一种针对孵化后期（晚于汉伯格和汉密尔顿分期（HH）22期）鸡胚的基因转移方法被描述。该方法克服了传统方法的若干缺点。 在卵内 电穿孔技术应用于较晚期的鸡胚，是研究较晚期发育阶段基因功能与调控的有用技术。
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摘要
摘要
鸡胚为研究胚胎发育过程中的基因功能与调控提供了极佳的模型系统。 在卵内 电穿孔是一种用于过表达外源基因或下调内源基因的强有力方法 体内 在鸡胚胎中1. 不同的结构，例如编码基因的DNA质粒2-4，小干扰RNA（siRNA）质粒5，小合成RNA寡核苷酸6和吗啉代反义寡核苷酸7 可通过电穿孔技术轻松转染鸡胚。然而，该技术的应用存在 在卵内 电穿孔技术仅限于孵化早期阶段的胚胎（根据Hamburger和Hamilton分期，早于HH20期）8 并且其在较晚期胚胎（发育阶段晚于HH22期，约发育3.5天后）中的应用存在一些局限性。例如，晚期胚胎的卵黄膜通常与壳膜粘连，打开蛋壳窗口会导致血管破裂，从而引起胚胎死亡；较晚期的胚胎表面覆盖有卵黄膜和尿囊血管，难以接近和操作胚胎；此外，晚期胚胎活动剧烈，通过蛋壳上相对较小的窗口难以控制其方位。
在本实验方案中，我们展示了一种用于在较晚阶段（晚于HH22期）将基因导入鸡胚的ex ovo电穿孔方法。对于ex ovo电穿孔，胚胎在培养皿中进行培养9，卵黄囊和尿囊血管充分展开。在此条件下，较晚期的鸡胚易于接触和操作，因此该方法克服了传统in ovo电穿孔在较晚期鸡胚应用中的局限性。利用该方法，质粒可被高效转染至较晚期鸡胚的不同部位10-12。
方案
1. Ex ovo 培养
- 将新鲜受精卵横向放置于强制通风孵育箱（BSS160，Ehret，德国）中，在37.5 °C、60%湿度条件下进行孵育。储存于12 °C超过一周的鸡蛋不应使用。
- 孵育2.5天后（约HH17期），取出鸡蛋，并用铅笔在顶部标记方向，以指示敲击开壳的位置。
- 在敲击开壳前，向一个洁净的大培养皿（直径145 mm；Greiner Bio-One GmbH，德国）中加入约20 ml无菌蒸馏水。
- 将另一个无菌小培养皿（直径94 mm；Greiner Bio-One GmbH）放入大培养皿中。
- 将鸡蛋底部轻击锋利的金属边缘使其破裂，小心打开鸡蛋，并将每个鸡蛋的全部内容物转移至小培养皿中。
- 用盖子盖住大培养皿，并将其放入另一台孵育箱（BINDER GmbH，Tuttlinge，德国）中，在37.5 °C、约60%湿度条件下继续培养。根据实验需要孵育相应天数后，即可用于胚胎电穿孔实验。
2. ex ovo 电转染的准备
- 使用微电极拉制仪（PUL-100 Micropipette Puller；World Precision Instruments，德国柏林）和直径为1.0 mm的玻璃管（TW100F-4；World Precision Instruments）拉制玻璃毛细管，并将玻璃毛细管尖端折断至合适直径。
- 根据靶向组织和胚胎大小，设置适当的电穿孔参数（例如，针对不同组织和胚胎大小采用不同的电压），并将电极连接至电穿孔仪（CUY21-Edit；Nepa Gene，日本千叶）。
- 制备含有目标基因（例如，钙黏蛋白7（Cad7；pCAGGS-Cad7，浓度为2.0 μg/μl））和标记基因（例如，绿色荧光蛋白（GFP；pCAGGS-GFP，浓度为0.25 μg/μl））的pCAGGS载体质粒溶液。然后加入终浓度为0.1%的快绿染料（Sigma），使质粒溶液呈现绿色以便观察。
- 使用口吸移液法将质粒溶液吸入玻璃毛细管中。
3. 通过基因转移将基因导入鸡视顶盖 体外孵化 电穿孔
- 之后 体外 培养，例如在孵育第6天（E6）时，鸡胚即用于 体外孵化 电穿孔
- 用精细镊子小心撕开覆盖在视顶盖上的卵黄膜和羊膜，并在视顶盖表面滴加3滴无菌0.9%氯化钠溶液。
- 使用玻璃毛细管通过口吸移液法将质粒溶液注入视顶盖腔内。
- 将电极（钨针阴极和矩形板状阳极，CUY 661-3x7，Nepa Gene）置于视顶盖旁，立即使用电穿孔仪对视顶盖施加电脉冲（共六次脉冲，每次25 V，脉冲时长60 ms，间隔100 ms）。
- 用培养皿盖盖好大型培养皿，并将其放回培养箱。在适当天数的培养后（例如电穿孔后2或3天），取材视顶并进行固定，以用于免疫染色图1以及生物检测。
4. 代表性结果
Cad7 和 GFP 外源蛋白的成功过表达 体外 电穿孔如图所示 图1 以Cad7质粒与GFP质粒在E6期共同电穿孔至视顶盖为例，电穿孔后两到三天收集胚胎并进行固定。在E8期，整体成像显示GFP蛋白在视顶盖中强烈表达（图1A-C）。此外，在E9期顶盖组织切片中，GFP蛋白（绿色） 图1D）以及Cad7蛋白（红色） 图1E）共表达（黄色表示 图1F），表明 体外 电穿孔是一种将基因导入较晚阶段鸡胚的高效方法 体内.
图1. 当在胚胎发育第6天（E6）将编码GFP和Cad7的质粒共转染至鸡视顶盖时，转染后两到三天 体外 电穿孔后，GFP蛋白（绿色）在E8期的全胚标本图像（A-C）中强烈表达。在E9期中脑顶盖切片中，GFP蛋白（D中绿色）与Cad7蛋白（E中红色）共表达（F中黄色）。BF，明场图像。比例尺： 200 μm 在 A 中表示 A-C； 100 μm 在 D 中表示 D-F。
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讨论
本方案提供了将基因转入较晚期鸡胚（例如在E6期转入视顶盖）的操作指南 体外孵化 电穿孔。该方法将电穿孔技术的应用扩展至较晚期的鸡胚，可被众多实验室便捷地用于基因功能研究。 体内 在后期阶段，通过该方法可成功对从E4到至少E7时期的胚胎进行电穿孔，并且电穿孔后的胚胎可存活至E15。11除了大脑外，该方法还可用于将基因转入鸡的肢体系统11.
进行 ex ovo 电转染时应特别注意。例如，为了通过 ex ovo 培养获得较高的胚胎存活率，所使用的鸡蛋应保持新鲜，并在 12 °C 下储存不超过一周；小型培养皿应无菌，且破壳操作应在约 E2.5 期进行。ex ovo 电转染时，应根据胚胎的发育阶段及目标部位正确选择电极的大小和放置位置。当共转染两个质粒时，注射的质粒浓度应保持适当的比例（例如，标记基因 GFP 与目标基因的比例为 1:8），以确保 GFP 标记的细胞几乎同时共表达目标基因。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由德国研究基金会（DFG；LU1455/1-1）的资助项目支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 电穿孔仪 | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit | |
| 电极 | Nepa Gene, Japan | CUY661-3x7 | |
| 孵蛋器 | Ehret, Germany | BSS160 | |
| 胚胎培养箱 | BINDER GmbH, Germany | ||
| 荧光显微镜 | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| 培养皿 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | ||
| 微–电极拉制仪 | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
参考文献
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