蛋白质错误折叠循环扩增（PMCA）是一种用于研究朊病毒转化、毒株及物种屏障的体外实验方法，也可用作朊病毒检测实验。
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本文内容
摘要
摘要
朊病毒是导致动物和人类传染性海绵状脑病（TSE）的致病因子，该疾病具有传染性且 invariably 致命9,18朊病毒蛋白具有两种不同的异构体：非传染性的宿主编码蛋白（PrPC）和感染性蛋白质（PrPSc），PrP 的一种异常折叠异构体C 8.
使用朊病毒因子进行研究的一个挑战是，在宿主接种后出现临床症状之前存在很长的潜伏期13。这传统上要求进行耗时且昂贵的动物生物测定研究。此外，由于PrPSc具有异常的构象和聚集状态，其生物化学与生物物理特性尚未得到充分表征。
PrPSc 可诱导PrP的构象转化C 至 PrPSc 体外14. PMCA 是一种 体外 利用超声处理和孵育循环来大量制备PrP的技術Sc，以加速的速率从含有过量PrP的系统中C 以及微量的PrPSc 种子19该技术已证明能有效重现PrP的物种和菌株特异性Sc PrP 的转化C，以模拟朊病毒株间的干扰效应，并扩增极低水平的PrPSc 来自感染组织、体液和环境样本6,7,16,23 .
本文详细介绍了蛋白质错误折叠循环扩增（PMCA）的实验方案，包括减少污染的建议、获得稳定结果的方法以及结果的定量分析。我们还讨论了PMCA的多种应用，包括传染性朊病毒株的生成与表征、朊病毒株间的干扰作用，以及环境中朊病毒的检测。
方案
1. 准备设备
- 使用连接至 Thermo Electron Neslab EX-7 水浴箱（美国新罕布什尔州纽因顿）的 Misonix 3000 或 Misonix 4000 超声波破碎仪（美国纽约州法明代尔），以维持 37 °C 的恒定温度。将样品置于购自 Thermo Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）的带圆顶盖的 200 μl 薄壁 PCR 管条中进行超声处理。
- 全新的超声波破碎仪需要一段连续运行的“磨合期”9。为期两个月的磨合期包括以振幅 10 进行 40 秒超声处理，随后 10 分钟孵育的循环操作。应观察到钛制微孔板探头表面出现侵蚀现象（图 1，面板 B）。由于钛制微孔板探头的侵蚀，循环水将呈现白色浑浊状态。需每日更换该水。
- PrPSc 的扩增效率在微孔板探头的不同区域有所差异。在距微孔板探头中心半径 5 cm 范围内可获得最佳的 PrPSc 扩增效率（见 图 1，面板 C）。
- 一轮 PMCA 包含 144 个循环。每个循环包括 5 秒超声处理和 10 分钟孵育。每轮 PMCA 大约耗时 24 小时。
- 超声功率输出（显示在超声波破碎仪控制面板上）会因超声仪支架中 PCR 管的数量以及水浴循环水的温度而变化。确保水温平衡至 37 °C，且超声仪管架中装载的 PCR 管不超过其容量的 30%（图 1，面板 C）。将 PCR 管均匀分布在微孔板探头中，管条之间至少保留一排空位，每条管条连接的 PCR 管不超过四根（图 1，面板 C）。
- 超声强度对于成功扩增朊病毒株至关重要。超声过程中，调节振幅使功率输出维持在 155 ~ 170 瓦之间。在本实验室中，Misonix 3000 和 Misonix 4000 的功率设置分别为六和七。
- 水浴中应使用蒸馏水，以避免硬水沉积物的积累。每周更换一次水。在孵育和超声循环过程中，微孔板探头盖内部会产生冷凝水。为防止冷凝，可在超声仪外壳顶部安装一个小的水族加热垫，如 图 1 面板 A 所示。
2. 样品制备
- 所有涉及动物的操作均经克瑞顿大学机构动物护理与使用委员会批准，并符合《实验动物护理与使用指南》的要求。在采集任何组织之前，必须对动物进行麻醉，并用含有5 mM EDTA、pH为7.4的冰冻磷酸盐缓冲盐水溶液经心脏灌注，以清除脑部血液，避免血液对PMCA反应的抑制作用7。采用无菌技术快速采集动物组织，并为每种朊病毒株配备专用解剖工具。解剖后，将组织放入1.5 ml微量离心管中，置于干冰上速冻，随后在-80 °C保存，直至进行匀浆处理。
- 为制备PMCA底物（PrPC）溶液，使用Tenbroeck组织研磨器将未感染的仓鼠脑组织（UN BH）用冰浴转化缓冲液（见第3部分）制成10%质量/体积（w/v）的匀浆溶液。匀浆过程中应避免将空气吸入研磨器，以防溶液产生过多泡沫。将溶液在500 × g条件下离心30秒以澄清，取上清液分装至1.5 ml微量离心管中。保存于-80 °C，待后续使用。
- 为制备PMCA种子（PrPSc）溶液，将感染性材料（脑组织、脾脏、淋巴结、其他组织或受污染的土壤）用冰水制成10% w/v的匀浆溶液，并分装至0.6 ml微量离心管中。保存于-80 °C，待后续使用。
3. 准备转化缓冲液
- 在50 ml容量瓶中称取0.5093 g Triton X-100（最终Triton X-100浓度为1%）（Sigma-Aldrich GmbH；德国施泰因海姆）。
- 加入一片Complete蛋白酶抑制剂片剂（Roche Diagnostics GmbH；德国曼海姆）。
- 加入0.0931 g EDTA（最终EDTA浓度为5 mM）（Mallinckrodt Baker Inc.；美国新泽西州菲利普斯堡）。
- 用1 N NaOH将pH值调节至7.4。
- 用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）定容至50 ml（Mediatech Inc.；美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。
- 使用真空过滤装置，通过0.45 μm硝酸纤维素膜过滤溶液。转化缓冲液可在4 °C保存不超过一个月。
4. 使用PMCA扩增朊病毒株
- 将PMCA种子以1:20的比例稀释到PMCA底物中（即 将5 μl PMCA种子与95 μl PMCA底物混合加入PCR管中。取出15 μl等分试样，于-80 °C保存，作为未超声处理的对照；该未超声对照将用于定量PrPSc 通过蛋白酶K（PK）消化后进行蛋白质印迹（WB）分析来实现扩增。可通过将另一份15 μl等分试样在37 °C下孵育整个PMCA反应过程，制备额外的未超声处理对照。为满足统计学要求，至少需进行三次重复实验。
- 将剩余的样品（70 μl）进行一轮如图所示的PMCA处理 图1，图A。每5小时振荡试管一次，以避免PCR管的圆顶盖上产生冷凝水。
- 样本管在任何操作后打开前，应先离心并轻轻涡旋混匀（注意避免溶液进入穹顶盖内），以确保样品均一并防止潜在污染。
- 对于短潜伏期菌株的连续PMCA（sPMCA）即 HY TME、HaCWD 或 263K），将匀浆后材料按 1:20 比例稀释，即从第一轮中取 5 μl 匀浆样品加入 95 μl 新鲜未感染脑匀浆中（图2，图B）。
- 对于长潜伏期菌株的sPMCA即 DY TME、139H、22CH、22AH 或 ME7H），通过将第一轮超声处理后的样品 50 μl 转移至 50 μl 新鲜未感染脑匀浆中，按 1:1 比例稀释超声处理后的材料（图2，图B）。
- 从先前稀释的超声处理混合液（步骤 4.4 或 4.5）中取出两份 15 μl 等分试样，一份储存于 -80 °C，另一份储存于 37 °C（作为第二轮 PMCA 的未超声对照溶液）。将剩余部分进行第二轮 PMCA 处理。
- 该程序可无限重复进行。在我们的实验室中，已成功完成多达十五轮的PMCA，且毒株特性保持不变。
- 用蛋白酶K（PK）消化样品。对于常规的WB实验，将5 μl浓度为80 μg/ml的PK与5 μl样品混合（最终PK浓度为40 μg/ml），在37 °C孵育1小时。加入10 μl上样缓冲液，将溶液煮沸10分钟。待溶液冷却后，取10 μl上样至凝胶中。
- 通过WB分析PK消化后的样本，以评估扩增的PrP量，从而计算扩增成功率Sc 通过将它们与未经超声处理的对照组进行比较20,21 图2，Panel C 或已知量的未消化PK的重组PrP。
5. 避免交叉污染
必须采取关键步骤以最大限度减少交叉污染以及因脱氧核糖核酸（DNA）残留导致的假阳性结果 从头 蛋白酶抗性产物的形成
- 针对每种朊病毒株的样本采集，应使用专用的一套解剖工具（即 镊子、尖头镊、剪刀）。
- 在匀浆未感染的脑组织以制备PMCA底物前，用1%次氯酸钠溶液擦拭移液器。将超声仪的PCR管架、组织匀浆器以及PCR管储存架浸泡于1%次氯酸钠溶液中10分钟，并用蒸馏水彻底冲洗。
- 每次需对新样本进行匀浆、准备新的PMCA实验或在sPMCA轮次之间分装时，均应使用一张新的Versi-Dry Lab Soaker覆盖工作区域。
- 每次处理新样本时（特别是在sPMCA轮次之间转移分装样本时）均应更换新手套。
- 每个PMCA循环中采用短时间超声脉冲。每次5秒超声结合10分钟孵育的循环已足以扩增朊病毒，同时避免从头生成 PrPSc1,20,21,23,24。正如其他实验室所证实，延长超声时间、提高超声振幅或增加PMCA循环次数，均会提高从头生成 PrPSc的可能性2。
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结果
蛋白质错误折叠循环扩增（PMCA）用于扩增PrPSc 体外7, 12, 14, 19, 24一个成功的PrPSc 扩增通过蛋白免疫印迹中抗蛋白酶K抗性朊病毒蛋白条带强度的增加来显示（仓鼠来源的朊病毒株迁移于19至30 kDa之间），如图所示 图3. PMCA后其条带强度的增加表明蛋白酶K抗性PrP发生了扩增Sc 仓鼠来源的朊病毒蛋白、HaCWD 和 DY TME 的成功扩增结果如 WB 分析所示 图3 通过比较PMCA处理前（第5道和第7道）与处理后（第4道和第6道）的条带强度。
PrPSc 经蛋白酶K消化后进行WB分析，显示三条条带，分别对应于双糖基化、单糖基化和无糖基化的朊病毒蛋白，位置由高到低。某些朊病毒株可通过其电泳迁移率加以区分。例如，HaCWD与DY TME朊病毒株的迁移位置相差2 kDa。（图3，分别为第1和第2泳道）。
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讨论
扩增传染性朙蛋白所面临的挑战包括漫长的潜伏期以及高昂的成本 体内 实验。PMCA 技术是一种经济有效的方法，可用于扩增具有感染性的朊病毒因子。多家实验室已证实 PMCA 能够准确扩增朊病毒株 体外 7, 9, 12, 14, 19,24 .
朊病毒病可在物种间传播。Bessen 和 Marsh 成功地将传染性水貂脑病接种至仓鼠，结果产生了两种不同的仓鼠来源的朊病毒株5 在一项精巧的研究中，Telling 及其同事利用表达鹿源 PrP 的转基因小鼠，通过 sPMCA 扩增了小鼠来源的朊病毒株 RML。C (Tg(CerPrP)1536+/-) 作为PMCA底物。将PMCA适应后的材料接种至Tg(CerPrP)1536+/-个体后，观察到疾病迅速发作。12 同样，Kurt 等 能够利用非鹿科物种的PMCA底物扩增鹿科动物中的慢性消耗性疾病（CWD）——一种朊病毒病15这些数据表明，朊病毒疾病中的物种屏障可以被绕过 体...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 Vesper Fe Marie Ramos 博士对本文稿的审阅。本研究由国家研究资源中心（P20 RR0115635-6、C06 RR17417-01 和 G20RR024001）以及国家神经疾病和中风研究所（2R01 NS052609）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Misonix 3000 | Misonix | S-3000 | |
| Misonix 4000 | Misonix | S-4000 | |
| Tenbr–ck 组织研磨器 | Kontes | 885000-0007 | |
| Neslab EX-7 水浴锅 | Thermo Electron | Neslab EX-7 | |
| 0.2 ml PCR 管条 | Thermo Scientific | AB-0451 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-100ML | |
| 完全蛋白酶抑制剂 | Roche | 11 697 498 001 | |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-00 | |
| DPBS | Mallinckrodt Baker Mediatech | 21-031-CV | |
| Versi-Dry 实验室浸泡垫 | Fisher Scientific | 14 206 28 | |
| Repti Therm 加热器 | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
参考文献
- Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease. PLoS pathogens. 7, e1001317(2011).
- Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype. PLoS Pathog. 5, e1000421(2009).
- Bessen, R. A., Marsh, R. F. Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent. J. Virol. 66, 2096-2101 (1992).
- Bessen, R. A., Marsh, R. F. Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy. J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).
- Bessen, R. A., Marsh, R. F. Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters. J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).
- Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De Castro, J., Soto, C. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134, 757-768 (2008).
- Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P., Soto, C. Cell-free propagation of prion strains. EMBO J. 27, 2557-2566 (2008).
- Caughey, B., Raymond, G. J. The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive. J. Biol. Chem. 266, 18217-18223 (1991).
- Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. Formation of native prions from minimal components in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9741-9746 (2007).
- Dickinson, A. G., Fraser, H., Meikle, V. M., Outram, G. W. Competition between different scrapie agents in mice. Nat. New Biol. 237, 244-245 (1972).
- Gonzalez-Romero, D., Barria, M. A., Leon, P., Morales, R., Soto, C. Detection of infectious prions in urine. FEBS Lett. 582, 3161-3166 (2008).
- Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers. PLoS Pathog. 4, e1000139(2008).
- Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously. J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).
- Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature. 370, 471-474 (1994).
- Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N. Virology. 387, 3235-3240 (2009).
- Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. Environmental sources of scrapie prions. J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).
- Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area. Prion. 3, 171-183 (2009).
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216, 136-144 (1982).
- Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411, 810-813 (2001).
- Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).
- Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type. Journal of virology. , (2011).
- Schutt, C. R., Bartz, J. C. Prion interference with multiple prion isolates. Prion. 2, 61-63 (2008).
- Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource. Journal of. 84, 5706-5714 (2010).
- Shikiya, R. A., Bartz, J. C. In vitro generation of high titer prions. Journal of virology. , (2011).
- Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA. Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).
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