本文介绍了通过电穿孔法对单细胞海洋绿藻Ostreococcus tauri进行遗传转化的方法。该真核生物作为高等植物的有效模式系统，具有显著简化的基因组和细胞结构，且易于进行细胞培养和化学生物学研究。
本文内容
摘要
摘要
阻碍植物科学快速发展的常见问题包括细胞、组织和整个生物体的复杂性，尤其是高等植物中基因组的高度冗余，这影响了简单的遗传学研究。新型模式生物Ostreococcus tauri是目前已知最小的自由生活的真核生物，其基因组大小和细胞结构显著简化1,2，表现为每个细胞中大多数细胞器（线粒体、叶绿体、高尔基体堆）仅有一个，基因组中仅包含约8000个基因。此外，其单细胞特性和易于培养的特性为化学生物学研究方法提供了理想的平台。近年来，Ostreococcus已成功用于研究昼夜节律调控的基本机制3-6。该模式生物的研究成果不仅影响了植物科学，也对哺乳动物生物学产生了影响7。这一实例凸显了在绿色谱系中的简单真核生物中进行快速实验，如何通过在复杂性显著降低的背景下生成可验证的假设，从而加速对更复杂生物体的研究，而这些方法在技术上仅在此类简化系统中可行。基因组信息以及基因修饰能力是任何模式物种研究中的基本工具。该物种的基因组1、转录组8和蛋白质组9数据均可免费获取，但此前报道的Ostreococcus遗传转化方法6,10目前全球仅有少数实验室掌握。
本文详细阐述了通过电穿孔法将过表达载体导入该新型模式生物进行遗传转化的实验方法，以及将转化细胞包埋于低浓度琼脂糖中以筛选源自单个转化细胞的转化株系的技术流程。在成功应用上述方法后 Ostreococcus 生物节律研究，对昼夜节律研究日益增长的兴趣 Ostreococcus 可来自植物科学内外的多个研究领域，包括生物技术领域。从事保守生化通路研究的广泛生物学与医学科学领域的研究人员可考虑开展相关研究 Ostreococcus，摆脱了较大模式物种的基因组和生物体复杂性。
方案
1. 藻类材料的制备
- 将Ostreococcus细胞培养于人工海水中（ASW）。将海盐（通常约为每升40克）溶解于去离子水中，使盐度达到30 ppt（使用盐度计测定）。按照表1-3所述添加富集培养基11,12、微量元素和维生素。培养基随后通过0.22 μm滤膜过滤除菌。
- 用于维持培养时，Ostreococcus菌株OTTH95需每7天在新鲜ASW中以1/100的比例无菌传代，并在配备月光蓝滤光片的植物培养箱中持续光照下培养。光照强度应接近20 μmol m-2 s-1，温度维持在20 °C。细胞无需持续振荡，但每隔2至3天需轻轻摇动一次以防止细胞聚集。
- 每次转化实验需使用50 ml细胞，细胞密度为20-30 × 106 ml-1，该密度通常在传代后5-7天达到。可通过流式细胞术或血细胞计数板（最低40倍放大）估算细胞密度及无菌状态。
2. 电穿孔
- 准备用于转化的 DNA。每次转化需要 5 μg 纯度高、已线性化的质粒 DNA，浓度为 1 μg/μl，溶于无菌去离子水中。为获得该 DNA，作者推荐使用 Qiagen midi prep 试剂盒，但其他方法也可能同样有效。使用一种在载体骨架上具有切割位点、但在转基因或筛选基因中无切割位点的酶对产物进行消化。通过乙醇沉淀进一步纯化并浓缩所得的线性 DNA，然后将沉淀物重悬于适当体积的高质量无菌去离子水中。
- 为每次转化准备含有 5 μg DNA 的微量离心管。对每种待转化的细胞系，均需设置一个不含 DNA 的对照管。将这些离心管置于冰上，并为每次转化准备好一个 2 mm 电穿孔杯。
- 为每次转化准备 2.2 ml 重悬缓冲液。将甘露醇溶解于 ddH2O 中制成 1 M 溶液，加入 0.1 % Pluronic F68 并过滤除菌。
- 向细胞中加入 Pluronic F68 至终浓度为 0.1%，在 10 °C 条件下，于 50 ml 锥底离心管中以 8000×g 离心 10 分钟收集细胞。立即通过移液上下吹打，将细胞重悬于 1 ml 重悬缓冲液中，并转移至微量离心管。在 10 °C 条件下以 8000×g 离心 10 分钟，迅速操作，并重复此洗涤步骤一次。
- 使用剪切过的吸头，将每次转化所得的最终细胞沉淀重悬于 40 μl 重悬缓冲液中。将 40 μl 重悬细胞液加入冰上放置的各管线性化 DNA 中，轻柔混匀后转移至电穿孔杯中。
- 将电穿孔杯放入电穿孔仪中。将参数设置为 6 kV cm-1、600 Ω 和 25 μF，进行电穿孔。
- 将电穿孔后的细胞在电穿孔杯中室温孵育 10 分钟，并利用此时间准备组织培养瓶。标记培养瓶，并向每个瓶中加入 30 ml 新鲜 ASW。从每个培养瓶中取出 1 ml 培养基，轻柔地加入对应的电穿孔杯中。孵育 2 分钟后，小心移除含有细胞团的 ASW，缓慢而轻柔地将细胞团直接吹入培养瓶的 ASW 中。
- 细胞通常保持为团状结构。此时应避免震荡或扰动聚集的细胞。将细胞在培养箱中恢复 1–2 小时，然后通过轻轻摇动培养瓶使细胞重悬。此时细胞应能自由分散，无可见团块。让细胞在培养箱中过夜恢复。
3. 在半固体培养基平板中包埋细胞
- 第二天，将含有搅拌子的瓶子中的2.1%低熔点琼脂糖溶于ddH2O中，进行高压灭菌。将该溶液置于盛有水的大烧杯中，使用加热磁力搅拌器保持65–90 °C的熔融状态。每项转化实验准备8个培养皿（直径55 mm）以及8个15 ml离心管，每管含9 ml人工海水（ASW）并添加所需的筛选剂。若使用Nourseothricin或G418，浓度为2 mg/ml。
- 从培养箱中收集转化后的细胞。在无菌超净工作台内，向其中一根离心管的9 ml液体中加入1 ml沸水浴处理的低熔点琼脂糖。盖紧管盖，通过倒置混匀。随后加入0.5 ml新鲜转化的细胞，迅速混匀后立即倒入培养皿中。对剩余7根离心管重复此操作，然后继续处理下一批转化用的培养瓶。
- 将培养皿在超净台中敞口放置1小时，使琼脂糖凝固。随后盖上皿盖，将培养皿转移至大号方形培养皿中，每个方形皿可放置4个圆形培养皿。用Parafilm封口膜密封方形培养皿。注意：培养皿中的凝胶不会完全固化，因此凝胶非常脆弱。操作时应小心避免破坏凝胶。将所有方形培养皿放入培养箱中培养。
4. 转化菌落的筛选
- 转化平板上应在10至21天后出现菌落，而对照转化平板上不应出现菌落。使用带有切口吸头的200 μl移液器挑取菌落。选择独立的菌落，吸取绿色菌落，注意避免混入邻近菌落的细胞。
- 将细胞转移至含有筛选剂的2 ml液体培养基中，置于24孔板内。若使用Nourseothricin，浓度为1.75 mg/ml。通过上下吹打混匀。每轮转化挑选24至50个菌落。用封口膜密封培养板，放入培养箱中培养。
- 一周后，将每孔100 μl培养物转移至含筛选剂的新鲜ASW培养基（2 ml）中，继续在24孔板中培养7天。存活的细胞系可用于后续研究。应通过PCR和Southern印迹分析基因组中的稳定整合及插入拷贝数。可用于此目的的基因组DNA可通过任何适用于植物DNA提取的小规模标准方法获得。
5. 典型结果
以1/100比例传代的细胞在培养7天后达到每毫升2500万个细胞的密度。使用适当参数对细胞进行电穿孔，得到的时间常数在10至14毫秒之间。当将细胞转移至培养瓶中的培养基时，应形成细胞团块。1小时后轻轻振荡，细胞应易于重悬。将1 ml转化后的细胞加入0.2% LMP琼脂中，应形成均匀但仅呈半固体状的凝胶。菌落通常在10至21天后出现。按照上述方案转化5 μg线性化DNA时，每个转化平板通常可获得50–100个菌落，而阴性对照平板上无菌落生长。挑取的菌落中约80%可通过液体培养基中的抗生素抗性实现阳性筛选，并用于后续研究。
| 终浓度 | 贮存液 | 配制1升所需体积 | |
| NaNO3 | 8.83 × 10-4 M | 75 g/L dH2O | 1 mL |
| NH4Cl | 3.63 × 10-5 M | 2.68 g/L dH2O | 1 mL |
| β-甘油磷酸 | 1 × 10-5 M | 2.16 g/L dH2O | 1 mL |
| H2SeO3 | 1 × 10-8 M | 1.29 mg/L dH2O | 1 mL |
| Tris-碱（pH 7.2） | 1 × 10-3 M | 121.1 g/L dH2O | 1 mL |
| K 微量金属溶液 | 表 2 | 1 mL | |
| f/2 维生素溶液 | 表 3 | 0.5 mL |
表1. O. tauri 生长培养基成分11, 12。 配制总体积为1升、盐度为30 ppt的人工海水，并按上表所示从储备液中加入各组分。培养基需经滤膜除菌，且在一周内使用。除维生素溶液外，所有化合物的储备液可混合成混合母液，每升培养基添加6 ml该混合液。
| 终浓度 | 储备液 | 配制1升所需用量 | |
| Na2EDTA • 2H2O | 1 x 10-4 M | 41.6 g | |
| FeCl3 • 6H2O | 1 x 10-5 M | 3.15 g | |
| Na2MoO4 • 2H2O | 1 x 10-8 M | 6.3 g/L dH2O | 1 mL |
| ZnSO4 • 7H2O | 1 x 10-9 M | 22.0 g/L dH2O | 1 mL |
| CoCl2• 6H2O | 1 x 10-9 M | 10.0 g/L dH2O | 1 mL |
| MnCl2 • 4H2O | 1 x 10-8 M | 180.0 g/L dH2O | 1 mL |
| CuSO4• 5H2O | 1 x 10-8 M | 9.8 g/L dH2O | 1 mL |
表2. 微量金属溶液11,12。用去离子水（dH2O）定容至1升，加热溶解。分装溶液后冷冻保存。表中所列终浓度是指在培养基中的最终浓度，而非微量金属溶液中的浓度。
| 终浓度 | 储存液 | 配制1升所需量 | |
| 维生素B12 | 1 × 10-10 M | 1 g/L dH2O | 1 mL |
| 生物素 | 1 × 10-9 M | 0.1 g/L dH2O | 10 mL |
| 盐酸硫胺素 • HCl | 1 × 10-7 M | 200 mg |
表3. f/2维生素溶液11。 用去离子水（dH2O）定容至1升，过滤除菌，分装后冻存。表中所列终浓度是指在最终培养基中的浓度，而非维生素溶液本身的浓度。
图1. 转化实验流程的图示概览。 通过电穿孔法对Ostreococcus tauri进行遗传转化的流程示意图。
图 2. 培养物生长情况。 细胞每隔 7 天在新鲜人工海水（ASW）中以 1/100 的比例进行无菌传代，并在配备月光蓝滤光片的植物培养箱中持续光照条件下培养。光照强度应接近 20 μmol m-2s-1，温度维持在 20 °C。细胞不需要持续振荡，但每隔 2 至 3 天需轻轻摇动一次，以防止细胞聚集。
图 3. 0.2% LMP 琼脂糖上的菌落形成。将 4 个平板转移至一个大的方形培养皿中，并用封口膜密封（左上）。当菌落形成后，直接挑选游离的（理想为圆锥形）菌落（右上），并用 200 µL 移液枪将其吸出。阴性对照中应无菌落生长（右下）。
讨论
细胞状态和培养的无菌性对转化实验至关重要。尽管细胞通常在12小时光照、12小时黑暗的周期中培养，但在这些条件下生长的细胞转化效率往往不足。在反复的离心和重悬步骤中，细胞应始终易于重悬。若细胞发生聚集或出现黏液状物质，则建议重新开始实验。通常情况下，每个转化平板上可观察到约50个菌落，而阴性对照平板上应无菌落生长。若转化效率较低，应调整培养条件以确保细胞处于最佳状态。影响转化效率的因素包括实验室环境温度（应接近20 °C）和操作速度（从细胞离心[2.3]到恢复培养[2.7]的整个操作应耗时约1小时）。此外，所有溶液均需在每次转化前新鲜配制。用于制备平板时，低熔点琼脂糖（LMP agarose）的浓度尤为关键。Ostreococcus细胞在高浓度琼脂糖中无法生长，在低浓度下则会扩散。
已有三类用于Ostreococcus的转化载体被发表6，预计近期将有更多载体被开发并发表。现有载体Pot-Luc6允许使用任意选择的启动子，并结合C端萤火虫荧光素酶标签，从而实现更快的转基因株系筛选以及可追踪的表达模式；而Potox载体6则携带来自Ostreococcus高亲和力磷酸盐转运蛋白（HAPT）基因的强诱导型13启动子，可用于目的基因的过表达。Potox-Luc载体源自Potox，额外携带一个荧光素酶标记，可用于过表达株系的间接筛选14。这些载体上有效的筛选标记为诺尔斯曲霉素（Nourseothricin）和G148。然而，Ostreococcus细胞对多种抗生素具有高度抗性，因此筛选转基因Ostreococcus细胞所需的化合物浓度高于常规模式系统（2 mg/ml）。
尽管该过程看似效率较低，但此实验所需的大量细胞和质粒DNA并不会构成显著障碍。更大的局限在于，每一个对抗性筛选标记具有抗性的生成细胞系都必须单独分析，以确认整个构建片段已整合到DNA中。我们已观察到一些实例，其中筛选标记成功表达并不意味着目的基因的实际插入；即可能发生部分整合。显然，基因组的随机插入也意味着利用该方法无法控制插入位点，目前正致力于开发基于同源重组的方法。然而，据我们所知，此处描述的方法是当前唯一经过表征的、可用于生成基因修饰的Ostreococcus细胞的方法。
由于Ostreococcus tauri最近才被用作实验模式生物，目前大多数针对这些细胞的研究方法仍可能随着参与该领域研究的科研群体不断扩大而持续发展和完善。本实验方案旨在帮助研究人员开始对Ostreococcus的研究，但绝不声称涵盖了有关该微藻基因组转化的全部知识。作者相信，读者可根据自身需求对本方案进行调整，因为不同实验室在培养箱条件（光照强度或光质）及其他参数上可能存在细微差异，这些因素通常需要在各自实验室中进行优化，以获得本方案所需的健康藻种。在熟练掌握本文所述技术后，可构建相应的载体，以在多种启动子调控下产生发光、荧光或其他标签融合的藻株。这一令人振奋的新型实验平台将有助于研究在复杂性降低的真核生物中，复杂的生化问题是如何被解决的，同时该系统也极大地方便了药理学研究方法的实施3。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
SynthSys 是由英国生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）与工程和物理科学研究理事会（EPSRC）资助项目 D019621 支持的综合系统生物学中心。欧盟第六框架计划“海洋基因组学”卓越网络向 FYB 提供的资助支持了基因转化方法的开发。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养基成分 | |||
| Instant Ocean 海水盐 | 来自 amazon.co.uk 或 rocketaquatics.co.uk | ||
| NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
| NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
| 甘油-2-磷酸二钠盐水合物 | G9422-100G | Sigma | |
| H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
| 超纯 Tris | 15504-020 | Invitrogen | |
| Na2EDTA∙2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
| FeCl3∙6H2O | 157740 | Sigma | |
| Na2MoO4∙2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
| ZnSO4∙7H2O | Z0251 | Sigma | |
| CoCl2∙6H2O | 31277 | Sigma | |
| MnCl2∙4H2O | 203734-5G | Sigma | |
| CuSO4∙5H2O | C8027 | Sigma | |
| 维生素 B12（氰钴胺） | V2876 | Sigma | |
| 生物素 | 47868 | Sigma | |
| 硫胺素 ∙ HCl | T4625 | Sigma | |
| 氨苄青霉素 | A9518-25G | Sigma | |
| 新霉素 | N6386 | Sigma | |
| 卡那霉素 | K4000 | Sigma | |
| 培养用耗材 | |||
| T25 组织培养瓶，带通气孔和倾注通道的悬浮培养瓶 | 83.1810.502 | Starstedt | |
| T75 组织培养瓶，带通气孔和倾注通道的悬浮培养瓶 | 83.1813.502 | Starstedt | |
| T175 组织培养瓶，带通气孔和倾注通道的悬浮培养瓶 | 83.1812.502 | Starstedt | |
| TPP 瓶顶过滤器，1L，完整套装 | 99950T | Helena Bioscience | |
| TPP 瓶顶过滤器，500ml | 99500T | Helena Bioscience | |
| TPP 瓶顶过滤器，250ml | 99250T | Helena Bioscience | |
| TPP 瓶顶过滤器，150ml | 99150T | Helena Bioscience | |
| 海水水族箱用盐度计 | DSG-10 | Daeyoon | |
| 转化用化学试剂 | |||
| D-山梨醇 | S6021-1KG | Sigma | |
| Pluronic F-68 溶液 | P5556-100ML | Sigma | |
| ClonNat | 51000 | Werner | |
| 低熔点琼脂糖 | 16520-050 | Invitrogen | |
| 转化用耗材 | |||
| T25 组织培养瓶，带通气孔和倾注通道的悬浮培养瓶 | 83.1810.502 | Starstedt | |
| T75 组织培养瓶，带通气孔和倾注通道的悬浮培养瓶 | 83.1813.502 | Starstedt | |
| T175 组织培养瓶，带通气孔和倾注通道的悬浮培养瓶 | 83.1812.502 | Starstedt | |
| Greiner 50ml 离心管 | 227261 | GBO | |
| Gene Pulser/MicroPulser 电穿孔杯，0.2 cm 间隙，50 个 | 165-2086 | Bio-Rad | |
| 圆形 PS 培养皿，3 个通气孔，H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International | |
| 带四个通气孔的方形聚苯乙烯培养皿，经辐照灭菌，透明，120mm | FB51788 | Fisher Scientific | |
| 月光蓝光滤片 | 183 | Lee Lighting |
参考文献
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