本方案可用于鉴定调控功能性β细胞质量的因素，以寻找治疗糖尿病的潜在治疗靶点。该方案包含一种简化的流程，通过腺病毒操纵基因表达后，评估分离的大鼠胰岛中胰岛的复制能力及β细胞功能。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
葡萄糖稳态主要由胰岛β细胞和α细胞分别分泌的内分泌激素胰岛素和胰高血糖素调控。功能性β细胞质量由解剖学上的β细胞质量和β细胞对营养负荷的响应能力共同决定。功能性β细胞质量的减少是1型和2型糖尿病两种主要形式的核心病理机制1-3。在1型糖尿病中，功能性β细胞质量的下降源于自身免疫攻击；而在2型糖尿病中，这种减少则由β细胞无法适当分泌胰岛素以及多种机制导致的β细胞破坏共同引起。因此，恢复功能性β细胞质量的努力对于改善糖尿病治疗乃至实现潜在治愈至关重要。
目前，研究人员正在努力识别可用于促进β细胞增殖并增强其功能的分子通路。理想情况下，治疗靶点应能同时改善β细胞的生长和功能。然而，或许更为重要的是，需要明确促进β细胞生长的策略是否会以损害其功能为代价（例如某些癌基因的作用），反之亦然。
通过在分离的大鼠胰岛中系统性地抑制或过表达目的基因，可以鉴定出增加功能性β细胞质量的潜在治疗靶点4-6。腺病毒载体可用于在分离的大鼠胰岛中高效地过表达或敲低蛋白4,7-15。本文介绍了一种利用腺病毒转导调控基因表达，并在分离的大鼠胰岛中评估胰岛复制能力及β细胞功能的方法（图1）。该方法此前已被用于鉴定调控β细胞复制或功能的新型靶点5,6,8,9,16,17。
方案
1. 腺病毒转导与大鼠胰岛的培养
- 向所需数量的孔中各加入 2 ml 培养基（含 8 mM 葡萄糖、10% 胎牛血清、50 单位/ml 青霉素和 50 μg/ml 链霉素的 RPMI 1640 培养基），制备 6 孔非组织培养包被板。例如，一个典型的实验可能需要三个孔——分别用于无病毒对照、病毒对照（如表达 GFP 的腺病毒）和实验组。
- 将板置于组织培养孵箱中至少 30 分钟，使其温度升至 37 °C。
- 大鼠胰岛分离后立即进行下一步操作18,19，将 100–200 个胰岛分别放入 6 孔非组织培养包被板的各个孔中。胰岛素分泌和胸苷掺入检测需要 60 个胰岛。剩余的胰岛可用于 RNA 分离以进行基因表达研究，或用于蛋白质分离以进行免疫印迹分析。
[注意：从此处开始，请遵循机构关于生物危害性材料的处理、使用和处置的规程。]
- 轻轻晃动培养板，使胰岛移至孔的中央。
- 将腺病毒直接滴加到培养皿中央的胰岛上。使用的感染复数（MOI，即靶细胞与病毒空斑形成单位的比值）为100–500。
- 让胰岛静置5分钟。
- 将培养板放入组织培养孵箱中（37 °C，5% CO2）。 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
建立可被调控以促进β细胞增殖并增强其功能的通路，对1型和2型糖尿病的研究均具有重要意义。由于功能性β细胞质量依赖于胰岛素分泌细胞的存在及其功能状态，同时评估这两个因素具有明显优势。本方案描述了一种简化的实验流程，用于鉴定某种蛋白质的过表达或抑制是否会引起功能性β细胞质量的变化 体外，随后可对其进行功效测试 体内.
该方案的一个局限性在于，胰岛是由多种细胞类型组成的微器官，包括但不限于α细胞、β细胞、δ细胞、ε细胞和PP细胞。由于大鼠胰岛中80%–90%的细胞为β细胞，胰岛整体复制率的变化可能并不能完全反映β细胞复制率的变化。因此，观察到的胰岛复制变化有可能源于非β细胞的增殖。对此方案而言，一个合理且具有验证意义的后续步骤是利用胸苷类似物结合免疫荧光或流式细胞术（FACS）分析来专门检测β细胞的复制情况5,6。这种验证性分析还可缓解胸苷类似物非特异性地掺入胰岛细胞（与细胞增殖无关）所带来的潜在担忧。
另一个潜在的缺点在于腺病毒的转导效率。实现60%至70%的转导效率是合理.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 DK078732（授予 P.T.F）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 培养基 | Gibco | 11879 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140 | |
| 6 孔板 | BD-Falcon | 35-1146 | 非组织培养处理 |
| [methyl-3H]-胸苷 | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| 微量离心管 | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M 溶液 |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| D-葡萄糖 | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| 闪烁计数管 | Sarstedt | 58.536 | 7 ml，聚丙烯 |
| 闪烁计数管盖 | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe 计数液 | RPI | 111175 | |
| 胰岛素放射免疫分析试剂盒 | Siemens | TKIN2 | |
| BCA 检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23250 | |
| 仪器 | |||
| 离心机 | Eppendorf | 5415R | |
| 闪烁计数管架 | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| 液体闪烁计数器 | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR |
参考文献
- Ferrannini, E. beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).
- Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
