测绘细菌功能的网络和途径大肠杆菌

Summary

系统，大型合成基因（基因或基因上位性）互动屏幕可用于，探索遗传冗余和途径串扰。在这里，我们描述了一种高通量的定量合成基因阵列筛选技术，被称为ESGA我们制定的，阐明互作关系，并探索遗传相互作用网络大肠杆菌。

Abstract

表型是由一系列复杂的物理（ 例如，蛋白质-蛋白质）和功能（ 例如基因的基因或基因）的相互作用（GI）的^1。虽然身体的相互作用可以表明，细菌蛋白相关复合，他们不一定透露途径级的功能relationships1的。 GI屏幕，其中带有两个缺失或失活的基因的双突变体的增长是衡量和相应的单突变体相比，可以照亮上位性位点之间的依赖关系，从而提供了一种查询和发现新的功能关系^2。大型GI地图真核生物如酵母^3-7，但GI信息仍稀疏，为原核生物^8，阻碍了细菌的基因组功能注释。为此，我们和其他人开发的高通量定量细菌GI筛选方法^9，10 在这里，我们提出所需的关键步骤进行定量E.大肠杆菌的合成遗传的阵列（ESGA）筛选程序，在基因组规模^9，使用天然细菌接合和同源重组系统产生和测量的健身大量的双突变体在殖民地阵列格式。简单地说，一个机器人是用来传输通过结合，氯霉素（Cm） - 的突变等位基因，从设计HFR（高频重组）的"供体菌株的成有序的阵列卡那霉素（Kan）的 - 显着的F-受体菌。通常情况下，我们使用损失的，功能单一的非必需的基因缺失突变体轴承（ 例如 "庆应义塾"系列^11）亚效等位基因突变和必需的基因（ 即基因赋予蛋白表达减少，稳定或活动^{9，12，13）}协会非必要和必需的基因，水库查询功能pectively。共轭和随后通过同源重组介导的遗传交换后，将所得的双突变体包含两种抗生素的固体培养基上选择。后的产物，数字成像板和殖民地的大小进行定量计分使用一个内部的自动图像处理系统^14。地理标志显示时的双突变体的增长速度是显着高于或低于预计^9。加重（或负）的地理标志常常导致撞击上的相同的基本处理流程^2的补偿途径，对基因的功能缺失型突变的之间。在这里，一个单一的基因被缓冲的损失，例如，可以是单突变体是可行的。然而，这两个途径是有害的损失和合成致死或疾病的结果（ 即增长缓慢）。相反，减轻（或正）的相互作用可以在同一个途径或蛋白复合物²作为基因之间发生删除单独任何一个基因的往往是足以扰乱途径或复合物，例如，额外扰动不降低活性，因此生长，进一步的正常功能。总体而言，系统地识别和分析GI网络可以提供公正，世界地图，大量的基因，错过了其他方法的途径级别的信息可以推断出⁹之间的功能关系。

Protocol

1。构建HFR Cavalli的供体突变株的重组工程^15，16

用于构造的ESGA捐助污渍的步骤描述如下。简单地说，我们使用有针对性的λ - Red介导的同源重组所产生的PCR扩增可选择的DNA标记盒的片段创建非必需基因缺失突变株（1.1节），或者必需的基因亚效等位基因突变体供体株（1.2节），然后用¹⁶ "查询"定义GI网络。

注:在技术发展过程中，我们使用HFR-介导的接合转移相结合的突变使用一个明确的的HFR供体菌（HFR卡瓦利，HFR·海斯和HFR 3000）的成效进行评估。我们研究（I）的能力，有效地使捐助者的突变体，利用重组工程的方法，Yu等人开创的。 ^{（2000）16，（ⅱ）}的相对效率的接合DNA转移的不同的染色体标记物，及（iii）查询的基因的位置和染色体相对HFR转移轨迹，ORIT取向的影响。我们发现，λ - ，在HFR比HFR海耶斯或Hfr3000的的Cavalli的Red介导的同源重组效率要高得多。 P1转导或的的的伪HFR菌株^17，如果需要，可以使用创建突变捐助国。我们已经成功地适应了所有这些方法和筛选大量的捐助者。因为在我们的试验中结合实验，观察到的是整体的传输效率和前接合子的数量明显HFR....

Results

GIs 揭示了基因之间的功能关系。同样，由于同一通路中的基因显示出相似的 GI 模式，而 GI 谱相似性代表了表型的一致性，因此我们可以通过聚类它们的 GI 谱来将功能相关的基因分组到通路中。将 GI 和 GI 相关网络与物理交互信息或其他关联数据（例如基因组上下文 （GC） 关系）集成，还可以揭示定义细菌核心生物系统（和系统串扰）的高阶功能模块的组织。例如，与酵母^{4、6、7、26} 一样，表现出缓解相互作用的大肠杆菌基因对也具有高度相关的 GI 谱，往往编码物理相关的蛋白质（例如，形成复合物;图 4a）或在共同的生化途径中连贯地起作用（例如线性级联中的成分）。一个具有代表性的例子如图 4b 所示，其中功能冗余的 Isc 和 Suf 途径的组分共同参与基本的 Fe-S 生物合成过程，形成不同的簇，这些簇通过广泛的加重相互作用（即合成致死性）连接在一起。统计测量（例如超几何分布函数²⁷）可用于 GI 或 GI 相关数据，以发现通路之间和通路内.......

Discussion

我们提出了一个逐步的协议，，为使用机器人ESGA筛选，调查细菌的基因的功能，通过询问GI的途径。这种方法可以被用来研究单个基因，以及在大肠杆菌中的整个生物系统大肠杆菌 。小心地执行上述实验步骤，包括所有适当的控制措施，并进行认真分析和独立验证的GI的数据是新功能的发现成功的ESGA的关键方面。此外ESGA，在概念上类似的方法研究GI E.被称为GIANT大肠杆菌， 大肠杆菌 ，可以用来照亮新的功能性的关系，往往错过了其他的方法，如蛋白质组学²³或表型的¹³屏幕。然而，由于与任何全基因组的方法，限制的适用性ESGA或GIANT大肠杆菌的存在，例如，其他细菌。这在一定程度是导致的大多数细菌物种的全基因组单基因缺失突变株的集合不可用，特别是对物种进行有针对性的突变也阻碍了低自然频率的同源重组。在这种情况下，使用诸如随机可追踪TnSeq ³¹像诱变作用为基础的检测方法的基因中断可以潜在地用于调查细菌基因的功能。概述了新兴替代的细菌基因的筛选程序，审查文件由Gagarinova和Emili（2012年^.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. 抗生素
氯霉素	Bioshop	#CLR201
卡那霉素		#KAN201
氨苄青霉素		# AMP201
2.Luria-Bertani medium
LB 粉末	Bioshop	#LBL405
琼脂	Bioshop	#AGR003
3。细菌菌株和质粒
Hfr Cavalli 菌株 λred system （JL238）	Babu et al.14.
pKD3	大肠杆菌基因储备中心，耶鲁
庆应义塾大肠杆菌 F- 受体收藏	日本国家生物资源项目 （NBRP）11
亚型大肠杆菌 F- SPA 标签菌株	开放生物系统;Babu et al.14
4.引物
pKD3 基脱盐常数引物			F1：5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1：5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'
脱盐定制引物			Cm-R：5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3' Cm-F：5'-GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'
脱盐定制引物			F2 和 R2：基于 pKD3 序列的 20 nt 恒定区和 45 nt 自定义同源区 F2 恒定区： 5'-CATATGAATCCTCCTTA-3' R2 恒定区： 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 和 S2：27 nt 恒定区，用于引发 SPA-Cm 盒的扩增和 45 nt 定制同源区 S1 恒定区： 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAAG -3' S2 恒定区： 5'- GGCCCCATATGAATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F 和 KOCO-C：距离非必需基因缺失位点或必需 基因 SPA 标签插入位点 200 bp 的 20 nt 引物
5。PCR 和电泳试剂
Taq DNA 聚合酶	Fermentas	# EP0281
10X PCR 缓冲液	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
琼脂糖	Bioshop	# AGA002
上样染料	NEB	#B7021S
化乙锭	Bioshop	# ETB444
10X TBE缓冲液	Bioshop	# ETB444.10
Tris碱	Bioshop	# TRS001
硼酸	Sigma	# T1503-1KG
0.5 M EDTA（pH 8.0）	Sigma	# B6768-500G
DNA分子量标准	品 NEB	#N3232L
6.DNA 分离和纯化试剂盒
基因组 DNA 分离和纯化试剂盒	Promega	#A1120
质粒中型试剂盒	Qiagen	# 12143
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	#28104
7.PCR、转化和复制钉固定设备
热循环仪	BioRad、iCycler
琼脂糖凝胶电泳	BioRad
电穿孔仪	Bio-Rad GenePulser II
0.2 cm 电穿孔比色皿	Bio-Rad
42 °C 水浴摇床	Innova 3100
贝克曼库尔特 TJ-25 离心机	贝克曼库尔特
32 &度;C 摇床	New Brunswick Scientific，美国
32 °C 板培养箱	Fisher Scientific
RoToR-HDA 台式机器人	胜家乐器
96、384 和 1,536 针密度垫	胜家乐器
96 或 384 长针	家乐器
8.成像设备
相机支架	Kaiser
数码相机，10 百万像素	任何供应商
灯箱，Testrite 16" x 24" 单位	Testrite
9。垫子或板 回收
10% 漂白剂	任何供应商
70% 乙醇	任何供应商
无菌蒸馏水	任何供应商
流动罩	任何供应商
紫外线灯	任何供应商
10.实验室器皿
50 ml 聚丙烯管	任何供应商
1.5 ml 微量离心管	任何供应商
250 ml 锥形片	VWR	# 29140-045
15 ml 无菌培养管	Thermo Scientific	# 366052
低温样品瓶	VWR	# 479-3221
矩形板	Singer Instruments
96 孔和 384 孔微量滴定板	Singer Instruments	Nunc
板滚轮，用于密封多孔	Sigma	#R1275
板	ABgene	# AB-0580
胶板密封	Fisher Scientific	# 13-990-14-80
°C 冷冻室	任何供应商