本方案可用于鉴定调控功能性β细胞质量的因素，以寻找治疗糖尿病的潜在治疗靶点。该方案包含一种简化的流程，通过腺病毒操纵基因表达后，评估分离的大鼠胰岛中胰岛的复制能力及β细胞功能。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
葡萄糖稳态主要由胰岛β细胞和α细胞分别分泌的内分泌激素胰岛素和胰高血糖素调控。功能性β细胞质量由解剖学上的β细胞质量和β细胞对营养负荷的响应能力共同决定。功能性β细胞质量的减少是1型和2型糖尿病两种主要形式的核心病理机制1-3。在1型糖尿病中，功能性β细胞质量的下降源于自身免疫攻击；而在2型糖尿病中，这种减少则由β细胞无法适当分泌胰岛素以及多种机制导致的β细胞破坏共同引起。因此，恢复功能性β细胞质量的努力对于改善糖尿病治疗乃至实现潜在治愈至关重要。
目前，研究人员正在努力识别可用于促进β细胞增殖并增强其功能的分子通路。理想情况下，治疗靶点应能同时改善β细胞的生长和功能。然而，或许更为重要的是，需要明确促进β细胞生长的策略是否会以损害其功能为代价（例如某些癌基因的作用），反之亦然。
通过在分离的大鼠胰岛中系统性地抑制或过表达目的基因，可以鉴定出增加功能性β细胞质量的潜在治疗靶点4-6。腺病毒载体可用于在分离的大鼠胰岛中高效地过表达或敲低蛋白4,7-15。本文介绍了一种利用腺病毒转导调控基因表达，并在分离的大鼠胰岛中评估胰岛复制能力及β细胞功能的方法（图1）。该方法此前已被用于鉴定调控β细胞复制或功能的新型靶点5,6,8,9,16,17。
方案
1. 腺病毒转导与大鼠胰岛的培养
- 向所需数量的孔中各加入 2 ml 培养基（含 8 mM 葡萄糖、10% 胎牛血清、50 单位/ml 青霉素和 50 μg/ml 链霉素的 RPMI 1640 培养基），制备 6 孔非组织培养包被板。例如，一个典型的实验可能需要三个孔——分别用于无病毒对照、病毒对照（如表达 GFP 的腺病毒）和实验组。
- 将板置于组织培养孵箱中至少 30 分钟，使其温度升至 37 °C。
- 大鼠胰岛分离后立即进行下一步操作18,19，将 100–200 个胰岛分别放入 6 孔非组织培养包被板的各个孔中。胰岛素分泌和胸苷掺入检测需要 60 个胰岛。剩余的胰岛可用于 RNA 分离以进行基因表达研究，或用于蛋白质分离以进行免疫印迹分析。
[注意：从此处开始，请遵循机构关于生物危害性材料的处理、使用和处置的规程。]
- 轻轻晃动培养板，使胰岛移至孔的中央。
- 将腺病毒直接滴加到培养皿中央的胰岛上。使用的感染复数（MOI，即靶细胞与病毒空斑形成单位的比值）为100–500。
- 让胰岛静置5分钟。
- 将培养板放入组织培养孵箱中（37 °C，5% CO2）。
- 24小时后，轻轻晃动培养板使胰岛移至各孔中央，然后使用P200微量移液器将胰岛转移至含有新鲜培养基的新孔中。如果胰岛贴壁，可用移液器吸头轻轻吹打使其松动。
［注意：为验证转导效率是否充分，使用表达GFP的对照病毒是有益的，因为随后可通过共聚焦显微镜对胰岛成像，以确认腺病毒是否穿透至胰岛核心。］
- 根据预实验优化结果中所需的实验时间，将胰岛继续培养额外的24-72小时。例如，诱导增殖反应可能需要24-72小时，而目的基因的敲低可能需要48或72小时。每天将胰岛转移至新鲜培养基中。
- 在实验的最后24小时内，将胰岛培养于含有1 μCi [methyl-3H]-胸腺嘧啶核苷/ml培养基（通常为1 μl胸腺嘧啶核苷/ml培养基）的培养基中。
［注意：从这一点开始，请遵循机构关于放射性材料的操作、使用和处置的规程。］
2. 胰岛素分泌测定
- 配制分泌检测缓冲液（SAB）10X 储存液（1.14 M NaCl、47 mM KCl、12 mM KH2PO4、11.6 mM MgSO4）和 CaCl2 100X 储存液（0.25 M CaCl2）。这些储存液可预先配制，并在室温下保存。
- 在50 ml锥形管中新鲜配制50 ml工作浓度SAB（5 mL 10X SAB、1 mL 1 M HEPES、0.5 mL 100X CaCl2、0.28 mL 35% BSA、0.11 g NaHCO3，加无菌水至50 mL），并通过将其置于37 °C水浴中预热至37 °C。
- 将10 mL工作浓度SAB转移至15 mL锥形管中，并加入66.8 μl 2.5 M D-葡萄糖，以制备高葡萄糖（16.7 mM）SAB。
- 向剩余的40 mL工作浓度SAB中加入44.8 μl 2.5 M D-葡萄糖，以制备低葡萄糖（2.8 mM）SAB。
- 为6孔板的每孔标记三个1.7 mL微量离心管，并向每管中加入1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。
［注意：由于胰岛具有放射性，请遵循所在机构关于放射性材料的操作、使用和处置的规程。］
- 将20个胰岛放入每个微量离心管中。应尽量使每个微量离心管中的胰岛大小相近。例如，每个管中可包含5个小型、10个中型和5个大型胰岛（见图1）。
［注意：胰岛可通过解剖立体显微镜或标准显微镜进行观察。］
- 待胰岛通过重力沉降到管底（约 2 分钟）后，用移液器吸去 PBS 并弃去。
［注意：作为重力沉降的替代方法，可将试管在 300 × g 条件下离心 1 分钟。］
- 进行预孵育时，加入 400 μl 低葡萄糖 SAB，将试管（管盖打开）放入组织培养箱（37 °C，5% CO2）中，预孵育 60 分钟。吸除预孵育用的低葡萄糖 SAB 并弃去。
- 进行基础胰岛素分泌检测时，加入 400 μl 低葡萄糖 SAB，将试管（管盖打开）放入组织培养箱（37 °C，5% CO2）中，孵育 60 分钟。收集低葡萄糖 SAB 并保存，用于胰岛素放射免疫分析。
- 进行刺激性胰岛素分泌检测时，加入 400 μl 高葡萄糖 SAB，将试管（管盖打开）放入组织培养箱（37 °C，5% CO2）中，孵育 60 分钟。收集高葡萄糖 SAB 并保存，用于胰岛素放射免疫分析。
3. 胸腺嘧啶掺入实验
- 加入 1 ml PBS；待胰岛通过重力沉降到管底后，用移液器吸去 PBS，弃去，并重复此步骤一次。
- 加入 500 μl 冰冷的三氯乙酸（TCA，10% w/v），在冰上孵育 30 分钟。
- 在 4 °C 下以 16 000 × g 离心 3 分钟。
- 吸去 TCA，加入 80 μl 0.3 N NaOH，室温孵育 30 分钟。在此期间，每隔 10 分钟剧烈涡旋震荡样品 5–10 秒。
- 向 7 ml 液体闪烁计数管中加入 4 ml Econo-safe 计数混合液。
- 向闪烁计数管中加入 50 μl 样品，盖上管盖，短暂振荡，然后在液体闪烁计数器中进行计数。
- 根据制造商说明书，使用双辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度，样品用量为 10 μl。
4. 数据分析
- 按照制造商的说明书进行胰岛素放射免疫分析。
- 用蛋白质浓度对胰岛素分泌和胸腺嘧啶掺入数据进行归一化处理。
5. 代表性结果
用于评估大鼠胰岛复制和β细胞功能的实验示例如图2所示。该示例表明，通过腺病毒过表达假设的“基因#6”可显著促进胰岛复制，同时不改变β细胞功能。在上方图中，胸腺嘧啶掺入实验的结果显示，“基因#6”的表达水平升高可增加DNA合成，表现为胸腺嘧啶掺入量的上升。由于大鼠胰岛中的大多数细胞为β细胞，因此胸腺嘧啶掺入增加很可能反映了β细胞复制的增强。然而，仍需进行确证性实验以明确这一结论。在下方图中，胰岛素分泌实验的结果表明，“基因#6”的过表达并未影响β细胞的主要功能之一，即在低糖和高糖条件下的胰岛素分泌。胰岛分离的质量以及腺病毒感染处理后胰岛的健康状态可通过在低糖和高糖浓度下胰岛素分泌量的倍数变化来评估。如果“基因#6”表达的增加损害了β细胞功能，则很可能表现为在高刺激性葡萄糖浓度（16.7 mM）下胰岛素分泌减少。此外，也可进行不同葡萄糖浓度的剂量-反应曲线实验。
图 1. 通过腺病毒介导改变基因表达后，评估分离大鼠胰岛中胰岛复制及β细胞功能的实验方案概览。新鲜分离的大鼠胰岛先经腺病毒处理24小时，随后培养至96小时。在最后24小时内检测胸苷掺入，随后在低浓度和高浓度葡萄糖条件下测定胰岛素分泌水平。
图 2. 使用对照腺病毒和过表达一个假想基因（标记为“Gene #6”）的腺病毒进行实验的结果。上图显示胸腺嘧啶掺入量，下图显示胰岛素分泌水平。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
建立可被调控以促进β细胞增殖并增强其功能的通路，对1型和2型糖尿病的研究均具有重要意义。由于功能性β细胞质量依赖于胰岛素分泌细胞的存在及其功能状态，同时评估这两个因素具有明显优势。本方案描述了一种简化的实验流程，用于鉴定某种蛋白质的过表达或抑制是否会引起功能性β细胞质量的变化 体外，随后可对其进行功效测试 体内.
该方案的一个局限性在于，胰岛是由多种细胞类型组成的微器官，包括但不限于α细胞、β细胞、δ细胞、ε细胞和PP细胞。由于大鼠胰岛中80%–90%的细胞为β细胞，胰岛整体复制率的变化可能并不能完全反映β细胞复制率的变化。因此，观察到的胰岛复制变化有可能源于非β细胞的增殖。对此方案而言，一个合理且具有验证意义的后续步骤是利用胸苷类似物结合免疫荧光或流式细胞术（FACS）分析来专门检测β细胞的复制情况5,6。这种验证性分析还可缓解胸苷类似物非特异性地掺入胰岛细胞（与细胞增殖无关）所带来的潜在担忧。
另一个潜在的缺点在于腺病毒的转导效率。实现60%至70%的转导效率是合理...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 DK078732（授予 P.T.F）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 培养基 | Gibco | 11879 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140 | |
| 6 孔板 | BD-Falcon | 35-1146 | 非组织培养处理 |
| [methyl-3H]-胸苷 | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| 微量离心管 | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M 溶液 |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| D-葡萄糖 | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| 闪烁计数管 | Sarstedt | 58.536 | 7 ml，聚丙烯 |
| 闪烁计数管盖 | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe 计数液 | RPI | 111175 | |
| 胰岛素放射免疫分析试剂盒 | Siemens | TKIN2 | |
| BCA 检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23250 | |
| 仪器 | |||
| 离心机 | Eppendorf | 5415R | |
| 闪烁计数管架 | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| 液体闪烁计数器 | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR |
参考文献
- Ferrannini, E. beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).
- Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E. The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. J. Clin. Invest. 104, 787-794 (1999).
- Keenan, H. A. Residual insulin production and pancreatic ss-cell turnover after 50 years of diabetes: Joslin Medalist Study. Diabetes. 59, 2846-2853 (2010).
- Bain, J. R., Schisler, J. C., Takeuchi, K., Newgard, C. B., Becker, T. C. An adenovirus vector for efficient RNA interference-mediated suppression of target genes in insulinoma cells and pancreatic islets of langerhans. Diabetes. 53, 2190-2194 (2004).
- Fueger, P. T. Trefoil factor 3 stimulates human and rodent pancreatic islet beta-cell replication with retention of function. Mol. Endocrinol. 22, 1251-1259 (2008).
- Schisler, J. C. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol. Cell Biol. 28, 3465-3476 (2008).
- Chan, C. B. Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets. Diabetes. 48, 1482-1486 (1999).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53, 149-159 (2004).
- Icyuz, M. Adenovirus infection activates akt1 and induces cell proliferation in pancreatic islets1. Transplantation. 87, 821-824 (2009).
- Kaneto, H. Activation of the hexosamine pathway leads to deterioration of pancreatic beta-cell function through the induction of oxidative stress. J. Biol. Chem. 276, 31099-31104 (2001).
- Antinozzi, P. A., Berman, H. K., O'Doherty, R. M., Newgard, C. B. Metabolic engineering with recombinant adenoviruses. Annu. Rev. Nutr. 19, 511-544 (1999).
- Newgard, C. B., Becker, T. C., Berman, H. K., O'Doherty, R. M. Regulation of overexpressed hexokinases in liver and islet cells. Biochem. Soc. Trans. 25, 118-122 (1997).
- Becker, T. C., BeltrandelRio, H., Noel, R. J., Johnson, J. H., Newgard, C. B. Overexpression of hexokinase I in isolated islets of Langerhans via recombinant adenovirus. Enhancement of glucose metabolism and insulin secretion at basal but not stimulatory glucose levels. J. Biol. Chem. 269, 21234-21238 (1994).
- Csete, M. E. Adenoviral-mediated gene transfer to pancreatic islets does not alter islet function. Transplant Proc. 26, 756-757 (1994).
- Csete, M. E. Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors. Transplantation. 59, 263-268 (1995).
- Meng, Z. X. Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest. Diabetologia. 52, 125-135 (2009).
- Ronnebaum, S. M. A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion. J. Biol. Chem. , (2006).
- Milburn, J. L. Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids. J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).
- Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. Murine Pancreatic Islet Isolation. J. Vis. Exp. (7), e255(2007).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
