我们开发了一种视频速率追踪显微镜系统，能够以高分辨率和高速度记录并量化秀丽隐杆线虫（C. elegans）的行为。同时，我们还开发了计算方法，将线虫图像的维度降低为一组基本测量参数，这些参数可完整描述线虫的形态。
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本文内容
摘要
摘要
我们开发了仪器设备、图像处理和数据分析技术，用于量化 C. elegans 在琼脂平板表面爬行时的运动行为。由于 C. elegans 遗传操作简便、适用于显微观察，并表现出多种复杂行为（如趋向性、学习和社会互动1,2），因此是研究行为的遗传、生化和神经基础的理想模式生物。基于追踪线虫在琼脂平板上爬行运动的行为分析，在感觉行为3、运动机制4以及一般突变表型分析5的研究中尤为有用。我们的系统通过在固定不动的琼脂平板上移动相机和照明系统来实现追踪，从而确保不会对线虫施加任何机械刺激。我们的追踪系统操作简便，并包含半自动校准功能。所有视频追踪系统面临的一个挑战是会产生大量本质上高维度的数据。我们的图像处理和数据分析程序通过将线虫的形态简化为一组独立成分来应对这一挑战，从而仅用3-4个维度即可全面重构线虫的行为6,7。作为该流程的一个示例，我们展示了线虫以特定相位的方式进入和退出其反向运动状态。
方案
1. 跟踪显微镜的描述
- 使用光纤光源照射琼脂平板，并用相机进行成像。该系统安装在X,Y平移台上。
- 平移台由标准的步进电机驱动，步进电机连接至步进电机控制器。
- 控制器和相机连接到计算机，并由使用LabVIEW编写的自定义程序进行控制。
- 相机对琼脂平板表面进行成像，并识别亮背景上的暗色物体。
- 调整图像质量，使计算机程序能够实时量化物体。可调节相机的增益、亮度和快门速度，以在白色背景上获得清晰的暗色物体图像。
- 通过使用线虫挑取工具戳刺琼脂表面，制作自动校准过程的校准标记。
- 可检查跟踪程序所使用的经过滤波处理的二值图像。
- 软件具有自动校准功能，通过移动测试物体一段固定距离来计算校准矩阵。
- 校准矩阵将像素距离与步进电机的步数进行对应校准。
- 校准完成后，系统即可投入使用，除非放大倍数发生改变或相机位置被重新调整，否则无需重新校准。
2. 准备追踪培养皿和用于追踪的 C. elegans
- 使用铜环围住线虫，防止其迁移到培养皿边缘。铜环提供局部化学屏障，在整个实验期间（<1 小时）不会影响线虫的正常运动。使用前可先将铜环置于加热块或等效设备上加热。
- 将铜环放置于新鲜的琼脂平板上（1.7% Bacto 琼脂，0.25% Bacto-蛋白胨，0.3% NaCl，1 mM CaCl2，1 mM MgSO4，25 mM 磷酸钾缓冲液，5 μg/ml 胆固醇），并轻轻按压，使其嵌入琼脂表面。
- 挑取 L4 期或年轻成虫期线虫，转移至含有少量 NGM 缓冲液（0.3% NaCl，1 mM CaCl2，1 mM MgSO4，25 mM 磷酸钾缓冲液）的琼脂平板上，以洗去食物残留。让线虫游动数分钟。
- 小心地将单个线虫放置于追踪平板中铜环中心附近，然后将平板置于线虫行为追踪仪上。
3. 线虫追踪
- 运行 LabVIEW 程序，并根据需要选择选项（图像存储位置、图像类型、测量参数、相机设置）。
- 使用操纵杆移动显微镜，直到在视野（计算机屏幕）中看到线虫的图像。按下“track”以启动追踪程序。
- 该计算机程序实际上对经过二值化滤波处理的图像进行运动测量，如图所示，并能对该图像进行实时测量。
- 追踪完成后，可根据步进电机的运动重建整体轨迹，同时可详细观察线虫的局部形态变化。
4. 数据分析
- 运行骨架化脚本（MATLAB）以参数化线虫的形态。（图 2）
- 计算骨架化数据的特征模式。（图 3,4）
- 显示 图 5。阅读图注或代表性结果。
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结果
示例：在觅食过程中，C. elegans 会从前进运动转为后退运动，通常在恢复前进运动前会执行一次重新定向（欧米伽转弯）。量化这一转变对于理解线虫的觅食运动模式及其运动控制机制具有重要意义。使用我们的追踪装置能够揭示运动行为的细微细节。
以自由在琼脂平板上爬行约30分钟的线虫为研究对象，通过采集其高分辨率图像，观察其从前进到后退以及从后退到前进的运动转换过程。利用本征模式分析（图3），我们可以测量线虫波动运动的相位。相位测量结果进一步使我们能够计算线虫的运动速度以及从前进到后退的转换过程（图4）。通过绘制线虫速度与相位的联合概率分布图，可以看出前进与后退之间的转换是以特定偏好相位的概率方式发生的（图5a）。若将从前进到后退与从后退到前进的转换过程分别分析，并考察线虫进入和退出后退行为时相位的条件概率，我们发现这两类转换具有明显不同的相位分布特征（图5b,c）。
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讨论
研究运动和自然行为需要非侵入性的追踪技术，并结合数据降维方法。本文展示了一种易于使用的追踪系统，可记录秀丽隐杆线虫（C. elegans）在琼脂平板表面爬行时的详细行为图像。这些图像包含的信息量巨大且具有高维度，因此我们还开发了将数据降维至仅四个基本指标的方法。这些指标全面且易于解释，能够清晰反映线虫的行为特征。在本研究中，我们发现线虫在其波动周期的不同相位点更倾向于发生前进与后退状态之间的转换，这一测量结果难以通过肉眼观察实现。本工作与已有的低倍率下测量线虫行为的追踪系统8,9,10相辅相成，同时也与利用基因编码试剂来测量或调控神经元活动的系统互为补充11,12。
尽管单个生物体追踪是量化行为的有力方法，但该技术也存在一些局限性。首先是系统一次只能追踪单个生物体。与能够同时追踪多个生物体的固定摄像头追踪系统相比9,10，本追踪系统的通量较低。然而，我们能够对单个生物体的行为进行远比多虫追踪系统更长时间的观测，这对于量化饥饿、产卵和觅食等长时间尺度的行为尤为重要。此外，该追踪系统需要能够清晰将线虫与...
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CCD 相机 | Basler | A601f | |
| 镜头 | Edmund Optics | MMS 系列 | |
| 光纤照明 | Dolan Jenner | DC-950H | |
| 平移台 | Deltron | LS3-4 | |
| 步进电机 | US digital | MS23C | |
| 步进电机驱动器 | Gecko | G201 | |
| 步进电机控制器 | SimpleStep | SSXYZ | |
| 所有程序代码均可获取。请向通讯作者发送请求邮件。 |
参考文献
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