作者无任何利益冲突需要披露。

理解小脑模式形成

Understanding Cerebellar Pattern Formation

我是Kathy Millan。我在芝加哥大学人类遗传学系以及神经病学系担任助理教授。我的研究方向是大脑发育，特别是小脑发育，即位于颅骨后部的脑部结构。它最著名的是在运动发育中的作用，但事实证明它还参与了许多其他功能。它是大脑中一个非常有趣的区域。模式形成（Pattern Formation）是指生物系统中模式的发育过程，这是一个发育生物学家常以较为宽泛的方式使用的术语，几乎可以指代任何含义。而它究竟意味着什么，目前尚不明确。我认为每位发育生物学家都会给出不同的解释。对我而言，它的含义是：大脑，特别是小脑，是如何区分上和下？如何定义左和右？您如何决定结构的哪一部分将成为哪一部分？在做出这些关键且基础的早期胚胎决策后，又如何将所有细胞结构整合在一起，形成我们称之为小脑的、具有精美图式的脑部结构？因此，我们真正感兴趣的是小脑发育以及发育中小脑的图式信息。因为小脑是一种结构极为精细的组织，其细胞层数和细胞类型都相对较少。因此，与其他脑区相比，它尤其显得结构相对简单。此外，小脑具有非常特定的功能，其中之一是运动协调。当小鼠或人类出现小脑异常时，其表型之一便是运动失调。因此，在过去大约一百年的小鼠遗传学研究中，已发现并部分表征了多种自发性小鼠突变体，其中还有一些仅被分离出来并保存在杰克逊实验室的货架上，这些小鼠均表现出运动异常。这些小鼠中有大量品系存在小脑发育异常，我认为自发突变品系中超过约60种具有此类异常。这一资源为研究驱动小脑模式形成的发育机制提供了极为宝贵的丰富材料。因此，我的实验室专注于利用人类基因组计划和小鼠基因组计划所提供的各种工具，结合这些分子试剂，去鉴定所有这些自发突变体中发生突变的基因。通过筛选这些突变体，我们采用以表型为中心的方法来发现基因。因此，我们并非随机选取基因并进行敲除，而是通过寻找表型进而鉴定相关基因。采用这种方法，能够特异性地发现与目标系统密切相关的基因。因此，我们实验室以及许多其他实验室已经克隆了多个这类自发性小鼠突变体。这些自发性小鼠突变体揭示了真正新颖且有趣的生物学现象，因为我们采用的是以表型为导向的研究方法。我们对将要发现的基因类型没有任何先入为主的概念。我们并非专门寻找达尔霍类似物或通道突变。我们是根据表型来确定相关基因的。正因为如此，我们正在发现大量新的生物学知识。例如，我的实验室以及我作为博士后期间与另一位同事 Jim Linig 合作研究过的一个基因或表型，我们研究了一种名为 dre 的小鼠突变体，dre 在德语中意为“旋转者”或“像陀螺一样旋转”。这些小鼠突变体最早于1929年在德国出现，此后一直在杰克逊实验室（Jackson Labs）积累保存。该特定位点存在多个等位基因，已知小脑形态发育异常。因此，所有小脑细胞类型均存在，但小脑的排列模式不正常，其中部结构缺失，该中部结构称为蚓部。我们发现这些小鼠存在早期胚胎表型，该表型导致了成年后的表型。这种表型是由一个名为 LMX1A 的基因突变引起的，LMX1A 代表含肢型同源结构域盒 1。因此，LMX1A 基因在发育生物学中成为一个非常有趣且重要的基因，因为它是决定中枢神经系统中背侧结构的关键基因之一。如果没有这种罕见的突变，人们实际上并不知道这个基因的功能。事实上，此前由于其他原因，人们已在胰腺的胰岛素生成细胞中发现了该基因，还有其他研究人员一直在研究其在糖尿病中的潜在作用。但实际上，LMX1A 基因本身在胰腺发育或眼细胞发育中并无作用。事实上，它在发育过程中的主要功能是驱动中枢神经系统的背侧模式形成。当我们首次克隆出 DR 基因（即 LMX1A 基因）时，我们发现它仅在中枢神经系统的背侧区域表达。事实上，它不仅表达于中枢神经系统的背侧部分，或小脑周围被称为顶板的区域，而是沿着小鼠胚胎的整个轴向长度，在中枢神经系统的背侧部分均有表达。实际上，迄今为止我们所研究的每一种脊椎动物，其整个轴向长度上都存在该基因的表达。并且由于它在整个背侧区域都有表达，我们推断它在中枢神经系统的其他背侧部位也必然具有功能作用。因此，我们实际上花费了大量时间来表征DR小鼠脊髓中的表型，因为相较于小脑，脊髓是研究中枢神经系统发育更为理想的模型系统，其三维结构复杂性低得多，三维结构也简单得多。转向鸡胚模型后，我们实际上能够利用大量现有试剂来探究 LMX1A 基因在脊髓中的作用。随后，我们又从脊髓研究转回小脑。坦率地说，如果没有鸡胚操作技术，我们很难真正理解 LMX1A 基因的功能。我实验室的一位博士后 Victor Chiko 是真正主导并推进这些实验的关键人物。而他正是利用鸡胚电穿孔技术，首次阐明了LMX1A基因的功能及其在中枢神经系统中的主要作用的人。坦率地说，如果没有鸡胚电穿孔技术，我们不可能取得如此迅速的进展。因此，鸡胚电穿孔是一项非常有价值的技术，因为它能够在发育中的鸡胚神经系统内快速过表达基因，仅需两到三天的孵育即可获得结果，并得到可分析的表型。如果要在小鼠中进行转基因动物的基因操作，实际尝试起来可能需要数月时间，而进行基因敲除等操作则至少需要一年半的时间。因此，鸡胚系统是一个非常有价值的实验体系，因为你可以对基因表达进行操作，并快速获得表型结果。例如，LMX1B 在发育中的鸡胚神经系统，特别是发育中的脊髓中过表达时，会导致中枢神经系统或脊髓的整个背侧部分转变为中枢神经系统的背侧结构，即顶板结构。因此，结合维克多进行的其他一系列实验，这一结果表明，LMX1A 自身就足以驱动菱脑顶板的整个分化程序。这一点非常重要，因为顶板是发育中神经系统的关键信号中心。如果没有顶板，就无法分泌形态发生素，从而无法指示相邻的神经管细胞转化为背侧感觉神经元。如果没有这些信号，这些细胞就会进入一种中间细胞类型的默认状态。你会在脊髓中，以及在发育中的小脑中，失去大部分的背侧神经元。我认为，除了使用鸡的神经管系统之外，采用其他任何系统都很难轻易得出这一结论。我们对小脑发育非常感兴趣，不仅因为小鼠和鸡等模式生物中的基础生物学研究，还因为人类存在小脑畸形现象。而目前对人类小脑畸形的理解仍十分有限。因此，我们与同事、全球人类脑畸形研究领域专家威廉·多宾斯博士（Dr. William Dobbins）合作，共同启动了一项寻找人类小脑畸形致病基因的研究项目。我们正在采取多种方法。其中最重要的一项工作是建立了一个DNA数据库和一个临床数据库，已招募了500多名具有明确人类小脑畸形的患者，收集了他们的脑部MRI影像，并将这些影像与DNA样本进行了关联，以便将其作为基因搜寻的资源。因为事实上，人类小脑畸形至今尚未得到良好的分类。坦率地说，在我们研究中接收到的每10份影像扫描中，至少有1份显示出某种前所未见、此前从未被描述或真正识别过的畸形。最常见的先天性小脑畸形被称为丹迪-沃克畸形，也是临床医生最熟知的一种。但事实上，它在人类小脑畸形中某种程度上是一个笼统的诊断类别。当任何或许多医生观察到小脑结构异常时，往往将其归类为丹迪-沃克畸形。因此，我们将患者招募到我们的Dandy-Walker畸形研究中，并发现各种不同类型的有趣的小脑畸形。我们正在利用这一资源来寻找新的小脑发育相关基因，因为作为一名发育生物学家，我认为人类实际上是一场规模宏大的诱变实验，是发现新的发育基因的宝贵来源。因此，我们正在采用多种方法来寻找这些基因。其中一种方法是，利用我们在小鼠中已确定的、在小脑发育中起作用的基因，对这些基因在人类中的序列进行测序分析。事实上，我们最近刚刚鉴定出首个存在于人类中的LMX1A突变。到目前为止，我们将基础科学研究应用于临床研究的实践还非常有限。但这一状况正在迅速改变。随着我们不断发现新的基因，我们能够为患病儿童的家庭提供新的遗传咨询信息。坦率地说，这正是我看到我们的研究产生最大影响的地方。因此，我对未来五年该领域的展望是，通过小鼠模型的表征以及人类小脑畸形的研究，将发现更多的致病基因。我们将更深入地了解参与小脑发育的基因集合。接下来的目标将是研究这些基因如何相互作用，以及这些基因如何驱动实际的生物学过程？它们如何调控形成小脑所涉及的各种不同的细胞事件？我认为小脑是研究整个中枢神经系统的理想模型，因为坦率地说，小脑中仅有五到七种主要的神经元细胞类型。它们均以多种典型的空间排列方式分布。我们对驱动这些前体细胞特化及早期分化的分子了解得越来越多。同时，我们对这些细胞如何增殖的认识也在不断深入。因此，我认为在五年之后，我们最终将能够从神经管发育开始，完整地研究到小脑的发育过程，从而实现对小脑成熟形态的全面理解。由于小脑是一个相对简单的系统，我们有望真正揭示驱动整个小脑中枢结构形成的分子机制和发育事件。我认为这一点极为重要，不仅对人类遗传诊断领域具有重要意义，也对小脑发育研究领域至关重要。此外，我认为这些机制的研究成果还将可应用于大脑的其他区域。小脑是一个相对简单的结构，但许多发育过程并不仅限于小脑。我们可以将从小脑中学到的知识应用于中枢神经系统的其他更复杂的区域，例如大脑皮层，并利用我们所了解的规律和通路，探究它们如何适用于大脑的其他部分。

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