创建特定的气体环境以研究低氧对 C. elegans 的影响

摘要

本文详细介绍了如何使用连续流式缺氧室来生成具有特定氧气浓度的环境₂ 以理解生物体对氧气浓度降低的响应₂该系统易于安装和维护，且具有足够的灵活性，可适应多种O₂ 浓度与模型系统

摘要

氧气对所有后生动物的生存至关重要，已知仅有一种例外情况¹. 氧气减少₂ 缺氧状态可能在疾病、正常发育或环境条件变化过程中出现^2-5理解细胞在缺氧反应中所涉及的信号通路，可为从中风到癌症等多种人类疾病的治疗策略提供新的见解。这一目标在一定程度上受到技术难题的阻碍，这些难题与在遗传操作便利的模式生物中实现可控缺氧暴露相关。

线虫 秀丽隐杆线虫 非常适合作为研究缺氧反应的模式生物，因其易于培养且可进行遗传操作。此外，还可用于研究细胞对特定缺氧氧浓度的响应₂ 浓度不会产生混杂效应，因为 秀丽隐杆线虫 获得 O₂ （及其他气体）通过扩散作用进行交换，而非通过协助性呼吸系统⁶已知参与缺氧反应的因子在进化上是保守的 秀丽隐杆线虫实际的缺氧反应取决于 O₂ 的特定浓度₂ 可获得的。在 秀丽隐杆线虫，暴露于中等程度缺氧会引发主要由 hif-1，高度保守的缺氧诱导型转录因子^6-9. C. elegans 胚胎需要 hif-1 在 5,000–20,000 ppm O₂ 条件下存活₂^7,10缺氧是“低于正常氧气水平”的通用术语₂. 常氧（正常 O₂）也难以界定。我们通常将含210,000 ppm O₂的室内空气视为标准₂ 为常氧状态。然而，已有研究表明 秀丽隐杆线虫 对 O 具有行为偏好₂ 浓度为 5-12%（50,000-120,000 ppm O）₂)¹¹在幼虫和成虫中， hif-1 可防止在 5,000 ppm O₂ 条件下由缺氧诱导的滞育₂¹²。然而， hif-1 在对较低浓度 O 的反应中不起作用₂ （缺氧，操作性定义） <10 ppm O₂)¹³在缺氧条件下， 秀丽隐杆线虫 进入一种可逆的休眠状态，其中所有显微镜下可观测的生命活动均停止¹⁰不同条件下会产生不同的生理反应，这一事实凸显了在实验中精确控制氧气低浓度水平的重要性。₂.

本文介绍一种用于构建和实施环境舱的方法，该环境舱可产生浓度定义明确、可靠且可重复的低氧条件₂持续流动法可确保腔室快速达到平衡，并提高系统的稳定性。此外，腔室的透明性和可及性使得能够直接观察暴露于低氧环境中的动物。我们进一步展示了一种有效的收获方法 秀丽隐杆线虫 缺氧暴露后迅速采集样本，这对于观察缺氧条件下发生的诸多快速可逆性变化至关重要^10,14该方法提供了一个基本框架，可根据不同实验室的需求进行简便修改，包括适用于不同的模型系统和多种气体。

方案

1. 环境室的构建

1. 根据实验项目的规模，选择所需最小且合理的腔室体积。腔室必须由对气体（O₂）不渗透的材料制成。可使用派热克斯（Pyrex）结晶皿、厌氧袋（Anaeropack）盒或大型浇铸丙烯酸盒（Ellard Instrumentation）。我们发现，一个100 × 50 mm的Kimex结晶皿可容纳9个50 mm的培养皿。玻璃板可用作Pyrex结晶皿的盖子。
2. 在选定的腔室上钻孔，并安装塑料公鲁尔接头转软管接头（Cole Parmer）。可通过管件接头或环氧树脂固定接头。在容器的另一侧安装类似的接头，以允许气体流入和流出腔室。如有可能，将孔位错开，以增强湍流混合效果。
3. 准备含有已知O₂浓度（以N₂为平衡气体）的压缩气瓶，其O₂含量需经认证为标准浓度；对于无氧条件，则使用纯N₂（<10 ppm O₂）。在长期实验中，建议使用自动切换调压阀，以避免干扰腔室内的氧浓度。
4. 已有研究表明，生物体对低氧的反应具有温度依赖性¹⁵。通过将腔室置于培养箱中，可维持不同的温度条件。培养箱内的温度可能分布不均，因此建议使用温度数据记录仪持续监测腔室内部的温度。

2. 将气体连接至环境培养箱

1. 所有连接均使用外径为八分之一英寸的管路，并通过快接接头或压紧式接头连接。管路应不透氧且不与 O₂ 发生反应，例如氟化乙烯丙烯共聚物（FEP）或尼龙（Cole Parmer）。有关完整装置的示意图，请参见图1。
2. 将压缩气体钢瓶连接至流量控制装置，例如质量流量控制器（Sierra Instruments）或转子流量计（Aalborg）。确保钢瓶的上游压力在流量控制装置和软管接头的适用范围内。通常使用两级减压阀，第二级调节至所需压力[选择合适流速的方法见第三部分]。
3. 通过气体洗涤瓶中的烧结圆筒将气体鼓泡通入蒸馏水中以实现气体加湿，然后导入环境室的一个接口，另一个接口保持开放以用于排气（见图1）。对于短期实验，气体加湿可防止培养板干燥；但对于长期实验，可能需要监测湿度。
4. 可使用道康宁真空润滑脂密封环境室。在室盖上放置配重，以确保气密性。为确认密封严密且气流充足，可将少量水置于戴着手套的手掌中，覆盖在环境室的出气接口处，观察是否有气泡产生。

3. 选择流速

1. 假设混合完全，每次更换腔室体积时，气态环境中的气体交换率为90%（菲克定律）。例如，在一个100 cc的腔室中，以100 cc/min的流速通入气体，1分钟后腔室内原始空气将被替换为90%的目标气体，此后每分钟趋近于完全交换的90%，并逐渐接近完全置换。
2. 更高的流速和更小的容器可更快达到目标氧浓度。对于100 x 50 Kimex容器（400 cc），以120 cc/min的流速通气，可在10分钟内实现99.9%的气体交换（3次置换）。该流速适用于大多数氧气条件。据我们所知，目前尚无系统研究探讨O₂浓度变化速率对C. elegans反应的影响。

4. 活性检测样品的制备

1. 在低氧条件下，线虫通常会逃离琼脂平板表面。为防止此现象，可在平板边缘周围放置一圈棕榈酸（10 mg/ml 溶于乙醇）。随着乙醇挥发，棕榈酸将析出，形成物理屏障。棕榈酸屏障不会影响秀丽隐杆线虫（C. elegans）的产卵速率、繁殖力或寿命¹⁶。在低氧条件下，钻入行为并不更频繁，因此通常无需额外预防措施。
2. 1. 通过在未接种的线虫生长培养基（NGM）平板表面用少量碱性次氯酸盐溶液处理怀卵成虫，获得同步化群体¹⁷。与标准的大批量次氯酸盐漂白法不同，将1-100只线虫置于NGM平板表面的一滴漂白液中，随后让漂白液被平板吸收¹⁷。至少12小时后，将同步化的L1幼虫转移至接种了活OP50细菌的平板上。或者，也可让怀卵成虫在平板上产卵2-3小时，以获得同步发育的线虫群体，或从混合群体中挑选L4期幼虫。
   2. 应避免将漂白后的胚胎暴露于低氧环境，因为这可能降低其存活率¹³。为收集早期胚胎（2-4细胞期），可用刀片在少量水中切碎怀卵成虫，再用口吸管将胚胎转移至平板，随后进行低氧处理。
3. 将平板密封于环境舱内。对照组动物应与处理组线虫在相同温度下置于常氧（室内空气）环境中。置于室内空气中的样品与在相同舱内持续通入室内空气的样品之间无明显差异。启动气体流动，并维持所需暴露时间。为确保气体浓度上升过程的一致性，暴露前务必更换气体洗涤瓶中的水。
4. 为检测胚胎存活率，将线虫在恢复常氧环境后继续培养48小时，此时应发育至四龄幼虫/成虫第一天阶段。记录存活情况，并对无法追踪的个体进行删失处理。
5. 为观察经低氧处理的线虫，将线虫转移至22 mm²盖玻片上的M9液滴中，然后倒置覆盖于含2%琼脂糖的M9缓冲液垫上¹⁷。必要时可使用左旋咪唑（25 mM）或叠氮化钠（10 mM）作为麻醉剂。由于叠氮化钠和左旋咪唑可能具有毒性，可能干扰某些观察结果，应谨慎使用¹⁸。

5. 快速收获暴露于低氧环境的线虫（示例：HIF-1 Western 分析样品制备）

许多由缺氧诱导的效应在恢复至常氧环境后会迅速逆转，包括恢复产卵¹²、胚胎发生过程中有丝分裂表位的磷酸化¹³以及HIF-1蛋白的降解^9,19。为了在这些条件下获得可重复的实验结果，必须快速收集暴露于缺氧环境的动物。使用该装置可在两分钟内完成动物的采集并将其置于液氮中冷冻。尽管手套箱式缺氧舱允许在无氧条件下操作样品，但其成本较高，且在除无氧以外的其他条件下实用性有限，从而限制了其应用。

1. 将Bristol N2线虫在4个10 cm高生长（HG）培养基平板上培养，直至大多数线虫发育为产卵成虫¹⁷。用1:5碱性次氯酸钠溶液将线虫洗入15 mL锥形管中，并在旋转条件下孵育，直至线虫开始溶解，时间不超过5分钟⁹。用M9缓冲液洗涤线虫三次，每次洗涤后在1500 × g离心，无刹车。
2. 将漂白后的胚胎接种至8个150 mm NGM平板上，使其发育至L4幼虫阶段（Bristol N2在22 °C下约需48小时）。将平板转移至环境培养箱中，分别暴露于低氧（1,000 ppm、5,000 ppm）和无氧（N2）条件下4小时。暴露时间可根据实验设计调整。虽然低氧暴露会立即影响产卵速率，但两细胞胚胎在暴露16–18小时后会死亡¹²。在此低氧培养箱设置下，暴露时间的下限受限于达到气体平衡所需的大气交换速率。
3. 为每个实验样本标记一个1.5 mL微量离心管和一个15 mL锥形管。暴露于低氧条件的线虫在收集过程中更容易粘附在管壁上。为防止此现象，可在每个15 mL锥形管中加入100 μL 1%十二烷基硫酸钠（SDS）。若SDS对后续实验应用有抑制作用，可使用牛血清白蛋白（BSA）防止粘附。常规使用SDS或BSA似乎无明显差异。向1.5 mL微量离心管中加入50 μL 2×蛋白上样缓冲液（含4% SDS、10% 2-巯基乙醇和微量溴酚蓝的30%（w/v）甘油溶液）。准备好液氮杜瓦瓶。
4. 从低氧环境中取出线虫后的操作步骤需计时并记录。打开低氧培养箱盖，取出一个样本平板后立即重新密封培养箱。用蒸馏水将线虫冲洗至尼龙滤膜上，再转移至15 mL锥形管中。在台式离心机中以1500 × g离心15–20秒，开启刹车。
5. 使用真空装置吸除管中大部分上清液，保持线虫沉淀不受扰动。
6. 用移液器将线虫沉淀连同约50 μL液体转移至1.5 mL微量离心管中。密封管子并立即浸入液氮中。
7. 重复上述步骤，直至所有样本均被分离。为保证一致性，需对常氧空气对照样本执行相同操作流程。样本可保存于-20 °C。

6. 代表性结果

通过检测个体发育至成体的存活率，可观察缺氧对生物体的影响 秀丽隐杆线虫 (图2）。由野生型布里斯托尔（N2）和 hif-1(ia04) 所有缺失突变体均能在室内空气中存活₂ 浓度（210,000 ppm O₂）。N₂ 线虫能够在5,000 ppm氧气环境中适应并存活至成年期₂，而 hif-1 胚胎无法存活。这表明HIF-1对于适应环境中氧气水平的变化至关重要。¹⁰。无论N2还是 hif-1 动物可耐受1,000 ppm O₂.

使用解剖显微镜和透明容器，可直接在低氧条件下观察线虫（图3）。将低氧培养室直接放置在解剖显微镜上，无需将线虫移出低氧环境即可观察其整体反应。显微镜可配备荧光照明装置（如图3所示），进一步拓展在低氧条件下可进行的观察类型。

图1. 缺氧箱示例。 气体流动方向由箭头指示。气体储存在含有特定O₂浓度的压缩气瓶（1）中，并连接有两级减压阀（2）。气体从流路管底部进入（3），从顶部以正确流速流出。随后气体进入鼓泡瓶（4），使气体湿润（通过观察气泡确保鼓泡瓶连接正确）。湿润后的气体经进气阀进入缺氧箱（5），使样品暴露于低氧环境。最后，气体通过在箱体上钻出的排气孔排入室内。

图 2. 胚胎在 1,000 ppm O₂、5,000 ppm O₂ 及常氧（~210,000 ppm O₂）条件下的存活率。胚胎在持续气流式氧浓度培养室中，分别暴露于各氧浓度条件下培养 24 小时。 随后将线虫转移至常氧条件，继续发育 48 小时至成虫期，并记录其发育至成虫的存活率。n>50，N=5。

图 3. 显微镜下观察缺氧条件下的 C. elegans。 线虫通过上述方法暴露于缺氧环境中。透明的环境培养室（由派热克斯结晶皿和玻璃片构成）直接放置在解剖显微镜的载物台上。图中展示了两种视图：一种包含完整的气体流动装置，另一种仅显示置于显微镜载物台上的培养室。

讨论

该方法提供了一种构建低氧环境的策略，可在实验室中维持精确控制氧气浓度的环境。这些培养舱为将生物体暴露于特定低浓度氧气条件下提供了一种简便的方法。₂ 并监测分子和生理层面的输出结果。所述环境舱由实验室自行组装，而非商业购买，因此可根据实验需求进行调整和修改。

该方法的一个显著优势在于其连续流动设计。这消除了通常在维持低浓度O₂ 在腔室中，当外部 O₂ 浓度要高得多（210,000 ppm O₂ 在室温空气条件下）。另一种方法是停流法，即在密闭腔室中维持低氧环境。即使存在微小泄漏（可能难以检测），也会导致无法通过停流法维持低氧条件。连续气流法通过压缩空气罐中设定氧浓度的气体持续置换腔室内的空气，并维持正压状态，从而防止泄漏干扰低氧环境的稳定。

从气体供应商处获取精确的预混氧气浓度可解决缺氧研究中的另一个难题。测量极低浓度的O₂非常困难。大多数O₂传感器受限于扩散作用，且价格昂贵。由于O₂

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
管路（FEP 和 PTFE）	Cole Parmer Tygon	YO-95821-00 (1/8" FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8" PTFE)’ R-3603
压缩接头	Seattle Fluid Systems	06363-58 (M. coupler 1/16") 06363-62 (F. coupler 1/16") 06363-60 (M. coupler 1/8") 06363-61 (F. coupler 1/8")
流量管	Aalborg	PMR3-010073 (3 输出) PMR1-013520 (1 输出)
质量流量控制器	Sierra Instruments	810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2)
压缩气体钢瓶	AirGas	定制
塑料公鲁尔接头转软管接头	Cole Parmer	45505-41 (500 系列 1/16")
铸塑丙烯酸盒	Ellard Instrumentation	定制
管件（黄铜或不锈钢）	Seattle Fluid Systems	B-402-1 (1/4" 螺母) B-200-3 (1/8" 三通接头) B-400-set (1/4" 卡套) B-QM2-B1-200 (QM 本体 QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8" 公接头)
道康宁真空润滑脂	Sigma-Aldrich	Z273554
厌氧袋盒（AnaeroPack box）	Misubishi Gas Chemical Company	R684004 (0.4 升) R685025 (2.5 升) R685070 (7.0 升)
Pyrex 气体洗涤瓶	Sigma-Aldrich	CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL)
棕榈酸	Sigma-Aldrich	P0500
山羊抗小鼠 IgG-辣根过氧化物酶	Southern Biotechnology Associates	1032-05
SuperSignal West Pico 化学发光底物	Pierce Chemical	34077
100 x 50 玻璃结晶皿	Kimax Kimble	23000