蛋白质复合物的鉴定 大肠杆菌 使用连续肽亲和纯化与串联质谱联用技术

摘要

结合质谱技术的标签蛋白亲和纯化（APMS）是一种强大的方法，可用于系统性绘制蛋白质相互作用网络，并研究生物过程的分子机制基础。本文中，我们描述了一种为大肠杆菌（Escherichia coli）优化的连续肽段亲和纯化（SPA）APMS流程，该方法可用于分离和表征稳定的多蛋白复合物，即使起始时每个细胞中目标蛋白拷贝数很低，也能实现接近均一的纯化。

摘要

由于大多数细胞过程由大分子组装体介导，系统性鉴定蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）以及多蛋白复合物的亚基组成，有助于揭示基因功能并加深对生物系统的理解^{1, 2}。通过在接近生理条件下，基于染色体标记蛋白的亲和纯化联合质谱技术（APMS），大规模分离和表征内源性蛋白复合物，可高置信度地绘制出物理相互作用图谱。该方法已成功应用于进化上多样化的生物体，包括酵母、果蝇、线虫、哺乳动物细胞和细菌^1-6。特别是，我们建立了一种C端连续肽段亲和（SPA）双标签系统，用于从培养的革兰氏阴性大肠杆菌（Escherichia coli）中亲和纯化天然蛋白复合物，所用宿主实验室菌株具有良好的遗传可操作性，适用于对原核生物基本生物学特征及保守过程进行全基因组水平的研究^{1, 2, 7}。我们的SPA标签系统类似于最初为酵母开发的串联亲和纯化方法^{8, 9}，包含一个钙调蛋白结合肽（CBP），其后接高度特异性的烟草蚀刻病毒（tobacco etch virus，TEV）蛋白酶切割位点以及三个FLAG表位重复序列（3X FLAG），从而实现两轮连续的亲和富集。在扩增标签盒后，编码SPA标签和可筛选标记的序列特异性线性PCR产物被整合并在DY330背景菌株中以C端融合形式同框表达，该菌株可被诱导瞬时表达高效的异源噬菌体λ重组系统¹⁰。随后使用钙调蛋白和抗FLAG亲和微珠进行两步纯化，能够高效且高选择性地从大规模培养物中回收即使丰度极低的蛋白复合物。再通过串联质谱技术，以高灵敏度（检测限达纳克级）鉴定稳定共纯化的蛋白质。

本文描述了我们通常用于系统性蛋白质标记、纯化及基于质谱分析大肠杆菌（E. coli）可溶性蛋白复合物的详细分步实验流程，该方法可放大规模，并有望适用于其他细菌物种，包括某些可进行重组工程操作的机会性病原体。所获得的物理相互作用常能揭示出有趣的意外组分和连接关系，提示新的作用机制。将蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）数据与其它分子关联数据（如遗传学（基因-基因）相互作用和基因组上下文（GC）预测）整合，有助于阐明生物通路中多蛋白复合物的全局分子组织结构。针对大肠杆菌（E. coli）构建的相互作用网络可用于深入了解目前功能注释尚不完善的其他微生物中同源基因产物的功能架构。

方案

1. 基因特异性SPA标签的构建 大肠杆菌 DY330菌株

1. 包含 SPA 标签 DNA 序列和卡那霉素抗性标记盒（Kan）的质粒 pJL148^R) 用作聚合酶链式反应（PCR）扩增的模板⁷使用一条位于目标基因终止密码子上游、长45 nt的基因特异性正向引物，该引物与一段长27 bp（5'- AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3'）的标签特异性正向引物同框连接；同时使用一条位于目标基因终止密码子下游、长45 nt的基因特异性反向引物，该引物与一段长27 bp（5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3'）的标签特异性反向引物同框连接，用于扩增SPA标签和Kan抗性基因^R 使用以下PCR循环条件，从pJL148中扩增片段：94 °C，5 分钟；30 个循环：94 °℃ 1分钟，55 °℃ 1分钟，68 °℃ 2 分 10 秒，随后 68 °C，离心10分钟。这些扩增产物可作为外源引入的 λ-Red同源重组系统（见下文）。
2. 使用Qiaquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，以去除可能干扰电穿孔的盐分。随后将纯化的PCR产物靶向整合至DY330菌株中特定基因的3'端（即天然终止密码子的正上游区域）。 λ- 表达Red重组系统¹⁰.
3. DY330 &lam....

结果

当在对数生长期培养物中以内源水平表达的标记诱饵蛋白经亲和纯化后，将样品在银染凝胶上电泳，以观察所分离的稳定复合物中的各个多肽组分。我们还取另一部分亲和纯化的蛋白样品进行无凝胶串联质谱分析（LCMS），以鉴定相应的多肽序列。本亲和纯化质谱（APMS）方法的有效性通过RNA聚合酶（RNAP）和SufBCD铁硫（Fe-S）蛋白复合物组分的代表性SDS-PAGE分析结果加以展示，这些复合物系从 E. coli （图 1C 和 D）. 两种均带有SPA标签的RNAP σ⁷⁰ (RpoD) 和 YacL（一种功能未知的蛋白质）与核心 RNA 聚合酶（RNAP）特异性共纯化 例如α（RpoA）、β（RpoB）和β'（RpoC）亚基，以及RNA聚合酶循环因子（HepA）。与标记的RpoD不同，YacL还额外结合了一种重要的转录终止/抗终止因子（NusG），提示其在转录过程中具有特殊功能。我们还通过LCMS检测到若干其他较小的共纯化蛋白，这些蛋白在凝胶上不明显，包括RNA聚合酶ω亚基RpoZ，以及转录终止/抗终止因子NusA和NusD，分别与标记的RpoD或Yac.......

讨论

此处所述基于 SPA 的 APMS 方法的一个关键特点是，标记是在天然染色体环境中进行的，从而确保了正常的基因调控得以维持（i.e. 保留天然诱饵基因的启动子，因此表达水平不受干扰），并能够以接近内源性水平回收天然稳定结合的蛋白质复合物。通过在筛选标记中引入向外定向的启动子，还可避免操纵子极性问题。该 SPA 标记方法的效率足以将低丰度复合物的组分纯化至接近均一的程度，包括膜相关复合物，即使这些亚基在每个细菌细胞中的表达量仅有数个分子。总体而言，本方案可轻松扩展，用于在 E. coli 中大规模纯化大量标记的可溶性蛋白质，原则上也可适用于任何可通过重组工程实现标记的其他细菌物种，或具有天然高效转化能力的物种，例如近年来作为细菌遗传学新兴模式菌株的不动杆菌（Acinetobacter），该菌已被用于构建靶向基因敲除的菌株文库¹³。

大规模蛋白质组学方法存在一个主要问题，即会鉴定出大量非特异性的相互作用蛋白以及微量污染。尽管进行了两轮富集，我们常规的 SPA 纯化实验仍经常检测到常见的污染物，这些通常是高丰度的管家蛋白，例如核.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
一、抗生素
卡那霉素	Bioshop	#KAN201
氨苄青霉素	Bioshop	#AMP201
2. 优质肉汤培养基
生物胰蛋白胨	Bioshop	#TRP 402
酵母提取物	Bioshop	#YEX 555
甘油	Bioshop	#GLY 002
K2人类表型本体4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303
3. 细菌菌株与质粒
DY330		Yu 等人. (2000)10
pJL148		Zeghouf 等人. (2004)7
4. PCR与电泳试剂
Taq DNA聚合酶	费马塔斯	# EP0281
10 X PCR缓冲液	费玛塔斯	# EP0281
10 mM dNTPs	费马塔斯	# EP0281
25 mM MgCl2	费马塔斯	# EP0281
琼脂糖	Bioshop	# AGA002
上样缓冲液	NEB	#B7021S
溴化乙锭	Bioshop	# ETB444
10X TBE缓冲液	Thermo Scientific	#28355
Tris碱	Bioshop	#TRS001
硼酸	Bioshop	#BOR001
0.5 M EDTA（pH 8.0）	西格玛	# E6768
DNA 标准分子量标记	NEB	#N3232L
5. 质粒提取与纯化试剂盒
质粒中量提取试剂盒	Qiagen	#12143
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	#28104
6. PCR与转化实验设备
热循环仪	BioRad	iCycler
琼脂糖凝胶电泳	伯乐（BioRad）
电穿孔仪	Bio-Rad	GenePulser II
0.2 cm 电穿孔比色皿	Bio-Rad
42 °C 水浴摇床		Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 离心机	Beckman Coulter	TS-5.1-500
32 °C Shaker	美国新不伦瑞克科学公司
32 °C 大型 Shaker	美国新不伦瑞克科学公司
32 °C板培养箱	Fisher Scientific
7. 电泳与蛋白质印迹
丙烯酰胺单体，N,N'-亚甲基双丙烯酰胺	Bio-Rad	#161-0125
过硫酸铵	Bioshop	# AMP001
正丁醇	西格玛	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
沃特曼1号滤纸	Fischer Scientific	#09-806A
Mini Protean 3 电泳槽	伯乐（Bio-Rad）	#165-3301
iBlot凝胶转印装置	Invitrogen	#IB1001
硝酸纤维素膜	Bio-Rad	#162-0115
单克隆抗Flag M2抗体	西格玛	#F3165
辣根过氧化物酶	Amersham	#NA931V
预染蛋白质分子量标准	Bio-Rad	#161-0363
化学发光试剂	PIERCE	#1856136
放射自显影胶片	Clonex Corp	#CLEC810
快速转印印迹纸	西格玛	#P7796
C2 平台摇床	美国新不伦瑞克科学公司
8. 超声破碎设备与试剂
超声波破碎仪	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
蛋白酶抑制剂	罗氏	#800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
9. 亲和纯化试剂与设备
0.8 x 4 cm Bio-Rad 聚丙烯柱	Bio-Rad	#732-6008
Benzonase核酸酶	Novagen	#70746
Anti-FLAG M2 琼脂糖珠	Sigma	#A2220
钙调蛋白-Sepharose珠	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV 蛋白酶	Invitrogen	#12575-015
Triton X-100	西格玛	#T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake 摇床	Thermolyne	#59558
10. 银染试剂
甲醇	Bioshop	#MET302
乙酸	Bioshop	t#ACE222
硫代硫酸钠	西格玛	#S-7143
硝酸银	Fischer Scientific	#S181-100
甲醛	Bioshop	#FOR201
碳酸钠	Bioshop	#SOC512
11. 蛋白质鉴定的试剂与设备
胰蛋白酶金，质谱级	普洛麦格	# V5280
50 mM NH₄HCO₃4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl₂2	Bioshop	#CCL302
乙腈	Sigma	#A998-4
甲酸	西格玛	#F0507
HPLC级水	西格玛	#95304
碘乙酰胺	西格玛	#16125
Millipore Zip-Tip	默克密理博	# ZTC18M960
约10厘米的3 μm Luna-C18 树脂	Phenomenex
Proxeon nano HPLC 泵	Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos 质谱仪		赛默飞世尔科技
12. 实验器材
4升锥形瓶	VWR	#89000-372
50 ml 聚丙烯圆底离心管	任何供应商
1.5 ml 微型离心管	任何供应商
250 ml 锥形瓶	VWR	#29140-045
15 ml 无菌培养管	Thermo Scientific	#366052
冷冻管	VWR	#479-3221
-80 °C 冷冻柜	Fisher Scientific	#13-990-14
真空浓缩系统	Thermo Scientific
缓冲液与溶液 1. 1 升超丰富肉汤（Terrific Broth，TB）培养基 11 g 生物胰蛋白胨 22 克酵母提取物 2% 甘油 50 ml 钾盐储备液 2. 钾盐储备液 1.5 M K2人类表型本体4 0.35 M KH2PO4 3. 超声缓冲液 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 10% 甘油 使用前加入蛋白酶抑制剂（PI）和 0.1–0.5 mM TCEP 4. AFC 缓冲液 30 mM Tris-HCl（pH 7.9） 150 mM NaCl 0.1% 去垢剂 使用前加入 PI 和 0.1–0.5 mM TCEP 5. TEV 裂解缓冲液 30 mM Tris-HCl（pH 7.9） 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 0.1% 去垢剂 使用前加入 PI 和 0.1–0.5 mM TCEP 6. 钙调蛋白结合缓冲液 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl₂2 0.1% 去垢剂 使用前加入 PI 和 0.1–0.5 mM TCEP 7. 钙调蛋白洗涤缓冲液 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl₂2 0.1–0.5 mM TCEP 8. 钙调蛋白洗脱缓冲液 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1–0.5 mM TCEP 9. 显影液（1 L） 37% 甲醛 30 g 碳酸钠 1000 ml 蒸馏水 10. 消化缓冲液 50 mM NH₄HCO₃4HCO3 1 mM CaCl₂2 11. 润洗与平衡溶液 含0.1%甲酸的70%乙腈（ACN） 12. 洗涤液 100% H2O 在 0.1% 甲酸中