本文描述了一种将钙离子指示剂染料加载至脑室下区（SVZ）细胞以记录钙活性的方法。出生后的脑室下区包含紧密排列的细胞，如神经前体细胞和成神经细胞。与浴式加载不同，我们通过压力将染料直接注入组织内部，从而实现更佳的染料扩散效果。
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摘要
摘要
室下区（SVZ）是出生后大脑中两个神经发生区域之一。SVZ包含密集排列的细胞，包括具有星形胶质细胞特征的神经前体细胞（称为SVZ星形胶质细胞）、成神经细胞以及中间前体细胞。在SVZ中产生的成神经细胞沿切向长距离迁移至嗅球，并在那里分化为中间神经元。通过黏附分子和可扩散信号分子介导的细胞间信号传导在调控神经发生过程中起着重要作用。许多此类信号会触发细胞内及细胞间的钙离子活动，从而传递信息。因此，钙离子活动反映了细胞外信号的活性，是理解SVZ细胞之间功能性细胞间信号传导的理想途径。
钙活性已在许多其他区域和细胞类型中得到研究，包括成熟的星形胶质细胞和神经元。然而，将钙指示剂染料加载到细胞中的传统方法（即 浴载法）在加载所有SVZ细胞类型方面效率不高。实际上，SVZ组织中的细胞密度较高，阻碍了染料在组织内的扩散。此外，制备矢状面切片能更好地保留SVZ细胞的三维排列结构，尤其是沿头尾轴方向的成神经细胞迁移流。
本文介绍了制备包含侧脑室下区（SVZ）的矢状面切片、用钙离子指示剂染料对SVZ细胞进行负载，以及通过延时成像获取钙活动的方法。我们采用Fluo-4 AM染料，通过向组织内部施加压力的方式对SVZ星形胶质细胞进行染料负载。钙活动记录使用扫描共聚焦显微镜完成，可实现高精度分辨率，从而区分单个细胞。该方法同样适用于其他神经发生区域，包括成年海马齿状回亚颗粒层以及胚胎期的神经发生区域。此外，其他类型的染料也可采用本方法所述技术进行应用。
方案
1. 溶液配制、解剖与振动切片
- 溶液必须按照正确的渗透压和 pH 值配制（表 1）。与人工脑脊液（ACSF）相比，解剖液中钠和钙的浓度较低，而镁的浓度较高，以尽量减少切片过程中兴奋性毒性的影响。
- 解剖液和 ACSF 均需用 95% O2/5% CO2 气体持续通气至少 10 分钟，以达到 pH 7.3 的目标值。
- 在托盘中准备冰浴，将解剖板置于冰浴中，并加入解剖液，对解剖板中的溶液进行通气。
- 通过制备冰浴来准备振动切片机，将切片皿放入冰浴中，加入解剖液并进行通气。
- 向切片保存室中加入 ACSF 并持续通气，以确保无论切片置于何处，溶液均能充分氧合。
2. 脑组织的移除
急性脑切片在较年轻的鼠类中通常状态更佳。啮齿类动物出生后室管膜下区（SVZ）的细胞结构大约在出生后第20天（P20）趋于成熟1。因此，我们尽量将实验小鼠的年龄控制在P20至P30之间，但也在长达3个月龄的小鼠中成功完成了实验。在整个组织操作过程中，必须注意尽量减少对脑组织的机械性移动和压力，保持低温环境，并在动物处死后尽快将SVZ暴露于溶液中。
- 注射戊巴比妥后，迅速将小鼠断头。去除毛发，并在颅底进行切口。然后将头部置于盛有解剖液的托盘中。
- 用镊子固定头部的同时，使用显微剪刀在颅骨周围连续剪切，有时沿中线向上剪开。操作时应尽量减少与组织的接触。由于嗅球是来自侧脑室下区（SVZ）新生神经元的最终目的地，因此在去除该区域周围的颅骨时必须注意保护嗅球。显微剪刀在颅骨上的剪切应位于背侧，以便于颅骨的顺利移除。
- 将覆盖在脑组织上方的颅骨与脑下方的骨骼分离。如果上一步的切口操作正确，可用镊子或镊子轻松移除该表层颅骨。
- 在仍用镊子固定头部的同时，可在切片前使用手术刀干净地切除部分脑组织，例如以下操作：在人字缝水平进行冠状切面；在SVZ外侧的脑两侧进行矢状切面，保守估计距离中线约2.5 mm。如有需要，也可在此处将脑半切。这些切口有助于组织的固定，并在脑切片时更快地暴露SVZ区域。需注意尽量减少对脑组织施加机械力（e.g. 避免推压或牵拉）。
3. 急性脑切片制备
- 为进行后续步骤，需确保用于固定组织的超级胶水无堵塞，并可顺利涂抹于振动切片机的载片台上。操作时应尽可能迅速，同时避免损伤脑组织。
- 随后可从组织下方将其轻轻舀起，使组织与下方的骨组织分离，同时将神经一并分离。
- 将组织固定并用胶水粘附于载片板上，然后置于振动切片机中。由于侧脑室下区（SVZ）具有前后解剖结构特点，我们优先选择制备矢状切片，以保留神经前体细胞的迁移通路、胶质鞘以及在此方向上大致排列的血管系统。可将组织固定于正中线位置，或固定于在SVZ外侧进行矢状切割后形成的平整切面上。可选步骤是在组织后方放置一块3%琼脂糖块，作为刀片切割时的支撑挡块。我们优先使用氰基丙烯酸酯类超级胶水。
- 用乙醇清洗刀片以去除油脂，再用蒸馏水冲洗。将刀片安装至刀片夹持器上，并将夹持器固定到振动切片机上。
- 调节振动切片机参数，使每片切片厚度为250–350 μm。切割时应采用高频率振动与低速进刀，这一点至关重要。
- 逐步对组织进行切片。在矢状切片中，嗅球的出现是接近SVZ区域的良好标志，因为最外侧的切片中均不包含这两个结构。其他可观察的解剖标志包括脑室以及胼胝体的增厚区域，SVZ即位于其下方。SVZ结构首先出现在更外侧的矢状切片中，而喙侧迁移流（RMS）则在内侧矢状切片中显现。
- 使用剪去尖端的塑料巴斯德移液管取出含有SVZ的切片，并转移至切片保存室中。我们通常获得的切片数量超过单个工作日内可使用的数量。然而，不同切片中SVZ所含细胞数量存在差异，因此有时需筛选多个切片，才能找到适合成像实验的理想切片。
4. 显微镜和染料的准备
切片需要在ACSF中孵育一小时，以从解剖和切片过程中恢复。在此切片恢复期间可进行多个步骤。
- 用于钙离子染料和/或药物施加的移液管制备
- 玻璃移液管的尖端直径应为 2-3 μm，尖端长度约为 2 mm，角度约为 16°（适用于移液管固定器），以避免与灌流室接触，并为物镜的放置留出足够空间。
- 通常每天实验可制备 6-8 根压力移液管。
- 钙离子染料的配制
- 在配制工作液时（浴式施加浓度为 4-5 μM，压力施加浓度为 250 μM），应尽量减少细胞接触 DMSO 的量。可通过配制高浓度母液来实现这一目的。例如，Fluo-4 每天使用一管含 50 μg 的试剂，可通过加入 4.6 μl 含 20% Pluronic F-127 的 DMSO 溶液配制成 10 mM 的储存液。
- 显微镜系统的准备（图 2）。
- 使用蠕动泵进行溶液灌流有助于最大限度减少图像漂移。在实验前应提前启动蠕动泵，使人工脑脊液（ACSF）流经灌流管路，并确保管路中无气泡。
- 将灌流管路的入口端置于灌流室内，并确保无泄漏。
- 放置抽吸管尖端，以确保溶液能从灌流室中被持续吸出。应调整至适当液位，使物镜浸入液体中并保持合适的作距离，但液位不宜过高以免溶液溢出灌流室。较低的液位也有助于减少液体流动引起的畸变。可通过听觉判断抽吸是否稳定持续。
5. 染料加载
该方法已在另一篇论文中进行了详细描述2。请参见其中的图示。
- 灌流上样染料
- 配制1-2 ml染料工作液。对于Fluo-4 AM，浓度为4-5 μM 足以标记SVZ神经母细胞。
- 将切片首先转移至已盛有ACSF的35 mm培养皿中，该培养皿底部带有网格。使用3 ml塑料移液管轻轻吸除ACSF，同时加入钙离子荧光染料工作液以替换溶液。
- 孵育于 37 °C 在5% CO₂中孵育30-60分钟2 受控气体环境
- 将切片放回盛有ACSF的孵育 chamber 中，以洗去未进入细胞的染料。或者，也可直接将其置于正在灌流ACSF的显微镜灌流 chamber 上。此洗涤过程持续30–45分钟。
- 将切片转移至灌流室。
- 染料的压力施加
- 将切片从孵育 chamber 转移至显微镜装置上的灌流 chamber 中。
- 用工作液填充玻璃移液管 250 μM 并置于显微操作仪上。
- 将移液管移至目标区域。移液管可置于距脑片表面上方数微米处，或埋入脑片表面下方数微米处，但需远离记录区域。移液管的角度不影响加载效率。当对脑片表面下方进行成像时，我们发现将移液管尖端置于成像平面下方可更有效地标记目标成像区域。
- 施加染料时，调节Picospritzer的压力，使其处于 <3 psi。我们未估算染料扩散的体积，因为该参数受移液管尖端直径、施加压力以及染料注射部位组织密度的变异影响较大。我们仅根据肉眼评估的标记效果，施加至达到理想的负载程度即可。施加过程中应尽量减少对脑片的损伤，尤其是当管尖位于脑片表面下方时。每次施加持续1-2分钟。根据肉眼观察的标记情况，有时需要重复施加。对于该浓度和施加时长，我们发现染料在表面施加时优先标记神经前体细胞，而在表面以下施加时则优先标记星形胶质细胞。然而， >3 分钟应用时间 500 μM 无论切片表面之上或之下，均能标记神经母细胞（JC Platel，未发表观察）。洗涤并让切片恢复 30–45 分钟。
6. 钙活性的共聚焦成像
- 首先使用较低倍率的物镜（如 4x 或 10x）找到目标区域，并将其置于视野中央，然后再切换至高倍物镜。此时可通过微分干涉差显微镜（DIC）观察SVZ细胞的形态，初步评估脑片整体健康状况。健康的细胞呈圆形且饱满；此外，健康细胞应显示微弱的Fluo-4荧光信号，而非完全无负载或出现强荧光（后者提示细胞正在死亡）。
- 将水浸物镜下降至已负载染料的目标区域。根据实验需求，40x 或 60x 物镜均可使用，但 40x 物镜可提供更宽的视野，并更便于移液管操作。在对组织切片深层成像时，我们通常至少深入切片表面以下 15 μm 处，该区域的三维结构和细胞状态保存更佳。
- 确认灌流系统和负压吸引系统工作正常。
- 设置显微镜参数，使时间分辨率和空间分辨率达到所需水平。对于共聚焦显微镜，由于系统为扫描式成像，提高时间分辨率通常会牺牲空间分辨率，因此需权衡二者。在记录钙信号活动时，我们通常以每秒一帧、512×512 像素的分辨率进行成像。若需分别采集多个通道图像，则采集速率也会相应受到影响。设定录像持续时间（2–10 分钟）。
- 开始采集。若进行药理学实验，应先灌流至少 5–10 分钟的拮抗剂或不易引起受体脱敏的激动剂，随后再进行 5–10 分钟的成像。对于可能引起受体脱敏的激动剂，可采用急性施加方式，例如通过显微操作器控制的压力移液管进行局部给药。
7. 钙分析
分析遵循我们在先前出版物中描述的标准操作流程2-4. F0 (即 基线）和 F 分别表示在整个所有感兴趣区域（ROIs）以及每个 ROI 中测得的平均荧光强度。荧光强度的变化被视为 Ca2+ 增加，如果它是 >15% F/F0 增加。细胞内 Ca2+ 使用Calsignal计算变化5.
8. 代表性结果
我们能够根据上述及其他文献2-4,6所述的染料负载方案，实现对室管膜下区（SVZ）细胞的选择性标记。在脑片表面采用浴式加载或压力施加法分别使用 Fluo-4 AM（浓度分别为 4-5 或 250 μM）时，主要标记的是成神经细胞。压力施加法虽可在单一片层中比浴式加载更快地标记成神经细胞，但浴式加载可同时对多个脑片进行染料负载。我们通过以下方式确认被标记细胞的身份为成神经细胞：（1）细胞是否表现出迁移行为4,7；（2）其形态学特征；（3）对星形胶质细胞特异性染料磺基罗丹明101（sulforhodamine 101）呈阴性染色3；或（4）与DCX-DsRed表达呈阳性共标（JC Platel，未发表观察结果）。在生理温度下，成神经细胞迁移迅速（平均速度为 60 μm/hr）4,7-9，即使在室温条件下，其运动仍可清晰观察到。由于我们采集的影像通常持续时间较短，因此在追踪钙信号活动时，将感兴趣区域（ROI）置于细胞上一般不会因细胞迁移而产生问题。然而，在较长的等待期（如更换药物溶液期间），研究人员必须谨慎确保对照期与处理期的ROI保持一致。成神经细胞迁移出入成像视野或焦平面的情况并不少见。
将 Fluo-4 AM（250 μM）以加压方式注入脑片深层并限制孵育时间（<2 分钟），可优先标记 SVZ 星形胶质细胞2。星形胶质细胞的标记已通过磺酰罗丹明 101 的阳性染色及其形态学特征得到验证，尤其是其具有延伸至血管的突起和终足结构，我们近期已对此进行描述3。利用该方法，我们观察到 SVZ 神经前体细胞和星形胶质细胞群体均存在自发性活动（图 1）。星形胶质细胞中的活动常表现为可波及血管的钙波3。此外，通过钙成像作为检测手段，应用药理学激动剂已揭示或证实神经前体细胞和星形胶质细胞表达 GABAA 受体6，神经前体细胞表达 AMPA 和 NMDA 受体4。
图
图1. 星形胶质细胞中的钙活动传播。 （A）钙活动延时记录的代表性平均图像。通过压力注射法将Fluo-4 AM深入脑片，使室管膜下区（SVZ）的星形胶质细胞负载染料。图像以0.75秒的时间间隔采集。在表现出活动的细胞上标注了感兴趣区域（ROI）。（B）基于（A）中视频在细胞上标注的ROI所提取的信号轨迹。轨迹经移动平均滤波并进行归一化处理。垂直刻度表示2 × ΔF/F0，其中F为信号强度，F0为平均基线信号强度，ΔF = F - F0。
图 2. 灌流系统的示意图。 一根管路的一端浸入经 95% O2/5% CO2 气体饱和的溶液中，溶液通过蠕动泵（图中未显示）经管路输送至灌流室。管路的另一端插入安装在平台上的灌流室的溶液入口。抽吸管尖端连接至灌流室的溶液出口，并调节至适当高度以控制液面位置。从出口处，抽吸管再连接至真空管线，将灌流室中的溶液抽入废液容器中。图中所示灌流系统位于显微镜载物台之外，以便清晰展示结构。
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讨论
对脑室下区（SVZ）细胞进行钙成像已被用于研究神经母细胞中的自发活动模式10、神经母细胞和星形胶质细胞中的受体通道表达4,6,8，以及星形胶质细胞的钙波传播3。由于SVZ中的细胞要么处于未成熟状态，要么具有胶质细胞特性，因此它们不会产生动作电位11,12，这意味着在成熟神经网络中反映活动的毫秒级膜电位变化在此区域并不适用。因此，记录较慢的钙信号事件（时间尺度在数秒量级）不仅具有生物学意义，而且可能是这些细胞中最相关的活动形式。
研究人员必须注意本实验流程中的多个步骤，尤其是与脑片健康相关的环节。溶液配制不当、水质不佳（用于配制溶液）、解剖操作缓慢或不精确，以及使用不洁净的刀片切割组织，均可能对组织活性产生不利影响。
关于钙离子指示剂的使用，尽管本文仅讨论了Fluo-4AM的应用，我们也尝试过其他商业染料，包括Oregon Green BAPTA-AM，其基础负载水平高于Fluo-4。我们选择重点使用Fluo-4，是因为其动态范围较其他染...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH，项目号：DC007681，A.B.）、康涅狄格州干细胞研究基金（A.B.）、帕迪基金会（A.B.）、博士前露丝·L·柯什斯坦国家研究服务奖（NRSA）（S.Z.Y.）以及美国国家科学基金会研究生研究奖学金（NSF Graduate Research Fellowship）（B.L.）的资助。我们感谢Bordey实验室成员对本文稿提出的宝贵意见。本材料部分基于康涅狄格州干细胞研究资助计划下康涅狄格州政府支持的研究工作。其内容完全由作者负责，不代表康涅狄格州、康涅狄格州公共卫生部门或康涅狄格创新公司（CT Innovations, Incorporated）的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蔗糖 | Sigma | S0389 | 解剖：147 mM ACSF：0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | 解剖：42 mM ACSF：126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | 解剖：2.5 mM ACSF：2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | 解剖：4.33 mM ACSF：1 mM |
| NaH2PO4. H2O | Sigma | S8282 | 解剖：1.25 mM ACSF：1.25 mM |
| 葡萄糖 | Sigma | G8270 | 解剖：10 mM ACSF：10 mM |
| NaHCO₃3 | Sigma | S6014 | 解剖：26 mM ACSF：26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | 解剖：1.33 mM ACSF：2 mM |
表1. 解剖液和人工脑脊液（ACSF）的化学试剂列表及配制方法 | |||
| [标题] | |||
| 振动切片机 | Leica | VT 1000S | |
| 超级胶水 | Surehold 或 3M | Surehold 3G 超强胶水或 3M Vet-Bond | |
| 解剖工具 | 罗博兹或泰德·佩拉 | ||
| Fluo-4 AM 钙敏感性染料 | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM 钙敏感性染料 | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% DMSO 溶液 | Invitrogen | P3000MP | |
| 直立式共聚焦显微镜 | Olympus | FV300 或 FV1000 | |
| 水浸物镜 | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR（NA 0.80）；LUMPlanFl 60 x W/I（NA 0.90） | |
| 显微操作器 | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| 压力控制器 | Parker Hannifin | Picospritzer | &应用时压力小于3 PSI |
| 拉针仪 | Sutter 或 Narshige | Sutter P-97 或 Narshige PP-830 | |
| 玻璃移液管 | Sutter | BF150-110-10 | 内径：1.10，外径：1.50 |
| 蠕动泵 | 哈佛仪器 | Model 720 | 流速：1 ml/min |
| 灌流浴槽 | Warner Instruments | RC-26 GLP | 低剖面设计有利于物镜 clearance |
| 管路 | Tygon | ||
| 温度控制器 | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
表2. 材料/设备清单 |
参考文献
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