蛋白复合物的鉴定大肠杆菌

Summary

亲和纯化标签蛋白结合质谱（APMS）是一个功能强大的蛋白质相互作用网络系统的映射方法和调查的生物过程的机理的基础。在这里，我们描述了一个优化的顺序肽亲和力（SPA）APMS程序开发的细菌大肠杆菌，可用于分离和表征到接近均匀性，甚至从每个细胞的拷贝数低的稳定的多蛋白复合物。

Abstract

由于大多数大分子组件，系统识别的蛋白-蛋白相互作用（PPI）和确定的亚基组成的多蛋白复合物，可以帮助了解基因的功能和增进了解的生物系统^1，2介导的细胞过程。可以被映射的物理相互作用，与高的信心vialarge规模接近生理条件下，基于与质谱（APMS）亲和纯化的染色体标记的蛋白质组合的内源性蛋白复合物的分离和鉴定的。这种方法已成功地应用在进化上不同的生物，包括酵母，果蝇，蠕虫病毒，哺乳动物细胞和细菌^1-6。特别是，我们已经产生了一个羧基末端的顺序肽亲和（SPA）亲和纯化的天然蛋白复合物从培养革兰阴性大肠杆菌双标记系统，使用GEnetically听话的主机实验室菌株全基因组调查的基本生物学和保守的过程中原核生物^1，2，7，非常适合。我们的SPA标记系统是类似于酵母^8，9最初开发的串联亲和纯化方法，由钙调蛋白结合肽（CBP）的后跟的高度特异性的烟草蚀刻病毒 （TEV）蛋白酶的切割位点和三个副本FLAG表位（3X FLAG），允许两个连续两轮亲和富集。盒扩增后，序列特异性的线性编码的SPA-tag和可选择标记的PCR产物是集成的，表示帧作为羧基末端融合在DY330背景下，瞬时表达被诱导高效率的异源λ噬菌体重组系统^10。随后的双步纯化使用调钙蛋白和抗FLAG亲和珠使高度选择性甚至大型文化低丰度蛋白复合物和有效的恢复。串联质谱法，然后使用，以确定稳定地共同净化蛋白具有高灵敏度（低纳克检出限）。

在这里，我们将详细介绍一步一步的程序，我们通常使用的系统蛋白标记，分离纯化和质谱为基础的分析可溶性蛋白复合物E.大肠杆菌 ，可以按比例增加和潜在的针对其他细菌物种，包括某些服从重组工程的机会病原体。由此产生的物理相互作用通常可以发现有趣的组件和连接提出新的机械链接。 PPI数据整合与的备用分子协会提供的数据，如遗传（基因 - 基因）的相互作用和基因组上下文（GC）的预测可以方便的多蛋白复合物的的全球分子组织的澄清在BI目的论的途径。 E.产生的网络大肠杆菌可以使用的功能结构，其他微生物的同源基因产品的功能注释目前缺乏深入了解。

Protocol

1。 SPA标记基因特异性E.建设大肠杆菌 DY330应变

1. 包围的质粒pJL148 SPA-标签的DNA序列和卡那霉素的抗生素抗性标记盒（阚^R）被用作聚合酶链反应（PCR）扩增⁷中的一个模板。一名45 nt的特定基因的正向引物，位于紧接在帧的目标基因的终止密码子的上游侧与一个27 bp的（5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3'）标记特定的正向引物，和一个45 nt的基因特异的反向引物，位于紧接在帧与一个27 bp的（GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT 5'-3'），标记特定的反向引物，靶基因的终止密码子下游的是用于扩增的SPA-标签和^Kanŕ盒从pJL148使用以下的PCR循环条件为:94 ℃下5分钟，30个循环的94℃1分钟，55℃下1分钟，68℃下2分10秒，然后通过68℃10分钟。这些扩增的序列服务s衬底为异位引入的λ-红同源重组机制（见下文）。
2. 将PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒进行纯化，以去除盐，可能会干扰电穿孔。纯化的PCR产物随后针对整合DY330菌株，其中的λ-Red重组机械表示¹⁰在一个特定的基因的3'末端（紧邻上游侧的本机的终止密码子）。
3. DY330λ-红表达株在2毫升的Luria-Bertani（LB）培养基中生长过夜，在32℃以180rpm摇动。 1毫升过夜培养随后接种到70毫升的新鲜LB培养基中，在500毫升的锥形烧瓶中。接种物在32℃下生长，通过以180rpm摇动，直到OD ₆₀₀达到约0.8。
4. 将培养物转移到新鲜的250毫升锥形烧瓶中，烧瓶中，在水浴中在42℃下轻轻振荡孵育的细胞被诱导180 rpm离心15分钟。诱导后，立即在冰水浆浴保温烧瓶振摇至少30分钟。
5. 冰冷的文化立即转移到预冷的50ml聚丙烯管中，并进行离心6分钟，在4℃下3,993 xg离心将细胞沉淀重新悬浮在50毫升冰冷的无菌水，并离心，再次在4℃下以3993×g离心6分钟然后将细胞沉淀重新悬浮于1毫升冷水转移到1.5ml Effendorf管，在4℃下持续20秒，并以最大的速度离心两个或三个用冰冷的水洗涤步骤后，将细胞沉淀再悬浮终于在700微升冰冷无菌水，得到的电感受态细胞中。
6. 通过电穿孔，纯化的扩增子的1微升40微升电感受态细胞中导入。细胞在用Bio-Rad GenePulser II具有以下设置:2.5千伏，25μF用脉冲电穿孔的控制器200Ω。经过同源重组和整合，转化，成功地重组到染色体上的标记/盒的选择是基于抗菅直人（ 图1A）。选择多个转化子用于Western印迹以验证正确的代（ 即阳性信号）的SPA-标签的融合蛋白与抗FLAG M2抗体，该抗体是有选择性的对FLAG表位的SPA-标签。
7. 证实羧基末端SPA-标签融合菌株培养在一个大型隔离可溶性的蛋白质复合物，从收获的细胞使用的SPA纯化协议。亲和标记纯化过程中所涉及的步骤的概要的图1B中所示。

2。培养和超声

1. 接种100微升的SPA-标签E.入50毫升优质肉汤（TB）的大肠杆菌甘油液体培养基用50μl的25微克/毫升邻f阚溶液在250毫升的锥形烧瓶中。过夜培养的速度增长，在32°C。
   注:由于温度诱导λ红盒的控制下的一个温度敏感的阻遏物¹⁰在应变DY330，SPA-标签的大肠杆菌菌株在32℃下生长
2. 转移10毫升过夜培养的新鲜TB990毫升补充25微克/毫升的菅直人在4升的烧瓶。将培养生长在32℃下以恒定以250rpm振摇，5至6小时，直到OD ₆₀₀达到〜2至3。
3. 转移1升E.大肠杆菌 SPA，的标记文化，清洗离心瓶和旋转的细胞在4°C贝克曼J6-HC离心 ​​机@ 3993 xg离心15分钟。
4. 弃去上清液，将离心瓶。重悬E.大肠杆菌细胞沉淀用25ml的超声缓冲液。确保在任何时候都保持在冰上的离心瓶。
5. 再悬浮颗粒转移至50毫升聚丙烯Falcon管中，并用液氮冷冻。冷冻的细胞储存在-80℃下长期使用。
6. 之前，超声处理，完全解冻的冷冻细胞保持在冰上粒料。解冻的样品被转移到一个无菌的不锈钢杯置于冰上超声处理。探头浸没到样品中，并超声处理3分钟。一个额外的2分钟允许过热冷却样品。
7. 超声处理的细胞裂解液转移到预冷的无菌离心管中，并在4℃下进行离心分离15分钟两次使用JA-17转子@ 35,267 xg离心（16000转）在Beckman离心机。
   注意:在膜蛋白质的纯化的情况下，超声处理的细胞裂解物只有一次离心分离15分钟，因为我们不知道哪部分的膜蛋白，即，无论是在颗粒或上清液中的馏分。因此，为了避免过多的损失的mem跨膜蛋白，我们旋转在高速离心15分钟，且上清液进行随后进行纯化处理（参见下面的步骤），其中1％的洗涤剂用于溶解膜蛋白的细胞。
8. 从离心管的上清液小心转入到一个50毫升聚丙烯Falcon管中，并用液氮冷冻。超声处理的冷冻的细胞提取物在-80℃的6个月期间的最大存储以备将来使用。

3。亲和纯化

1. 在使用之前，100微升抗旗M2珠洗涤的AFC缓冲液（10倍体积的30毫摩尔Tris-HCl，150mM的NaCl，0.1％的洗涤剂，和0.1-0.5毫TCEP [三（2 -羧乙基）膦-盐酸]）没有洗涤剂和还原剂的TCEP（三（2 - 羧乙基）膦）。
2. 冷冻，超声处理的细胞提取物是通过放置在冷水管解冻。解冻的细胞提取物保温用3μl的苯并激酶核酸酶在4℃下30分钟到该混合物中，添加非离子型洗涤剂的Triton X-100（洗涤剂的最终浓度应为0.1％）和200μl的悬浮液的抗旗M2琼脂糖珠。
   注意:对于所有的可溶性蛋白质纯化，0.1％的Triton X-100的用来最大限度地减少非特异性吸附，其中作为一种膜蛋白，不同的温和的非离子型去污剂，如C12E8（Octaethylene乙二醇十二烷基醚），DDM净化（ n-十二烷基β-D-麦芽糖苷）和麦芽糖-新戊基乙二醇（MNG）可以在1％洗涤剂浓度使用，以提高增溶。由于不同的洗涤剂有不同的膜蛋白增溶效率，建议使用一个以上的洗涤剂来执行独立的蛋白质纯化物。
3. 的内容是通过旋转管为3小时，在4℃下使用LabQuake摇床轻轻混合。旋转3小时后，离心管在1,700×g离心6分钟。将上清液则removed小心，尽可能地不打扰宽松的珠丸。
4. 将沉淀重新悬浮于剩余的上清液，然后转移到0.8×4厘米Bio-Rad公司的聚丙烯制备柱。确保删除之列的底部插座插头，使洗脱液的重力流排水。洗柱5次与TEV裂解步骤。
5. 排出洗涤后的洗脱液后，在塔的底部出口被封闭。给相同的列，卵裂进行通过添加约5至10微升（50单位）在色谱柱上的TEV蛋白酶，1X的AFC缓冲液和400微升。确保关闭柱顶部的上限。列包含珠粒过夜，4℃过夜旋转轻轻使用LabQuake摇床。
6. 取下瓶盖的顶部和在塔底部的插座插头，和漏极TEV酶切后回收的洗脱液含有200μl的悬浮液中钙调蛋白 - 琼脂糖珠，洗涤10到一个新的列大量的钙调素结合缓冲。
7. 柱的顶部和底部的坚固地拧紧，并且在该列中的内容被通过旋转3小时，在4℃下使用LabQuake摇床轻轻混合。
8. 经过3小时的旋转，洗脱液被排出，通过删除的列的顶盖和底塞。该柱1X钙调蛋白由一个严格的洗涤用400μl的洗涤缓冲液中钙调素的结合缓冲液中，然后用200μl的洗涤四次。
9. 在四个级分50μl的一个新的Eppendorf管中，用1X钙调蛋白的洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白质。分布在两个干净的Eppendorf管中，以等体积的洗脱馏分。这两个管，其后使用高速真空干燥。
10. 干燥后的洗脱液从一个管是用于运行的银染色凝胶，而其他被存储在-80℃下，使用质谱法之前。

4。银染

1. 对于银staini纳克，3X SDS（十二烷基硫酸钠）样品缓冲液中的体积的一半加入到50微升的干燥的洗脱液。沸腾的混合物5分钟后，将样品加载到SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
2. 后凝胶运行完毕后，它被小心地放入定影溶液（50％甲醇和10％乙酸）和20分钟的旋转振荡器上轻轻搅拌。该凝胶在20％乙醇中10分钟，然后漂洗。
3. 固定凝胶10分钟用500ml双蒸水彻底洗涤两次，以确保均匀的背景低。
4. 然后轻轻搅拌该凝胶在500毫升钠硫代硫酸钠1分钟，然后由两个用蒸馏水洗涤步骤，持续20秒。
5. 水被丢弃，并且该凝胶中温育30分钟，0.1％硝酸银的200毫升。经过该时间后，硝酸银被除去，持续20秒，凝胶，用蒸馏水洗涤，以除去过量的硝酸银。
6. 终于在75毫升的手激动凝胶显影溶液。当达到所需的强度，显影溶液被丢弃，并加入80毫升乙酸，使反应停止。确保孵育凝胶在乙酸，为最少20分钟为适当的可视化的凝胶带。

5。蛋白质和样品制备的质谱分析

1. 向干燥的样品中，加入50微升的消化缓冲液，0.9微升的100mM的TCEP-HCl（三（2 -羧乙基）膦-盐酸），并在室温下孵育45分钟的混合物 用于还原步骤。接着，加入1微升的500mM碘乙酰胺温育另外40分钟，使样品烷基化在黑暗。
2. 孵化的第二轮后，添加固定化胰蛋白酶的1微克到混合物中，并在37℃下孵育5小时或在室温下过夜。确保使反应停止，加入1微升的乙酸。
3. 预湿的Millipo，重新Zip的提示通过吸液的润湿性和平衡溶液的10μl的移液管尖。分配浪费的解决方案。接着吸取10微升的洗涤溶液并和分配溶液的浪费。重复此步骤两次。
4. 对于给小费的肽混合物的有效结合，吸液混合肽混合物的20倍。附着到前端的肽混合物通过抽吸和分送洗涤溶液洗掉。重复此步骤两次有效结合的肽混合物的小费。
5. 含有结合的肽的前端，吸液的润湿性和平衡溶液10微升，和分配到一个干净的eppendorf管中。重复此步骤两次。洗脱的样品在高速真空干燥后，可以立即进行分析的样品，通过质谱法或贮存于-80℃，在使用前。

6。 LTQ Orbitrap Velos的质谱仪蛋白质鉴定

钍Ë孤立的复合物的多肽组分确定使用的LTQ Orbitrap Velos的混合串联质谱仪。的Orbitrap具有优异的分辨能力（> 60,000全宽半高，或FWHM）和质量准确度（<2 ppm），最大限度地减少MS / MS抽样的无关的非特异性背景控制净化污染物检测，同时高速Velos离子阱组件可以检测和使用两个电子转移解离和碰撞诱导解离模式的片段的低丰度肽。高置信度的匹配导致MS / MS谱之间的映射到参考E.大肠杆菌的蛋白质序列数据库搜索算法，如SEQUEST和STATQUEST ¹¹的概率算法，像评估过程中的每一个匹配的序列。总的谱号，肽序列的唯一性和阴性对照（ 即模拟）净化污染物检测到共同的背景被认为是实现一个低的实证假显示covery率。下面的步骤进行蛋白质鉴定:

1. 微色谱柱填充有〜10厘米为3μm的Luna-C _18的树脂中，并且连接到一个Proxeon纳升电离子源被放置在符合文书的Orbitrap。
2. 一个Proxeon纳米流的二进制的HPLC泵是用于提供一个稳定的尖流量约300 NL分钟^-1在多肽分离。
3. 为了达到肽洗脱，根据样品的复杂性有机缓冲液梯度设置。例如，下面的梯度通常设置的大肠杆菌大肠杆菌 SPA样品:在1分钟内，从2％至6％的溶剂B增加，在38分钟至24％，至100％，在接下来的4分钟，保持在100％，持续1分钟，然后在1分钟内减少到2％，最后15分钟保持在2％。流动相:溶剂A具有HPLC梯度95％水和5％乙​​腈，0.1％甲酸，而溶剂B有HPLC梯度5％的水和95％乙腈，含0.1％甲酸阿哲四。针尖处的流速设定为60分钟至300 NL分钟^-1。
4. 运行在60000决议通过一个完整的质量扫描随着质谱仪周期的，随之而来的串联碎片的质量扫描所收集的最激烈的前体离子。动态排除，单一同位素质量的选择，依赖于数据的实时采集仪的功能被启用。
5. 光谱使用一个数据库搜索算法对数据库的大肠杆菌如SEQUEST搜索大肠杆菌的蛋白质序列，并将结果进行统计过滤使用一个的概率算法如STAQUEST ^11，以确保低假发现率。只有高置信度（99％概率）考生选择，而比赛显示超过10 ppm的质量误差的理论肽质量进一步考虑被淘汰。

Results

一旦从对数期培养物中亲和纯化以内源水平表达的标记诱饵蛋白，样品在银染凝胶上运行，以观察分离的稳定复合物的单个多肽组分。我们还将第二部分亲和纯化的蛋白质样品进行了无凝胶串联质谱 （LCMS） 分析，以鉴定相应的多肽序列。该 APMS 程序的有效性通过对从大肠杆菌亲和纯化的 RNA 聚合酶 （RNAP） 和 SufBCD 铁硫 （Fe-S） 蛋白复合物的组分进行代表性的 SDS-PAGE 分析来显示（图 1C 和 D）。SPA 标记的 RNAP σ⁷⁰ （RpoD） 和 YacL（一种功能未知的蛋白质，与核心 RNAP 酶（例如 α （RpoA）、β （RpoB） 和 β' （RpoC） 亚基以及 RNAP 再循环因子 （HepA） 特异性共纯化。与标记的 RpoD 相比，YacL 还与必需的转录终止/抗终止因子 （NusG） 结合，表明在转录中具有特殊功能。我们还通过 LCMS 检测到了其他几种在凝胶上不明显的较小共纯化蛋白，包括 RNAP ω 亚基 RpoZ 和转录终止/抗终止因子 NusA 和 NusD，分别带有标记的 RpoD 或 YacL ...

Discussion

这里所描述的一个关键方面SPA基于APMS方法的的标记内的天然染色体背景下进行，从而确保维持正常的基因调节（ 即原生饵子保存的，因此，表达水平不扰动）和本机稳定相关蛋白质复合物中回收在近内源性水平。正负极性问题，也避免包括选择标记朝外启动。这SPA-标记的方法是有效的，足以净化组件的低丰度的配合物不久的均匀性，包括膜相关的组件，即使亚基表达下降到只有几个分子每个细菌细胞。总体而言，该协议可以很容易地扩展为净化标记的可溶性蛋白在大肠杆菌中的大套大肠杆菌或原则上任何其他细菌物种的标记通过重组工程是可能的，或者是那些具有自然高转换的TION能力，如不动杆菌，细菌遗传学的一个新兴的主力，已被使用，例如，，到建立一个应变库，有针对性的基因敲除^13。

固有的大规模蛋白质组学方法的一个主要关注是混杂的非特异性团团员和虚假的痕量污染的鉴定。尽管两轮丰富，我们的日常SPA净化定期检测常见的污染物，通常是高丰度的看家蛋白，如核糖体蛋白和伴侣，非特异性结合的色谱树脂和/或诱饵蛋白。在两种方式中，这个问题可以得到缓解。首先，确定每...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. 抗生素
卡那霉素	Bioshop	#KAN201
氨苄青霉素	Bioshop	#AMP201
2.极好的肉汤培养基
Bio-胰蛋白胨	Bioshop	#TRP 402
酵母提取物	Bioshop	#YEX 555
甘油	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303
3.细菌菌株和质粒
DY330		Yu et al.（2000）10
pJL148		Zeghouf et al.（2004）7<
Taq DNA 聚合酶	Fermentas	# EP0281
10 X PCR 缓冲液	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
琼脂糖	Bioshop	# AGA002
加载染料	NEB	#B7021S
化乙锭	Bioshop	# ETB444
10X TBE 缓冲液	Thermo Scientific	#28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
硼酸	Bioshop	#BOR001
0.5 M EDTA （pH 8.0）	Sigma	# E6768
DNA 分子量标准	NEB	#N3232L
5.质粒分离和纯化试剂盒
质粒中型试剂盒	Qiagen	#12143
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	#28104
6.PCR 和转化设备
热循环仪	BioRad	iCycler
琼脂糖凝胶电泳	BioRad
电穿孔仪	Bio-Rad	GenePulser II
0.2 cm 电穿孔比色皿	Bio-Rad
42 °C 水浴摇床		Innova 3100
贝克曼库尔特 TJ-25 离心机	贝克曼库尔特	TS-5.1-500
32 °C Shaker	New Brunswick Scientific，美国
32 °C 大摇床	New Brunswick Scientific，美国
32 °C 板培养箱	Fisher Scientific
7.电泳和蛋白质印迹
丙烯酰胺单体，N，N'-亚甲基双丙烯酰胺	Bio-Rad	#161-0125
过硫酸铵	Bioshop	# AMP001
正丁醇	Sigma	# B7906
	TEMED Bioshop	#TEM001
Whatman 1 号滤纸	Fischer Scientific	#09-806A
Mini protean 3 细胞	Bio-Rad	#165-3301
iBlot 凝胶转印装置	Invitrogen	#IB1001
硝酸纤维素膜	Bio-Rad	#162-0115
单克隆抗 Flag M2 抗体	Sigma	#F3165
辣根过氧化物酶	Amersham	#NA931V
预染蛋白质分子量标准品	Bio-Rad	#161-0363
化学发光试剂	PIERCE#	1856136
放射自显影胶片	Clonex Corp	#CLEC810
Quick Draw 印迹纸	Sigma	#P7796
C2 平台摇床	New Brunswick Scientific， USA
Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
蛋白酶抑制剂	Roche	#800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
9。亲和纯化试剂和设备
0.8 x 4 cm Bio-Rad 聚丙烯柱	Bio-Rad	#732-6008
苯佐酶核酸酶	Novagen	#70746
抗 FLAG M2 琼脂糖珠	Sigma	#A2220
钙调蛋白-琼脂糖珠	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV 蛋白酶	Invitrogen	#12575-015
Triton X-100	Sigma	#T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake 摇床	Thermolyne	#59558
10.银染试剂
甲醇	Bioshop	#MET302
乙酸	Bioshop	t#ACE222
硫代硫酸钠	Sigma	#S-7143
硝酸银	Fischer Scientific	#S181-100
甲醛	Bioshop	#FOR201
碳酸	钠Bioshop	#SOC512<
胰蛋白酶金，质谱级	Promega	# V5280
50 mM NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl2	Bioshop	#CCL302
乙腈	Sigma	#A998-4
甲酸酸	性 Sigma	#F0507
HPLC 级水	Sigma	#95304
碘乙酰胺	Sigma	#16125
Millipore Zip-Tip	Millipore	# ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 树脂	Phenomenex
Proxeon 纳米 HPLC 泵	Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos 质谱仪		Thermo Fisher Scientific
12。实验室器皿
4 升锥形瓶	VWR	#89000-372
50 ml 聚丙烯猎鹰管	任何供应商
1.5 ml 微量离心管	任何供应商
250 ml 锥形薄片	VWR	#29140-045
15 ml 无菌培养管	Thermo Scientific	#366052
低温样品瓶	VWR	#479-3221-80
°C 冷冻机	Fisher Scientific	#13-990-14
高速真空系统	Thermo Scientific
缓冲液和溶液 1. 1 升极好的肉汤 （TB） 培养基 11 g 生物胰蛋白胨 22 g 酵母提取物 2% 甘油 50 ml 钾盐原液solution 2.钾盐原液 1.5 M K2HPO4 0.35 M KH2PO4 3.超声处理缓冲液 20 mM Tris-HCl （pH 7.9） 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 10% 甘油 使用前加入蛋白酶抑制剂 （PI） 和 0.1-0.5 mM TCEP 4。AFC 缓冲液 30 mM Tris-HCl （pH 7.9） 150 mM NaCl 0.1% 去污剂 使用前加入 PI 和 0.1-0.5 mM TCEP 5。TEV 裂解缓冲液 30 mM Tris-HCl （pH 7.9） 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 0.1% 去污剂 使用前加入 PI 和 0.1-0.5 mM TCEP 6。钙调蛋白结合缓冲液 30 mM Tris-HCl （pH 7.9） 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1% 去污剂 使用前加入 PI 和 0.1-0.5 mM TCEP 7。钙调蛋白洗涤缓冲液 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1-0.5 mM TCEP 8.钙调蛋白洗脱缓冲液 30 mM Tris-HCl （pH 7.9） 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1-0.5 mM TCEP 9.展开液 （1L） 37% 甲醛 30 g 碳酸钠 1000 ml 蒸馏水 10.消化缓冲液 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11。润湿和平衡溶液 70% 乙腈 （ACN） 的 0.1% 甲酸溶液 12.洗涤液 100% H2O 溶于 0.1% 甲酸