蛋白复合物的鉴定大肠杆菌

Summary

亲和纯化标签蛋白结合质谱（APMS）是一个功能强大的蛋白质相互作用网络系统的映射方法和调查的生物过程的机理的基础。在这里，我们描述了一个优化的顺序肽亲和力（SPA）APMS程序开发的细菌大肠杆菌，可用于分离和表征到接近均匀性，甚至从每个细胞的拷贝数低的稳定的多蛋白复合物。

Abstract

由于大多数大分子组件，系统识别的蛋白-蛋白相互作用（PPI）和确定的亚基组成的多蛋白复合物，可以帮助了解基因的功能和增进了解的生物系统^1，2介导的细胞过程。可以被映射的物理相互作用，与高的信心vialarge规模接近生理条件下，基于与质谱（APMS）亲和纯化的染色体标记的蛋白质组合的内源性蛋白复合物的分离和鉴定的。这种方法已成功地应用在进化上不同的生物，包括酵母，果蝇，蠕虫病毒，哺乳动物细胞和细菌^1-6。特别是，我们已经产生了一个羧基末端的顺序肽亲和（SPA）亲和纯化的天然蛋白复合物从培养革兰阴性大肠杆菌双标记系统，使用GEnetically听话的主机实验室菌株全基因组调查的基本生物学和保守的过程中原核生物^1，2，7，非常适合。我们的SPA标记系统是类似于酵母^8，9最初开发的串联亲和纯化方法，由钙调蛋白结合肽（CBP）的后跟的高度特异性的烟草蚀刻病毒 （TEV）蛋白酶的切割位点和三个副本FLAG表位（3X FLAG），允许两个连续两轮亲和富集。盒扩增后，序列特异性的线性编码的SPA-tag和可选择标记的PCR产物是集成的，表示帧作为羧基末端融合在DY330背景下，瞬时表达被诱导高效率的异源λ噬菌体重组系统^10。随后的双步纯化使用调钙蛋白和抗FLAG亲和珠使高度选择性甚至大型文化低丰度蛋白复合物和有效的恢复。串联质谱法，然后使用，以确定稳定地共同净化蛋白具有高灵敏度（低纳克检出限）。

在这里，我们将详细介绍一步一步的程序，我们通常使用的系统蛋白标记，分离纯化和质谱为基础的分析可溶性蛋白复合物E.大肠杆菌 ，可以按比例增加和潜在的针对其他细菌物种，包括某些服从重组工程的机会病原体。由此产生的物理相互作用通常可以发现有趣的组件和连接提出新的机械链接。 PPI数据整合与的备用分子协会提供的数据，如遗传（基因 - 基因）的相互作用和基因组上下文（GC）的预测可以方便的多蛋白复合物的的全球分子组织的澄清在BI目的论的途径。 E.产生的网络大肠杆菌可以使用的功能结构，其他微生物的同源基因产品的功能注释目前缺乏深入了解。

Protocol

1。 SPA标记基因特异性E.建设大肠杆菌 DY330应变

1. 包围的质粒pJL148 SPA-标签的DNA序列和卡那霉素的抗生素抗性标记盒（阚^R）被用作聚合酶链反应（PCR）扩增⁷中的一个模板。一名45 nt的特定基因的正向引物，位于紧接在帧的目标基因的终止密码子的上游侧与一个27 bp的（5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3'）标记特定的正向引物，和一个45 nt的基因特异的反向引物，位于紧接在帧与一个27 bp的（GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT 5'-3'），标记特定的反向引物，靶基因的终止密码子下游的是用于扩增的SPA-标签和^Kanŕ盒从pJL148使用以下的PCR循环条件为:94 ℃下5分钟，30个循环的94℃1分钟，55℃下1分钟，68℃下2分10秒，然后通过68℃10分钟。这些扩增的序列服务s衬底为异位引入的λ-红同源重组机制（见下文）。
2. 将PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒进行纯化，以去除盐，可能会干扰电穿孔。纯化的PCR产物随后针对整合DY330菌株，其中的λ-Red重组机械表示¹⁰在一个特定的基因的3'末端（紧邻上游侧的本机的终止密码子）。
3. DY330λ-红表达株在2毫升的Luria-Bertani（LB）培养基中生长过夜，在32℃....

Results

一旦从对数期培养物中亲和纯化以内源水平表达的标记诱饵蛋白，样品在银染凝胶上运行，以观察分离的稳定复合物的单个多肽组分。我们还将第二部分亲和纯化的蛋白质样品进行了无凝胶串联质谱 （LCMS） 分析，以鉴定相应的多肽序列。该 APMS 程序的有效性通过对从大肠杆菌亲和纯化的 RNA 聚合酶 （RNAP） 和 SufBCD 铁硫 （Fe-S） 蛋白复合物的组分进行代表性的 SDS-PAGE 分析来显示（图 1C 和 D）。SPA 标记的 RNAP σ⁷⁰ （RpoD） 和 YacL（一种功能未知的蛋白质，与核心 RNAP 酶（例如 α （RpoA）、β （RpoB） 和 β' （RpoC） 亚基以及 RNAP 再循环因子 （HepA） 特异性共纯化。与标记的 RpoD 相比，YacL 还与必需的转录终止/抗终止因子 （NusG） 结合，表明在转录中具有特殊功能。我们还通过 LCMS 检测到了其他几种在凝胶上不明显的较小共纯化蛋白，包括 RNAP ω 亚基 RpoZ 和转录终止/抗终止因子 NusA 和 NusD，分别带有标记的 RpoD 或 YacL .......

Discussion

这里所描述的一个关键方面SPA基于APMS方法的的标记内的天然染色体背景下进行，从而确保维持正常的基因调节（ 即原生饵子保存的，因此，表达水平不扰动）和本机稳定相关蛋白质复合物中回收在近内源性水平。正负极性问题，也避免包括选择标记朝外启动。这SPA-标记的方法是有效的，足以净化组件的低丰度的配合物不久的均匀性，包括膜相关的组件，即使亚基表达下降到只有几个分子每个细菌细胞。总体而言，该协议可以很容易地扩展为净化标记的可溶性蛋白在大肠杆菌中的大套大肠杆菌或原则上任何其他细菌物种的标记通过重组工程是可能的，或者是那些具有自然高转换的TION能力，如不动杆菌，细菌遗传学的一个新兴的主力，已被使用，例如，，到建立一个应变库，有针对性的基因敲除^13。

固有的大规模蛋白质组学方法的一个主要关注是混杂的非特异性团团员和虚假的痕量污染的鉴定。尽管两轮丰富，我们的日常SPA净化定期检测常见的污染物，通常是高丰度的看家蛋白，如核糖体蛋白和伴侣，非特异性结合的色谱树脂和/或诱饵蛋白。在两种方式中，这个问题可以得到缓解。首先，确定每.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. 抗生素
卡那霉素	Bioshop	#KAN201
氨苄青霉素	Bioshop	#AMP201
2.极好的肉汤培养基
Bio-胰蛋白胨	Bioshop	#TRP 402
酵母提取物	Bioshop	#YEX 555
甘油	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303
3.细菌菌株和质粒
DY330		Yu et al.（2000）10
pJL148		Zeghouf et al.（2004）7<
Taq DNA 聚合酶	Fermentas	# EP0281
10 X PCR 缓冲液	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
琼脂糖	Bioshop	# AGA002
加载染料	NEB	#B7021S
化乙锭	Bioshop	# ETB444
10X TBE 缓冲液	Thermo Scientific	#28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
硼酸	Bioshop	#BOR001
0.5 M EDTA （pH 8.0）	Sigma	# E6768
DNA 分子量标准	NEB	#N3232L
5.质粒分离和纯化试剂盒
质粒中型试剂盒	Qiagen	#12143
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	#28104
6.PCR 和转化设备
热循环仪	BioRad	iCycler
琼脂糖凝胶电泳	BioRad
电穿孔仪	Bio-Rad	GenePulser II
0.2 cm 电穿孔比色皿	Bio-Rad
42 °C 水浴摇床		Innova 3100
贝克曼库尔特 TJ-25 离心机	贝克曼库尔特	TS-5.1-500
32 °C Shaker	New Brunswick Scientific，美国
32 °C 大摇床	New Brunswick Scientific，美国
32 °C 板培养箱	Fisher Scientific
7.电泳和蛋白质印迹
丙烯酰胺单体，N，N'-亚甲基双丙烯酰胺	Bio-Rad	#161-0125
过硫酸铵	Bioshop	# AMP001
正丁醇	Sigma	# B7906
	TEMED Bioshop	#TEM001
Whatman 1 号滤纸	Fischer Scientific	#09-806A
Mini protean 3 细胞	Bio-Rad	#165-3301
iBlot 凝胶转印装置	Invitrogen	#IB1001
硝酸纤维素膜	Bio-Rad	#162-0115
单克隆抗 Flag M2 抗体	Sigma	#F3165
辣根过氧化物酶	Amersham	#NA931V
预染蛋白质分子量标准品	Bio-Rad	#161-0363
化学发光试剂	PIERCE#	1856136
放射自显影胶片	Clonex Corp	#CLEC810
Quick Draw 印迹纸	Sigma	#P7796
C2 平台摇床	New Brunswick Scientific， USA
Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
蛋白酶抑制剂	Roche	#800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
9。亲和纯化试剂和设备
0.8 x 4 cm Bio-Rad 聚丙烯柱	Bio-Rad	#732-6008
苯佐酶核酸酶	Novagen	#70746
抗 FLAG M2 琼脂糖珠	Sigma	#A2220
钙调蛋白-琼脂糖珠	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV 蛋白酶	Invitrogen	#12575-015
Triton X-100	Sigma	#T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake 摇床	Thermolyne	#59558
10.银染试剂
甲醇	Bioshop	#MET302
乙酸	Bioshop	t#ACE222
硫代硫酸钠	Sigma	#S-7143
硝酸银	Fischer Scientific	#S181-100
甲醛	Bioshop	#FOR201
碳酸	钠Bioshop	#SOC512<
胰蛋白酶金，质谱级	Promega	# V5280
50 mM NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl2	Bioshop	#CCL302
乙腈	Sigma	#A998-4
甲酸酸	性 Sigma	#F0507
HPLC 级水	Sigma	#95304
碘乙酰胺	Sigma	#16125
Millipore Zip-Tip	Millipore	# ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 树脂	Phenomenex
Proxeon 纳米 HPLC 泵	Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos 质谱仪		Thermo Fisher Scientific
12。实验室器皿
4 升锥形瓶	VWR	#89000-372
50 ml 聚丙烯猎鹰管	任何供应商
1.5 ml 微量离心管	任何供应商
250 ml 锥形薄片	VWR	#29140-045
15 ml 无菌培养管	Thermo Scientific	#366052
低温样品瓶	VWR	#479-3221-80
°C 冷冻机	Fisher Scientific	#13-990-14
高速真空系统	Thermo Scientific
缓冲液和溶液 1. 1 升极好的肉汤 （TB） 培养基 11 g 生物胰蛋白胨 22 g 酵母提取物 2% 甘油 50 ml 钾盐原液solution 2.钾盐原液 1.5 M K2HPO4 0.35 M KH2PO4 3.超声处理缓冲液 20 mM Tris-HCl （pH 7.9） 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 10% 甘油 使用前加入蛋白酶抑制剂 （PI） 和 0.1-0.5 mM TCEP 4。AFC 缓冲液 30 mM Tris-HCl （pH 7.9） 150 mM NaCl 0.1% 去污剂 使用前加入 PI 和 0.1-0.5 mM TCEP 5。TEV 裂解缓冲液 30 mM Tris-HCl （pH 7.9） 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 0.1% 去污剂 使用前加入 PI 和 0.1-0.5 mM TCEP 6。钙调蛋白结合缓冲液 30 mM Tris-HCl （pH 7.9） 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1% 去污剂 使用前加入 PI 和 0.1-0.5 mM TCEP 7。钙调蛋白洗涤缓冲液 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1-0.5 mM TCEP 8.钙调蛋白洗脱缓冲液 30 mM Tris-HCl （pH 7.9） 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1-0.5 mM TCEP 9.展开液 （1L） 37% 甲醛 30 g 碳酸钠 1000 ml 蒸馏水 10.消化缓冲液 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11。润湿和平衡溶液 70% 乙腈 （ACN） 的 0.1% 甲酸溶液 12.洗涤液 100% H2O 溶于 0.1% 甲酸