结合质谱技术的标签蛋白亲和纯化（APMS）是一种强大的方法，可用于系统性绘制蛋白质相互作用网络，并研究生物过程的分子机制基础。本文中，我们描述了一种为大肠杆菌（Escherichia coli）优化的连续肽段亲和纯化（SPA）APMS流程，该方法可用于分离和表征稳定的多蛋白复合物，即使起始时每个细胞中目标蛋白拷贝数很低，也能实现接近均一的纯化。
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本文内容
摘要
摘要
由于大多数细胞过程由大分子组装体介导，系统性鉴定蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）以及多蛋白复合物的亚基组成，有助于揭示基因功能并加深对生物系统的理解1, 2。通过在接近生理条件下，基于染色体标记蛋白的亲和纯化联合质谱技术（APMS），大规模分离和表征内源性蛋白复合物，可高置信度地绘制出物理相互作用图谱。该方法已成功应用于进化上多样化的生物体，包括酵母、果蝇、线虫、哺乳动物细胞和细菌1-6。特别是，我们建立了一种C端连续肽段亲和（SPA）双标签系统，用于从培养的革兰氏阴性大肠杆菌（Escherichia coli）中亲和纯化天然蛋白复合物，所用宿主实验室菌株具有良好的遗传可操作性，适用于对原核生物基本生物学特征及保守过程进行全基因组水平的研究1, 2, 7。我们的SPA标签系统类似于最初为酵母开发的串联亲和纯化方法8, 9，包含一个钙调蛋白结合肽（CBP），其后接高度特异性的烟草蚀刻病毒（tobacco etch virus，TEV）蛋白酶切割位点以及三个FLAG表位重复序列（3X FLAG），从而实现两轮连续的亲和富集。在扩增标签盒后，编码SPA标签和可筛选标记的序列特异性线性PCR产物被整合并在DY330背景菌株中以C端融合形式同框表达，该菌株可被诱导瞬时表达高效的异源噬菌体λ重组系统10。随后使用钙调蛋白和抗FLAG亲和微珠进行两步纯化，能够高效且高选择性地从大规模培养物中回收即使丰度极低的蛋白复合物。再通过串联质谱技术，以高灵敏度（检测限达纳克级）鉴定稳定共纯化的蛋白质。
本文描述了我们通常用于系统性蛋白质标记、纯化及基于质谱分析大肠杆菌（E. coli）可溶性蛋白复合物的详细分步实验流程，该方法可放大规模，并有望适用于其他细菌物种，包括某些可进行重组工程操作的机会性病原体。所获得的物理相互作用常能揭示出有趣的意外组分和连接关系，提示新的作用机制。将蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）数据与其它分子关联数据（如遗传学（基因-基因）相互作用和基因组上下文（GC）预测）整合，有助于阐明生物通路中多蛋白复合物的全局分子组织结构。针对大肠杆菌（E. coli）构建的相互作用网络可用于深入了解目前功能注释尚不完善的其他微生物中同源基因产物的功能架构。
方案
1. 基因特异性SPA标签的构建 大肠杆菌 DY330菌株
- 包含 SPA 标签 DNA 序列和卡那霉素抗性标记盒（Kan）的质粒 pJL148R) 用作聚合酶链式反应（PCR）扩增的模板7使用一条位于目标基因终止密码子上游、长45 nt的基因特异性正向引物，该引物与一段长27 bp（5'- AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3'）的标签特异性正向引物同框连接；同时使用一条位于目标基因终止密码子下游、长45 nt的基因特异性反向引物，该引物与一段长27 bp（5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3'）的标签特异性反向引物同框连接，用于扩增SPA标签和Kan抗性基因R 使用以下PCR循环条件，从pJL148中扩增片段：94 °C，5 分钟；30 个循环：94 °℃ 1分钟，55 °℃ 1分钟，68 °℃ 2 分 10 秒，随后 68 °C，离心10分钟。这些扩增产物可作为外源引入的 λ-Red同源重组系统（见下文）。
- 使用Qiaquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，以去除可能干扰电穿孔的盐分。随后将纯化的PCR产物靶向整合至DY330菌株中特定基因的3'端（即天然终止密码子的正上游区域）。 λ- 表达Red重组系统10.
- DY330 λ- 红色荧光表达菌株在 32°C 下于 2 ml Luria-Bertani (LB) 培养基中过夜培养 °C，以180 rpm振荡培养。随后将1 ml过夜培养物接种至500 ml三角瓶中的70 ml新鲜LB培养基中。接种物在32 ℃下培养 °C，于180 rpm振荡培养至OD600 达到约 0.8。
- 将培养物转移至一个新的250 ml锥形瓶中，通过将锥形瓶置于42 °C水浴中孵育以诱导细胞表达 °C，在180 rpm条件下轻轻振荡15分钟。诱导后立即将锥形瓶置于冰水浴中，振荡孵育至少30分钟。
- 将冰冷的培养物立即转移至预冷的50 ml聚丙烯管中，在4℃下以3,993 × g离心6分钟 °C. 将细胞沉淀重悬于50 ml冰预冷的无菌水中，于4℃、3,993 × g离心6 min °C. 将细胞沉淀重悬于1 ml冷水中，转移至1.5 ml离心管中，在4℃下以最大转速离心20秒 °C. 用预冷的冰水洗涤两到三次后，将细胞沉淀最终重悬于700 μL中 μ冰浴的无菌水，制备成感受态细胞。
- 通过电穿孔，一种 μ将1微升纯化的扩增产物加入到40微升中 μ电穿孔感受态细胞的电穿孔在 Bio-Rad GenePulser II 仪器中进行，设置参数如下：2.5 kV，25 μF，脉冲控制器设置为200 Ω同源重组与整合后，通过卡那霉素抗性筛选成功将标签/盒式元件重组到染色体中的转化子图1A). 挑选多个转化子进行蛋白质印迹检测，以验证正确构建（即 使用对 SPA 标签中的 FLAG 表位具有特异性的抗 FLAG M2 抗体检测 SPA 标签融合蛋白的阳性信号。
- 经验证的羧基末端SPA标签融合菌株被大规模培养，以通过SPA纯化方案从收获的细胞中分离可溶性蛋白复合物。亲和标签纯化步骤的流程如图所示 图1B.
2. 培养与超声处理
- 将100 μl SPA标签化的 E. coli 甘油菌种接种至含有50 μl浓度为25 μg/ml卡那霉素（Kan）的50 ml优质肉汤（TB）液体培养基中，置于250 ml三角瓶内，在32 °C条件下过夜培养。
注意：由于DY330菌株中温度诱导型λ Red基因盒受温度敏感型阻遏蛋白调控10，因此SPA标签化的E. coli菌株需在32 °C下培养。 - 将10 ml过夜培养物转移至4升锥形瓶中的990 ml新鲜TB培养基中，该培养基添加有25 μg/ml卡那霉素（Kan）。在32 °C、250 rpm持续振荡条件下培养5至6小时，直至OD600达到约2至3。
- 将1升的E. coli SPA标签化培养物转移至洁净的离心瓶中，在Beckman J6-HC离心机中于4 °C、3993 × g条件下离心15分钟，收集菌体。
- 弃去离心瓶中的上清液，用25 ml超声破碎缓冲液重悬E. coli菌体沉淀。操作过程中始终将离心瓶置于冰上。
- 将重悬后的菌体沉淀转移至50 ml聚丙烯Falcon管中，并使用液氮速冻。将冷冻细胞长期保存于-80 °C备用。
- 超声处理前，将冷冻细胞置于冰上彻底解冻。将解冻后的样品转移至置于冰上的无菌不锈钢超声杯中。将超声探头浸入样品中，超声处理3分钟，随后静置冷却2分钟以防止样品过热。
- 将超声破碎后的细胞裂解液转移至预冷的无菌离心管中，在Beckman离心机中使用JA-17转子于4 °C、35,267 × g（16,000 rpm）条件下离心15分钟，重复两次。
注意：若进行膜蛋白纯化，超声破碎后的细胞裂解液仅离心一次15分钟，因为膜蛋白可能存在于沉淀或上清液中，其分布尚不明确。为避免膜蛋白过度损失，我们采用高速离心15分钟后取上清液进行后续纯化（见下文步骤），并在纯化过程中加入1%去垢剂以溶解膜蛋白。 - 小心地将离心管中的上清液转移至50 ml聚丙烯Falcon管中，并用液氮速冻。将超声处理后的冷冻细胞提取物保存于-80 °C，最长可保存6个月，以备后续使用。
3. 亲和纯化
- 使用前，100 μ10体积AFC缓冲液（30 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1%去垢剂，以及0.1–0.5 mM TCEP［三（2-羧乙基）膦］）洗涤抗FLAG M2磁珠-盐酸]，但不包含去垢剂和还原剂TCEP（三(2-羧乙基)膦）。
- 将装有冷冻超声破碎细胞提取物的离心管置于冷水中解冻。解冻后的细胞提取物与3 μ30 分钟内于 4℃ 加入苯并核酸酶 °C. 向该混合物中加入非离子型去垢剂 Triton X-100（去垢剂的终浓度应为 0.1%）和 200 μ抗FLAG M2琼脂糖珠悬液
注意： 对于所有可溶性蛋白的纯化，使用 0.1% Triton X-100 以最大限度减少非特异性吸附；而对于膜蛋白的纯化，则使用不同的温和非离子型去污剂，例如 C12E8（八乙二醇十二醚）、DDM（正十二烷基-β-D-麦芽糖苷） β-二麦芽糖苷）和麦芽糖新戊二醇（MNG）可在1%的去垢剂浓度下使用以增强溶解性。由于不同去垢剂对膜蛋白的溶解效率各异，建议使用多种去垢剂分别进行独立的蛋白纯化实验。 - 将内容在4℃下旋转混匀3小时 °在LabQuake摇床中孵育。旋转3小时后，以1,700 × g离心6分钟。随后小心移除上清液，尽可能彻底，同时不扰动松散的珠粒沉淀。
- 将沉淀重悬于剩余的上清液中，然后转移至一根0.8 x 4 cm的Bio-Rad聚丙烯预装柱中。确保移除柱子底部的出口塞，以便洗脱液依靠重力自然流出。用TEV切割缓冲液洗涤柱子5次。
- 洗脱液弃去后，关闭柱子的下端出口。向同一柱子中加入约5至10倍柱体积的裂解缓冲液，进行切割反应。 μl（50单位）TEV蛋白酶和400 μ将1X AFC缓冲液加入柱中，用盖子封闭柱子顶部。含有珠子的柱子于4℃轻轻旋转过夜 °在 LabQuake 摇床中于 C 条件下过夜培养。
- 取下柱子顶部的盖子和底部的出口塞，将TEV切割后收集的洗脱液转移至含有200的全新柱子中 μ将钙调蛋白-Sepharose珠悬浮液用10倍体积的钙调蛋白结合缓冲液洗涤。
- 柱子的顶部和底部均需牢固固定，并在4℃下轻轻旋转混合柱内物质3小时。 °使用LabQuake摇床。
- 旋转3小时后，通过移除柱子的顶部盖子和底部塞子排出洗脱液。用200 μL洗脱缓冲液将柱子洗涤四次。 μ1X 钙调蛋白结合缓冲液，随后用 400 微升严格洗涤液洗涤一次 μ毫升钙调蛋白洗涤缓冲液
- 结合的蛋白质以四份50 μ将洗脱液用1X钙调蛋白洗脱缓冲液转移至新的离心管中。将洗脱组分等体积分装至两个洁净的离心管中，随后使用真空浓缩仪干燥。
- 一个离心管中的干燥洗脱液用于进行银染凝胶电泳，另一个则储存于-80℃ °C，在使用质谱分析之前。
4. 银染
- 进行银染时，向50 μl干燥的洗脱液中加入一半体积的3X SDS（十二烷基硫酸钠）上样缓冲液。将混合物煮沸5分钟后，上样至SDS聚丙烯酰胺凝胶中。
- 电泳结束后，将凝胶小心放入固定液（50%甲醇和10%乙酸）中，在旋转摇床上轻柔振荡20分钟。随后用20%乙醇冲洗10分钟。
- 将固定的凝胶用500 ml双蒸水彻底洗涤两次，每次10分钟，以确保背景均匀且低。
- 然后将凝胶在500 ml硫代硫酸钠溶液中轻柔振荡1分钟，接着用蒸馏水洗涤两次，每次20秒。
- 弃去水溶液，将凝胶在200 ml 0.1%硝酸银溶液中孵育30分钟。之后移除硝酸银溶液，并用蒸馏水洗涤20秒，以去除多余的硝酸银。
- 最后将凝胶在75 ml显色液中手动轻柔振荡。当达到理想条带强度时，弃去显色液，并加入80 ml乙酸终止反应。为确保凝胶条带清晰可见，需在乙酸中孵育至少20分钟。
5. 蛋白质水解与质谱样品制备
- 向干燥的样品中加入 50 μ消化缓冲液 0.9 升 μ100 mM TCEP-HCl（三(2-羧乙基)膦）溶液-盐酸），室温下孵育混合物45分钟 用于还原步骤。接下来，1 μ加入500 mM碘乙酰胺1 μl，避光孵育40分钟，以完成样品烷基化。
- 第二次孵育后，加入1 μ将固定化胰蛋白酶加入混合物中，并在37℃孵育 °C 反应5小时或室温过夜。通过加入1终止反应 μ乙酸的升数。
- 用移液枪头吸取10 μL的溶液预润湿Millipore Zip-Tip吸头 μ润洗和平衡溶液的液体。将溶液排入废液。随后用移液器吸取10 μ加入1毫升洗涤液，并将溶液弃入废液。重复此步骤两次。
- 为确保肽混合物高效结合至吸头，用移液器将肽混合物吹打混匀20次。通过吸取和 dispensing 洗涤液，将吸附在吸头上的肽混合物冲洗下来。重复此步骤两次，以实现肽混合物与吸头的高效结合。
- 用含有结合肽的枪头吸取10 μ湿化与平衡溶液各取适量，加入洁净的微量离心管中。重复此步骤两次。将洗脱样品在真空浓缩仪中干燥后，可立即用于质谱分析，或于-80℃保存。 °使用前置于 C。
6. 使用 LTQ Orbitrap Velos 质谱仪进行蛋白质鉴定
使用LTQ Orbitrap Velos杂合型串联质谱仪鉴定分离复合物的多肽组分。Orbitrap具有卓越的分辨能力（>60,000 全宽半高（FWHM）和质量精度<2 ppm），以最大限度减少在对照纯化中检测到的无关非特异性背景污染物的 MS/MS 采样，而高速 Velos 离子阱组件则可通过电子转移解离和碰撞诱导解离两种模式检测并碎裂低丰度肽段。对获得的 MS/MS 谱图进行高置信度匹配，并将其映射至参考序列 大肠杆菌 使用 SEQUEST 等数据库搜索算法对蛋白质序列进行检索，并通过 STATQUEST 等概率算法对每条匹配序列进行评估11总谱图数量、肽段序列唯一性以及在阴性对照中检测到的常见背景污染物即模拟）纯化被认为可实现较低的经验性假阳性发现率。进行以下步骤以鉴定蛋白质：
- 微柱中填充约 10 cm 的 3 μm Luna-C18 树脂，并与 Proxeon 纳米电喷雾离子源连接，该离子源与 Orbitrap 仪器串联使用。
- 使用 Proxeon 纳流二元 HPLC 泵，在肽段分离过程中提供稳定的喷嘴流速，约为 300 nl min-1。
- 为实现肽段洗脱，根据样品复杂程度设置有机溶剂梯度。例如，对于 E. coli SPA 样品通常采用以下梯度：在 1 分钟内将溶剂 B 从 2% 升至 6%，在接下来的 38 分钟内升至 24%，再用 4 分钟升至 100%，保持 1 分钟，随后在 1 分钟内降至 2%，最后在 2% 条件下维持 15 分钟。流动相溶剂 A 含 95% HPLC 梯度水和 5% ACN，并添加 0.1% 甲酸；溶剂 B 含 5% HPLC 梯度水和 95% ACN，并添加 0.1% 甲酸。针尖流速设定为 300 nl min-1，持续 60 分钟。
- 质谱仪以 60,000 分辨率进行一次完整全扫描的同时，对强度最高的前体离子进行 10 次并行的串联碎裂质谱扫描。启用动态排除、单一同位素质量选择以及实时数据依赖性采集等仪器功能。
- 使用数据库搜索算法（如 SEQUEST）对谱图进行搜索，比对 E. coli 蛋白质序列数据库，并采用概率算法（如 STAQUEST11）进行统计学过滤，以确保较低的假阳性发现率。仅选择高置信度（99% 概率）的候选结果，而与理论肽段质量偏差超过 10 ppm 的匹配项则被排除。
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结果
当在对数生长期培养物中以内源水平表达的标记诱饵蛋白经亲和纯化后，将样品在银染凝胶上电泳，以观察所分离的稳定复合物中的各个多肽组分。我们还取另一部分亲和纯化的蛋白样品进行无凝胶串联质谱分析（LCMS），以鉴定相应的多肽序列。本亲和纯化质谱（APMS）方法的有效性通过RNA聚合酶（RNAP）和SufBCD铁硫（Fe-S）蛋白复合物组分的代表性SDS-PAGE分析结果加以展示，这些复合物系从 E. coli （图 1C 和 D）. 两种均带有SPA标签的RNAP σ70 (RpoD) 和 YacL（一种功能未知的蛋白质）与核心 RNA 聚合酶（RNAP）特异性共纯化 例如α（RpoA）、β（RpoB）和β'（RpoC）亚基，以及RNA聚合酶循环因子（HepA）。与标记的RpoD不同，YacL还额外结合了一种重要的转录终止/抗终止因子（NusG），提示其在转录过程中具有特殊功能。我们还通过LCMS检测到若干其他较小的共纯化蛋白，这些蛋白在凝胶上不明显，包括RNA聚合酶ω亚基RpoZ，以及转录终止/抗终止因子NusA和NusD，分别与标记的RpoD或Yac...
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讨论
此处所述基于 SPA 的 APMS 方法的一个关键特点是，标记是在天然染色体环境中进行的，从而确保了正常的基因调控得以维持（i.e. 保留天然诱饵基因的启动子，因此表达水平不受干扰），并能够以接近内源性水平回收天然稳定结合的蛋白质复合物。通过在筛选标记中引入向外定向的启动子，还可避免操纵子极性问题。该 SPA 标记方法的效率足以将低丰度复合物的组分纯化至接近均一的程度，包括膜相关复合物，即使这些亚基在每个细菌细胞中的表达量仅有数个分子。总体而言，本方案可轻松扩展，用于在 E. coli 中大规模纯化大量标记的可溶性蛋白质，原则上也可适用于任何可通过重组工程实现标记的其他细菌物种，或具有天然高效转化能力的物种，例如近年来作为细菌遗传学新兴模式菌株的不动杆菌（Acinetobacter），该菌已被用于构建靶向基因敲除的菌株文库13。
大规模蛋白质组学方法存在一个主要问题，即会鉴定出大量非特异性的相互作用蛋白以及微量污染。尽管进行了两轮富集，我们常规的 SPA 纯化实验仍经常检测到常见的污染物，这些通常是高丰度的管家蛋白，例如核...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究工作获得了加拿大创新基金会、基因组加拿大、安大略基因组研究所、安大略省创新部以及加拿大卫生研究院向 J.G. 和 A.E. 提供的资助。表达红色荧光的E. coli菌株DY330由唐纳德·L·库尔特（Donald L. Court，美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所）惠赠。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 一、抗生素 | |||
| 卡那霉素 | Bioshop | #KAN201 | |
| 氨苄青霉素 | Bioshop | #AMP201 | |
| 2. 优质肉汤培养基 | |||
| 生物胰蛋白胨 | Bioshop | #TRP 402 | |
| 酵母提取物 | Bioshop | #YEX 555 | |
| 甘油 | Bioshop | #GLY 002 | |
| K2人类表型本体4 | Bioshop | #PPM 302 | |
| KH2PO4 | Bioshop | #PPM 303 | |
| 3. 细菌菌株与质粒 | |||
| DY330 | Yu 等人. (2000)10 | ||
| pJL148 | Zeghouf 等人. (2004)7 | ||
| 4. PCR与电泳试剂 | |||
| Taq DNA聚合酶 | 费马塔斯 | # EP0281 | |
| 10 X PCR缓冲液 | 费玛塔斯 | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | 费马塔斯 | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | 费马塔斯 | # EP0281 | |
| 琼脂糖 | Bioshop | # AGA002 | |
| 上样缓冲液 | NEB | #B7021S | |
| 溴化乙锭 | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE缓冲液 | Thermo Scientific | #28355 | |
| Tris碱 | Bioshop | #TRS001 | |
| 硼酸 | Bioshop | #BOR001 | |
| 0.5 M EDTA（pH 8.0） | 西格玛 | # E6768 | |
| DNA 标准分子量标记 | NEB | #N3232L | |
| 5. 质粒提取与纯化试剂盒 | |||
| 质粒中量提取试剂盒 | Qiagen | #12143 | |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | #28104 | |
| 6. PCR与转化实验设备 | |||
| 热循环仪 | BioRad | iCycler | |
| 琼脂糖凝胶电泳 | 伯乐（BioRad） | ||
| 电穿孔仪 | Bio-Rad | GenePulser II | |
| 0.2 cm 电穿孔比色皿 | Bio-Rad | ||
| 42 °C 水浴摇床 | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 离心机 | Beckman Coulter | TS-5.1-500 | |
| 32 °C Shaker | 美国新不伦瑞克科学公司 | ||
| 32 °C 大型 Shaker | 美国新不伦瑞克科学公司 | ||
| 32 °C板培养箱 | Fisher Scientific | ||
| 7. 电泳与蛋白质印迹 | |||
| 丙烯酰胺单体，N,N'-亚甲基双丙烯酰胺 | Bio-Rad | #161-0125 | |
| 过硫酸铵 | Bioshop | # AMP001 | |
| 正丁醇 | 西格玛 | # B7906 | |
| TEMED | Bioshop | #TEM001 | |
| 沃特曼1号滤纸 | Fischer Scientific | #09-806A | |
| Mini Protean 3 电泳槽 | 伯乐（Bio-Rad） | #165-3301 | |
| iBlot凝胶转印装置 | Invitrogen | #IB1001 | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | #162-0115 | |
| 单克隆抗Flag M2抗体 | 西格玛 | #F3165 | |
| 辣根过氧化物酶 | Amersham | #NA931V | |
| 预染蛋白质分子量标准 | Bio-Rad | #161-0363 | |
| 化学发光试剂 | PIERCE | #1856136 | |
| 放射自显影胶片 | Clonex Corp | #CLEC810 | |
| 快速转印印迹纸 | 西格玛 | #P7796 | |
| C2 平台摇床 | 美国新不伦瑞克科学公司 | ||
| 8. 超声破碎设备与试剂 | |||
| 超声波破碎仪 | Branson Ultrasonic | #23395 | |
| NaCl | Bioshop | #SOD001 | |
| 蛋白酶抑制剂 | 罗氏 | #800-363-5887 | |
| 0.5 mM TCEP-HCl | Thermo Scientific | #20490 | |
| 9. 亲和纯化试剂与设备 | |||
| 0.8 x 4 cm Bio-Rad 聚丙烯柱 | Bio-Rad | #732-6008 | |
| Benzonase核酸酶 | Novagen | #70746 | |
| Anti-FLAG M2 琼脂糖珠 | Sigma | #A2220 | |
| 钙调蛋白-Sepharose珠 | GE Healthcare | #17-0529-01 | |
| TEV 蛋白酶 | Invitrogen | #12575-015 | |
| Triton X-100 | 西格玛 | #T9284 | |
| CaCl2 | Sigma | #C2661 | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| LabQuake 摇床 | Thermolyne | #59558 | |
| 10. 银染试剂 | |||
| 甲醇 | Bioshop | #MET302 | |
| 乙酸 | Bioshop | t#ACE222 | |
| 硫代硫酸钠 | 西格玛 | #S-7143 | |
| 硝酸银 | Fischer Scientific | #S181-100 | |
| 甲醛 | Bioshop | #FOR201 | |
| 碳酸钠 | Bioshop | #SOC512 | |
| 11. 蛋白质鉴定的试剂与设备 | |||
| 胰蛋白酶金，质谱级 | 普洛麦格 | # V5280 | |
| 50 mM NH₄HCO₃4HCO3 | Bioshop | #AMC555 | |
| 1 mM CaCl₂2 | Bioshop | #CCL302 | |
| 乙腈 | Sigma | #A998-4 | |
| 甲酸 | 西格玛 | #F0507 | |
| HPLC级水 | 西格玛 | #95304 | |
| 碘乙酰胺 | 西格玛 | #16125 | |
| Millipore Zip-Tip | 默克密理博 | # ZTC18M960 | |
| 约10厘米的3 μm Luna-C18 树脂 | Phenomenex | ||
| Proxeon nano HPLC 泵 | Thermo Fisher Scientific | ||
| LTQ Orbitrap Velos 质谱仪 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 12. 实验器材 | |||
| 4升锥形瓶 | VWR | #89000-372 | |
| 50 ml 聚丙烯圆底离心管 | 任何供应商 | ||
| 1.5 ml 微型离心管 | 任何供应商 | ||
| 250 ml 锥形瓶 | VWR | #29140-045 | |
| 15 ml 无菌培养管 | Thermo Scientific | #366052 | |
| 冷冻管 | VWR | #479-3221 | |
| -80 °C 冷冻柜 | Fisher Scientific | #13-990-14 | |
| 真空浓缩系统 | Thermo Scientific | ||
| 缓冲液与溶液 1. 1 升超丰富肉汤（Terrific Broth，TB）培养基 11 g 生物胰蛋白胨 2. 钾盐储备液 1.5 M K2人类表型本体4 3. 超声缓冲液 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 4. AFC 缓冲液 30 mM Tris-HCl（pH 7.9） 5. TEV 裂解缓冲液 30 mM Tris-HCl（pH 7.9） 6. 钙调蛋白结合缓冲液 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 7. 钙调蛋白洗涤缓冲液 30 mM Tris-HCl pH 7.9 8. 钙调蛋白洗脱缓冲液 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 9. 显影液（1 L） 37% 甲醛 10. 消化缓冲液 50 mM NH₄HCO₃4HCO3 11. 润洗与平衡溶液 含0.1%甲酸的70%乙腈（ACN） 12. 洗涤液 100% H2O 在 0.1% 甲酸中 |
参考文献
- Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
- Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096(2009).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Mak, A. B., et al. A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency. Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).
- Polanowska, J., et al. Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 36, 778-782 (2004).
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