蛋白质错误折叠循环扩增朊病毒

摘要

蛋白质错误折叠循环扩增（PMCA）是一种用于研究朊病毒转化、毒株及物种屏障的体外实验方法，也可用作朊病毒检测实验。

摘要

朊病毒是导致动物和人类传染性海绵状脑病（TSE）的致病因子，该疾病具有传染性且 invariably 致命^9,18朊病毒蛋白具有两种不同的异构体：非传染性的宿主编码蛋白（PrP^C）和感染性蛋白质（PrP^Sc），PrP 的一种异常折叠异构体^{C 8}.

使用朊病毒因子进行研究的一个挑战是，在宿主接种后出现临床症状之前存在很长的潜伏期¹³。这传统上要求进行耗时且昂贵的动物生物测定研究。此外，由于PrP^Sc具有异常的构象和聚集状态，其生物化学与生物物理特性尚未得到充分表征。

PrP^Sc 可诱导PrP的构象转化^C 至 PrP^Sc 体外¹⁴. PMCA 是一种 体外 利用超声处理和孵育循环来大量制备PrP的技術^Sc，以加速的速率从含有过量PrP的系统中^C 以及微量的PrP^Sc 种子¹⁹该技术已证明能有效重现PrP的物种和菌株特异性^Sc PrP 的转化^C，以模拟朊病毒株间的干扰效应，并扩增极低水平的PrP^Sc 来自感染组织、体液和环境样本^6,7,16,23 .

本文详细介绍了蛋白质错误折叠循环扩增（PMCA）的实验方案，包括减少污染的建议、获得稳定结果的方法以及结果的定量分析。我们还讨论了PMCA的多种应用，包括传染性朊病毒株的生成与表征、朊病毒株间的干扰作用，以及环境中朊病毒的检测。

方案

1. 准备设备

1. 使用连接至 Thermo Electron Neslab EX-7 水浴箱（美国新罕布什尔州纽因顿）的 Misonix 3000 或 Misonix 4000 超声波破碎仪（美国纽约州法明代尔），以维持 37 °C 的恒定温度。将样品置于购自 Thermo Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）的带圆顶盖的 200 μl 薄壁 PCR 管条中进行超声处理。
2. 全新的超声波破碎仪需要一段连续运行的“磨合期”⁹。为期两个月的磨合期包括以振幅 10 进行 40 秒超声处理，随后 10 分钟孵育的循环操作。应观察到钛制微孔板探头表面出现侵蚀现象（图 1，面板 B）。由于钛制微孔板探头的侵蚀，循环水将呈现白色浑浊状态。需每日更换该水。
3. PrP^Sc 的扩增效率在微孔板探头的不同区域有所差异。在距微孔板探头中心半径 5 cm 范围内可获得最佳的 PrP^Sc 扩增效率（见 图 1，面板 C）。
4. 一轮 PMCA 包含 144 个循环。每个循环包括 5 秒超声处理和 10 分钟孵育。每轮 PMCA 大约耗时 24 小时。
5. 超声功率输出（显示在超声波破碎仪控制面板上）会因超声仪支架中 PCR 管的数量以及水浴循环水的温度而变化。确保水温平衡至 37 °C，且超声仪管架中装载的 PCR 管不超过其容....

结果

蛋白质错误折叠循环扩增（PMCA）用于扩增PrP^Sc 体外^{7, 12, 14, 19, 24}一个成功的PrP^Sc 扩增通过蛋白免疫印迹中抗蛋白酶K抗性朊病毒蛋白条带强度的增加来显示（仓鼠来源的朊病毒株迁移于19至30 kDa之间），如图所示 图3. PMCA后其条带强度的增加表明蛋白酶K抗性PrP发生了扩增^Sc 仓鼠来源的朊病毒蛋白、HaCWD 和 DY TME 的成功扩增结果如 WB 分析所示 图3 通过比较PMCA处理前（第5道和第7道）与处理后（第4道和第6道）的条带强度。

PrP^Sc 经蛋白酶K消化后进行WB分析，显示三条条带，分别对应于双糖基化、单糖基化和无糖基化的朊病毒蛋白，位置由高到低。某些朊病毒株可通过其电泳迁移率加以区分。例如，HaCWD与DY TME朊病毒株的迁移位置相差2 kDa。（图3，分别为第1和第2泳道）。

讨论

扩增传染性朙蛋白所面临的挑战包括漫长的潜伏期以及高昂的成本 体内 实验。PMCA 技术是一种经济有效的方法，可用于扩增具有感染性的朊病毒因子。多家实验室已证实 PMCA 能够准确扩增朊病毒株 体外 ^{7, 9, 12, 14, 19,24} .

朊病毒病可在物种间传播。Bessen 和 Marsh 成功地将传染性水貂脑病接种至仓鼠，结果产生了两种不同的仓鼠来源的朊病毒株⁵ 在一项精巧的研究中，Telling 及其同事利用表达鹿源 PrP 的转基因小鼠，通过 sPMCA 扩增了小鼠来源的朊病毒株 RML。^C (Tg(CerPrP)1536+/-) 作为PMCA底物。将PMCA适应后的材料接种至Tg(CerPrP)1536+/-个体后，观察到疾病迅速发作。¹² 同样，Kurt 等 能够利用非鹿科物种的PMCA底物扩增鹿科动物中的慢性消耗性疾病（CWD）——一种朊病毒病¹⁵这些数据表明，朊病毒疾病中的物种屏障可以被绕过 体.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Misonix 3000	Misonix	S-3000
Misonix 4000	Misonix	S-4000
Tenbr–ck 组织研磨器	Kontes	885000-0007
Neslab EX-7 水浴锅	Thermo Electron	Neslab EX-7
0.2 ml PCR 管条	Thermo Scientific	AB-0451
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-100ML
完全蛋白酶抑制剂	Roche	11 697 498 001
EDTA	J.T. Baker	4040-00
DPBS	Mallinckrodt Baker Mediatech	21-031-CV
Versi-Dry 实验室浸泡垫	Fisher Scientific	14 206 28
Repti Therm 加热器	Zoo Med Laboratories, Inc.	RH-4