复制和β细胞功能评估Adenovirally转分离的啮齿动物胰岛

Summary

该协议允许一个确定调节功能的β细胞质量的因素，找到治疗糖尿病的潜在的治疗靶点。该协议包括一个精简的方法来评估胰岛细胞复制和β细胞功能，在离体大鼠胰岛细胞与腺病毒基因表达操纵。

Abstract

主要是葡萄糖稳态控制的内分泌激素的胰岛素和胰高血糖素，胰岛β和α细胞分泌，分别。功能的β细胞质量是决定解剖β细胞质量以及β细胞的能力，以应对营养负荷。一个丧失功能的β细胞质量是中心^1-3糖尿病的两种主要形式。而下降功能的β细胞自身免疫性1型糖尿病发作的质量结果，在2型糖尿病，这一递减的发展都无法适当分泌胰岛素的β细胞和β细胞的破坏从干部机制。因此，努力恢复功能的β细胞质量更好的治疗和糖尿病的潜在治疗至关重要。

正在努力找出刺激的复制和增强β细胞的功能，可以利用的分子途径。理想的情况下，治疗的目标，同时提高β细胞的生长和功能。也许更重要的虽然是一种策略，刺激β细胞的生长，以确定是否损害的β细胞功能（如某些癌基因），反之亦然成本。

由系统抑制或过度在离体大鼠胰岛靶基因的表达，可以增加功能的β细胞质量^4-6找出潜在的治疗靶点。腺病毒载体可有效地过度或击倒蛋白在离体大鼠胰岛^4,7-15就业。在这里，我们提出了一种方法来操纵利用腺病毒转导的基因表达和评估胰岛复制，并在离体大鼠胰岛β细胞功能（ 图1）。这种方法已经被以前使用，以确定新的目标，调节β细胞复制或功能^{5,6,8,9,16,17。}

Protocol

1。腺病毒介导和培养大鼠胰岛

1. 准备加入所需数量的2毫升（载8毫米葡萄糖，10％胎牛血清，50个单位/ ml青霉素，50μg/ mL链霉素的RPMI 1640培养媒体）媒体6以及非组织文化的涂层板井。例如，一个典型的实验可能需要三口井 - 一个无病毒控制，病毒控制（例如，表达GFP的腺病毒），实验组。
2. 暖板放置到组织文化的孵化器，为至少30分钟至37°C。
3. 紧随6以及非组织文化的涂层板个别井大鼠胰岛分离^18,19 100-200胰岛。第六胰岛细胞所需的胰岛素分泌和胸腺嘧啶掺入法。其余的胰岛细胞可用于RNA基因表达研究或蛋白质的免疫隔离的隔离。

[注:从这点出发，请遵循和生物危险材料的处理，使用，处置制度的协议。]

4. 轻轻地旋转以及中心板带来的小岛。
5. 直接吸取上盘中心的胰岛腺病毒。使用100-500多重感染（内政部，比靶细胞病毒蚀斑形成单位）。
6. 让胰岛休息5分钟。
7. 将组织文化的孵化器（37℃，5％CO _2）板块。
8. 24小时后，轻轻地摇动板带来的胰岛井中心和转让使用P200的微管以及含有新鲜的媒体到一个新的胰岛。如果胰岛成为附着板，就可以轻轻抛下枪头。

....

Discussion

建立通路，可调制刺激的复制和增强β细胞的功能有关糖尿病的两个主要形式。因为功能的β细胞质量是依赖胰岛素​​分泌细胞的存在和功能上，评估这些因素，同时有它的优势。这个协议描述为确定一种蛋白质的过度表达或抑制是否会导致功能的β细胞质量的变化， 在体外培养 ，然后可以测试体内疗效的精简协议。

这个协议的一个限制是，胰岛是一种微型器官的多种细胞类型，包括组成，而不是仅限于α，β，δ，ε，和PP细胞。胰岛细胞复制的变化可能不会完全转化为β细胞复制的变化，因为80-90％的大鼠胰岛细胞β细胞。观测到的变化胰岛的可能性复制是由于非β细胞复制存在。因此，这个协议的逻辑和验证的下一步可能会研究使用胸苷类似物加上免疫或流式细胞仪分析^5,6β细胞复制。这验证分析，也可以缓解成胰岛细胞的增殖独立非特异性TdR掺入潜在的问题。

另一个潜在的缺点在于对腺病毒转导效率。转导效率的60-70％是合理的实现，但成效的一个关键因素是腺病毒转导的时机。至关重要的是尽快传导效率最大化的腺病毒的分离胰岛文化。胰.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
RPMI 1640培养媒体	Gibco公司	11879
青霉素/	Gibco公司	15140
6孔板	BD-猎鹰	35-1146	非TC治疗
[甲基-3H]-胸苷	Perkin Elmer公司	NET027Z001MC	1毫居里/毫升
微型离心管	丹维尔	C2170	1.7毫升
氯化钠	西格玛	59888
氯化钾	阿库罗斯福冈	42409
锦2 </ SUB> PO 4	阿库罗斯福冈	20592
硫酸镁	阿库罗斯福冈	41348
氯化钙	阿库罗斯福冈	34961
肝素钠	西格玛	H0887	1个M解决方案
35％BSA	西格玛	A7979
碳酸氢钠	阿库罗斯福冈	42427
D-葡萄糖	西格玛	G8769
氯乙酸	Fisher Scientific则	SA9410-1	10％W / V
氢氧化钠	阿库罗斯福冈	12426
闪烁计数管	萨尔斯塔特	58.536	7毫升，PP
闪烁计数管帽	萨尔斯塔特	65.816
安全的Econo计数鸡尾酒	零售物价指数	111175
胰岛素的RIA	西门子	TKIN2
BCA分析套件	Thermo Scientific的	23250
			设备
离心分离	Eppendorf公司	5415R
闪烁计数管架	萨尔斯塔特	93.1431.001
液体闪烁计数器	Perkin Elmer公司	三，碳水化合物2910TR