||
| 96、384 和 1,536 密度针垫 | Singer Instruments | ||
| 96 或 384 长针 | Singer Instruments | ||
| 8. 成像设备 | |||
| 相机支架 | Kaiser | ||
| 数码相机，1000万像素 | 任何供应商 | ||
| 光源箱，Testrite 16" ×24" 单位 | Testrite | ||
| 9. 培养垫或培养皿的重复利用 | |||
| 10% 次氯酸钠溶液 | 任何供应商 | ||
| 70% 乙醇 | 任何供应商 | ||
| 无菌蒸馏水 | 任何供应商 | ||
| 超净工作台 | 任何供应商 | ||
| 紫外灯 | 任何供应商 | ||
| 10. 实验耗材 | |||
| 50 ml 聚丙烯管 | 任何供应商 | ||
| 1.5 ml 微型离心管 | 任何供应商 | ||
| 250 ml 锥形瓶 | VWR | # 29140-045 | |
| 15 ml 无菌培养管 | 赛默飞世尔科技 | # 366052 | |
| 冷冻管 | VWR | # 479-3221 | |
| 矩形培养皿 | Singer Instruments | ||
| 96孔和384孔微孔板 | Singer Instruments | Nunc | |
| 用于多孔板密封的滚板机 | Sigma | #R1275 | |
| 平板 | ABgene | # AB-0580 | |
| 粘性板密封膜 | Fisher Scientific | # 13-990-14 | |
| -80 °C 冷冻柜 | 任何供应商 |
参考文献
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