本文描述了一种将钙离子指示剂染料加载至脑室下区（SVZ）细胞以记录钙活性的方法。出生后的脑室下区包含紧密排列的细胞，如神经前体细胞和成神经细胞。与浴式加载不同，我们通过压力将染料直接注入组织内部，从而实现更佳的染料扩散效果。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
室下区（SVZ）是出生后大脑中两个神经发生区域之一。SVZ包含密集排列的细胞，包括具有星形胶质细胞特征的神经前体细胞（称为SVZ星形胶质细胞）、成神经细胞以及中间前体细胞。在SVZ中产生的成神经细胞沿切向长距离迁移至嗅球，并在那里分化为中间神经元。通过黏附分子和可扩散信号分子介导的细胞间信号传导在调控神经发生过程中起着重要作用。许多此类信号会触发细胞内及细胞间的钙离子活动，从而传递信息。因此，钙离子活动反映了细胞外信号的活性，是理解SVZ细胞之间功能性细胞间信号传导的理想途径。
钙活性已在许多其他区域和细胞类型中得到研究，包括成熟的星形胶质细胞和神经元。然而，将钙指示剂染料加载到细胞中的传统方法（即 浴载法）在加载所有SVZ细胞类型方面效率不高。实际上，SVZ组织中的细胞密度较高，阻碍了染料在组织内的扩散。此外，制备矢状面切片能更好地保留SVZ细胞的三维排列结构，尤其是沿头尾轴方向的成神经细胞迁移流。
本文介绍了制备包含侧脑室下区（SVZ）的矢状面切片、用钙离子指示剂染料对SVZ细胞进行负载，以及通过延时成像获取钙活动的方法。我们采用Fluo-4 AM染料，通过向组织内部施加压力的方式对SVZ星形胶质细胞进行染料负载。钙活动记录使用扫描共聚焦显微镜完成，可实现高精度分辨率，从而区分单个细胞。该方法同样适用于其他神经发生区域，包括成年海马齿状回亚颗粒层以及胚胎期的神经发生区域。此外，其他类型的染料也可采用本方法所述技术进行应用。
方案
1. 溶液配制、解剖与振动切片
- 溶液必须按照正确的渗透压和 pH 值配制（表 1）。与人工脑脊液（ACSF）相比，解剖液中钠和钙的浓度较低，而镁的浓度较高，以尽量减少切片过程中兴奋性毒性的影响。
- 解剖液和 ACSF 均需用 95% O2/5% CO2 气体持续通气至少 10 分钟，以达到 pH 7.3 的目标值。
- 在托盘中准备冰浴，将解剖板置于冰浴中，并加入解剖液，对解剖板中的溶液进行通气。
- 通过制备冰浴来准备振动切片机，将切片皿放入冰浴中，加入解剖液并进行通气。
- 向切片保存室中加入 ACSF 并持续通气，以确保无论切片置于何处，溶液均能充分氧合。
2. 脑组织的移除
急性脑切片在较年轻的鼠类中通常状态更佳。啮齿类动物出生后室管膜下区（SVZ）的细胞结构大约在出生后第20天（P20）趋于成熟1。因此，我们尽量将实验小鼠的年龄控制在P20至P30之间，但也在长达3个月龄的小鼠中成功完成了实验。在整个组织操作过程中，必须注意尽量减少对脑组织的机械性移动和压力，保持低温环境，并在动物处死后尽快将SVZ暴露于溶液中。
- 注射戊巴比妥后，迅速将小鼠断头。去除毛发，并在颅底进行切口。然后将....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
对脑室下区（SVZ）细胞进行钙成像已被用于研究神经母细胞中的自发活动模式10、神经母细胞和星形胶质细胞中的受体通道表达4,6,8，以及星形胶质细胞的钙波传播3。由于SVZ中的细胞要么处于未成熟状态，要么具有胶质细胞特性，因此它们不会产生动作电位11,12，这意味着在成熟神经网络中反映活动的毫秒级膜电位变化在此区域并不适用。因此，记录较慢的钙信号事件（时间尺度在数秒量级）不仅具有生物学意义，而且可能是这些细胞中最相关的活动形式。
研究人员必须注意本实验流程中的多个步骤，尤其是与脑片健康相关的环节。溶液配制不当、水质不佳（用于配制溶液）、解剖操作缓慢或不精确，以及使用不洁净的刀片切割组织，均可能对组织活性产生不利影响。
关于钙离子指示剂的使用，尽管本文仅讨论了Fluo-4AM的应用，我们也尝试过其他商业染料，包括Oregon Green BAPTA-AM，其基础负载水平高于Fluo-4。我们选择重点使用Fluo-4，是因为其动态范围较其他染.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH，项目号：DC007681，A.B.）、康涅狄格州干细胞研究基金（A.B.）、帕迪基金会（A.B.）、博士前露丝·L·柯什斯坦国家研究服务奖（NRSA）（S.Z.Y.）以及美国国家科学基金会研究生研究奖学金（NSF Graduate Research Fellowship）（B.L.）的资助。我们感谢Bordey实验室成员对本文稿提出的宝贵意见。本材料部分基于康涅狄格州干细胞研究资助计划下康涅狄格州政府支持的研究工作。其内容完全由作者负责，不代表康涅狄格州、康涅狄格州公共卫生部门或康涅狄格创新公司（CT Innovations, Incorporated）的官方观点。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蔗糖 | Sigma | S0389 | 解剖：147 mM ACSF：0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | 解剖：42 mM ACSF：126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | 解剖：2.5 mM ACSF：2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | 解剖：4.33 mM ACSF：1 mM |
| NaH2PO4. H2O | Sigma | S8282 | 解剖：1.25 mM ACSF：1.25 mM |
| 葡萄糖 | Sigma | G8270 | 解剖：10 mM ACSF：10 mM |
| NaHCO₃3 | Sigma | S6014 | 解剖：26 mM ACSF：26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | 解剖：1.33 mM ACSF：2 mM |
表1. 解剖液和人工脑脊液（ACSF）的化学试剂列表及配制方法 | |||
| [标题] | |||
| 振动切片机 | Leica | VT 1000S | |
| 超级胶水 | Surehold 或 3M | Surehold 3G 超强胶水或 3M Vet-Bond | |
| 解剖工具 | 罗博兹或泰德·佩拉 | ||
| Fluo-4 AM 钙敏感性染料 | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM 钙敏感性染料 | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% DMSO 溶液 | Invitrogen | P3000MP | |
| 直立式共聚焦显微镜 | Olympus | FV300 或 FV1000 | |
| 水浸物镜 | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR（NA 0.80）；LUMPlanFl 60 x W/I（NA 0.90） | |
| 显微操作器 | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| 压力控制器 | Parker Hannifin | Picospritzer | &应用时压力小于3 PSI |
| 拉针仪 | Sutter 或 Narshige | Sutter P-97 或 Narshige PP-830 | |
| 玻璃移液管 | Sutter | BF150-110-10 | 内径：1.10，外径：1.50 |
| 蠕动泵 | 哈佛仪器 | Model 720 | 流速：1 ml/min |
| 灌流浴槽 | Warner Instruments | RC-26 GLP | 低剖面设计有利于物镜 clearance |
| 管路 | Tygon | ||
| 温度控制器 | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
表2. 材料/设备清单 |
参考文献
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
