结合单分散液滴生成与细胞及颗粒的惯性有序排列，我们描述了一种在千赫兹速率下单个液滴内封装特定数量细胞或颗粒的方法。对于单颗粒和双颗粒液滴，该方法的封装效率是无序封装的两倍以上。
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摘要
摘要
微流控封装技术先前已被用于在皮升级水相、单分散液滴中捕获细胞，使细胞与主体流体环境隔离，应用于高通量筛选、细胞计数和质谱分析。本文描述了一种不仅能够封装单个细胞，而且能够重复捕获特定数量细胞（本文展示了单细胞和双细胞封装）的方法，以研究细胞的分离状态以及在大小可控的细胞群体中的相互作用。通过结合液滴生成技术与细胞及微粒的有序排列，我们实现了对细胞尺寸微粒的可控封装，从而实现高效、连续的封装过程。利用水相微粒悬浮液与不相溶的氟化碳油，我们通过聚焦流喷嘴在油相中生成水相液滴。水相流速足够高，可使微粒在到达喷嘴时以液滴生成频率的整数倍频率有序排列，从而在每个液滴中封装可控数量的细胞。为展示代表性结果，采用9.9 μm的聚苯乙烯微粒作为细胞替代物。本研究显示，单微粒封装效率Pk=1达到83.7%，双微粒封装效率Pk=2达到79.5%，相较于相应的泊松分布效率（分别为39.3%和33.3%）显著提高。实验表明，稳定的细胞和微粒浓度对实现高效封装具有重要意义，同时本文也探讨了滴落模式向射流模式转变的影响。
引言
连续相水性培养基中的细胞悬浮液共享相同的流体环境，使细胞能够并行相互作用，同时在培养基的检测中均一化单个细胞的影响。将细胞高通量封装至皮升级液滴中，可将样品限定在独立单元内，防止交叉污染，实现对样品内细胞多样性的检测，避免试剂及表达的生物标志物被稀释，并放大生物反应产物的信号。液滴还具备重新融合的能力，可将液滴合并为更大的水相样品或与其他液滴融合，用于细胞间信号传导研究1,2。稀释程度的降低意味着检测信号更强，测量精度更高，同时也可减少昂贵的样品和试剂用量3。细胞在液滴中的封装已被用于提升蛋白质表达4、抗体5,6、酶7以及代谢活性8的检测，适用于高通量筛选，并有望用于改进高通量流式细胞分析9。其他研究还展示了含细胞液滴在质谱分析中的生物电喷雾10以及靶向表面细胞涂层方面的应用11。然而，部分应用受限于无法精确控制封装进液滴的细胞数量。本文介绍一种有序封装方法12，该方法提高了单细胞和双细胞封装效率，并可外推用于封装更多数量的细胞。
为了实现单分散液滴的生成，微流控“流动聚焦”技术可通过使用两种流体汇聚的喷嘴，在一种流体（连续油相）中生成另一种流体（水相细胞混合液）的尺寸可控的单分散液滴。13 在给定喷嘴几何结构的情况下，通过调节油相和水相的流速 Qoil 和 Qaq，可改变液滴生成频率 f 和液滴尺寸。随着流速增加，流动状态可能从液滴生成转变为水相液体从喷嘴处不稳定喷射。14
当水溶液中含有悬浮颗粒时，颗粒会在喷嘴处被包裹并相互隔离。使用随机分布的水相细胞悬液生成液滴时，含有 k 个细胞的液滴平均比例 Dk 由泊松统计决定，即 Dk = λk exp(-λ)/(k!)，其中 λ 表示每个液滴的平均细胞数。最终进入“正确”包裹液滴中的细胞比例通过 Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk') 计算得出。这两个指标之间的细微差别在于：Dk 反映了水相液体的利用效率以及包裹后所需完成的液滴分选工作量，而 Pk 则反映细胞样品的利用效率。例如，可以使用稀释的细胞悬液（低 λ）进行包裹，使大多数含细胞的液滴仅包含一个细胞。此时，效率指标 Pk 会较高，但大多数液滴为空（Dk 较低），因此需要分选机制去除空液滴，从而降低通量。15
将液滴生成与惯性排序相结合，能够实现比随机包封更可预测的每液滴细胞数量以及更高的通量。惯性聚焦最初由 Segre 和 Silberberg16 发现，指的是有限尺寸颗粒在通道流动中迁移到侧向平衡位置的趋势。惯性排序则指颗粒和细胞被动地排列成等间距、交错且恒速的序列。聚焦和排序均需要足够高的流速（高雷诺数）和颗粒尺寸（高颗粒雷诺数）17,18。此处，雷诺数 Re =uDh/ν，颗粒雷诺数 Rep =Re(a/Dh)2，其中 u 为特征流速，Dh [=2wh/(w+h)] 为水力直径，ν 为运动粘度，a 为颗粒直径，w 为通道宽度，h 为通道高度。经验表明，实现完全有序序列所需的长度随 Re 和 Rep 的增加而减小。需要注意的是，较高的 Re 和 Rep 要求（本研究中分别约为 5 和 0.5）可能与需要保持较低水相流速以避免液滴生成喷嘴处出现射流的现象相冲突。此外，高流速会导致细胞承受更高的剪切应力，但本方案未涉及此问题。先前的有序包封研究表明，在与本研究相似的流动条件下，超过 90% 的单细胞包封 HL60 细胞保持了细胞膜完整性12。然而，在推广至不同类型细胞和流动参数时，必须仔细考虑剪切应力的大小和时间尺度的影响。细胞有序化、液滴生成以及细胞活性对水相流速的限制条件之间的重叠区域，为单细胞和多细胞的可控包封提供了理想的运行区间。
由于极少有研究涉及颗粒间列的间距19,20，因此确定该间距最简便的方法是通过实验确定，且其值取决于通道几何形状、流速、颗粒尺寸和颗粒浓度。尽管如此，列之间相等的横向间距意味着细胞将以可预测且一致的时间间隔到达。当液滴生成速率与有序排列的细胞到达喷嘴的速率相同时，细胞便能以受控方式被封装进液滴中。该技术已被用于单细胞封装，通量可达约15 kHz12，相较于此前报道的60–160 Hz封装速率的研究有显著提升4,15。在受控封装实验中，超过80%的液滴包含且仅包含一个细胞，相较于泊松（随机）统计所预测的平均不足40%的效率，显著提高了封装效率12。
在以往的受控封装研究中12，通过调节每个液滴中的平均颗粒数 λ，以实现单细胞封装。我们假设，通过调节流速，当 λ 等于或接近每个液滴所需细胞数量时，可高效地实现任意数量细胞的封装。虽然单细胞封装在确定细胞对刺激的个体反应方面具有重要价值，但多细胞封装则可提供有关受控数量和类型细胞之间相互作用的信息。本文介绍了一种利用被动惯性排列通道与液滴生成喷嘴实现多细胞受控封装的实验方案、以聚苯乙烯微球为例的代表性结果以及相关讨论。
方案
本节中的实验方案描述了为获得所展示实验结果而专门使用的材料和设备。请注意，化学品和设备可使用其他供应商的产品。
1. 装置制备与软光刻技术
采用标准的软光刻技术21，其中一些技术已在先前的 JOVE 文章中介绍过22，用于制备键合在玻璃基底上的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道网络。除通过 SU-8 光刻制备母模复制品外，其余步骤可在无洁净室或洁净罩的环境中进行；然而，仍应尽量减少灰尘和颗粒物，以获得稳定一致的实验结果。
- 使用 AutoCAD (AutoDesk Inc.) 设计如图1所示的微通道图案。委托第三方制造商（Fineline Imaging Inc.）在聚酯薄膜（Mylar）或石英基底上制作高分辨率（50,000 dpi）透明掩膜，其中通道区域为透明，背景为深色。
- 制备硅片和 SU-8 光刻胶母模用于复制成型。简要步骤如下：将 SU-8 2050（MicroChem）负性光刻胶按照制造商推荐的转速在匀胶机上旋涂于洁净的 7.5 cm 或 10 cm 硅片表面，形成厚度为 52 μm 的薄膜。依次经过前烘、去边、通过接触式掩膜进行紫外曝光、曝光后烘烤、显影及泛光曝光后，使用 Dektak 台阶仪（Veeco）测量 SU-8 层的实际厚度。将制备好的母模用胶带固定于 4 英寸或 5 英寸培养皿底部，准备进行 PDMS 复制成型。
- 按质量比 10:1 将 PDMS 弹性体基质与固化剂（Dow Corning）混合均匀。将充分混合的 PDMS 预聚物浇注到硅母模上，形成最终厚度为 2–3 mm 的层。20 g 弹性体基质与 2 g 固化剂的混合物足以覆盖直径为 4 英寸的表面。
- 将母模与 PDMS 置于真空干燥器（Jencons）中脱气。使用压力调节器（Cole Parmer），在 20 分钟内将腔体表压从 0" Hg 缓慢降至 -27" Hg，以避免产生过多泡沫。将装置在 -27" Hg 的真空条件下保持 30 分钟，或直至气泡完全消失。
- 释放真空，将母模与 PDMS 转移至 65 °C 的烘箱（Thermo Scientific）中，至少固化 4 小时。可将装置在烘箱中过夜以提高固化效果。
- 从烘箱中取出装置并冷却。使用精密刀具沿圆形硅片边缘小心切割并剥离 PDMS。用手术刀按照图1所示轮廓裁切出器件外形。
- 使用穿刺活检打孔器在图1所示的三个圆形区域打孔，作为流体通道接口（每个器件打三个孔）。本装置使用外径为 0.75 mm 的打孔器（Harris）。
- 将透明胶带贴附于 PDMS 图案面并剥离，以去除表面灰尘。作为一种成本较低但可行的替代传统氧等离子体设备的方法21,22，使用手持式实验室电晕处理仪（Electro-Technic Products Inc.）对 PDMS 图案面和一块洁净的 3" × 1" 玻璃载玻片进行等离子体处理23。注意：由于会产生臭氧，该设备应在通风橱或通风良好的区域使用，且所有手表和手机应远离至少十英尺。调节电晕放电强度，使电晕稳定且火花最小。将电极在每种材料表面约 1/4 英寸上方缓慢移动约 20 秒，随后立即贴合处理后的表面，以在 PDMS 表面恢复至原始状态前形成牢固的永久键合。
- 将器件置于金属板上，放入低温烘箱，设定温度为 120 °C，烘烤过夜以完成键合，并使 PDMS 恢复原始的疏水状态24。在此高温烘烤过程中，由于疏水性薄层沉积在玻璃表面，通道内的玻璃也将变为疏水性。或者，可使用 1 mL 注射器和针头将疏水涂层试剂（如 Aquapel，PPG Industries）注入流体接口12。小心而有力地注入 Aquapel 后，用空气吹扫流体接口，注意不要破坏 PDMS 与玻璃之间的键合。在所有进样口和出样口处反复强力吹扫空气，同时擦去多余的 Aquapel，以避免干燥后形成可能堵塞通道的沉积物。
2. 样品制备
- 根据所选细胞类型的既定操作程序制备细胞培养物。对于本研究中使用的特定装置，尺寸为 8–15 μm 的颗粒或细胞应能充分实现有序包封。更小或更大的细胞类型可能需要调整聚焦通道的尺寸以达到合适的雷诺数 Rep。在本文展示的方法验证结果中，使用 9.9 μm 的聚苯乙烯微球（G1000，Thermo Scientific）作为细胞替代物。
- 通过轻柔混匀制备水相颗粒或细胞悬浮液。当使用细胞或聚苯乙烯颗粒时，浓度控制至关重要（见图4），以实现理想的有序包封。参考既往数据12，根据有序排列的间距和微通道尺寸，计算所需的细胞或颗粒浓度：每段预期纵向排列间距乘以聚焦通道的横截面积，对应一个细胞或颗粒。若原始浓度（1% w/w）不足，可通过轻柔离心收集样品，去除上清液，再通过涡旋混匀（若使用细胞则采用更温和的混匀方式）将颗粒重悬，从而提高浓度（此处提高至 1.5% w/w）。准备足够的体积，以满足目标收集量及流速调节所需运行时间的消耗。
- 细胞和聚苯乙烯颗粒的比重均大于 1。尽管本方案中未予演示，但对于持续数分钟至数小时的长期实验，可通过添加溶质（如针对颗粒使用 CaCl2，针对细胞使用 OptiPrep（Sigma-Aldrich））调节溶液密度，实现浮力匹配。
- 在 15 mL 离心管中混合氟化碳油 FC-40（3M）与 PFPE-PEG 嵌段共聚物表面活性剂25（2.5% w/w）（RainDance Technologies），制备 10 mL 连续氟化碳油相。或者，也可使用轻质矿物油（PTI Process Chemicals）与 ABIL-EM 90 表面活性剂（2.5% w/w）（Evonik Goldschmidt Corporation）组合。
3. 实验设置
- 打开倒置光学显微镜（Axio Observer, Zeiss）和高速相机（Phantom V310, Vision Research）。通过手动移动装置或使用电动显微镜载物台，对焦并检查微通道是否存在堵塞或碎屑。当液体流过时，一些微小碎屑可能会被冲出。若存在较大碎屑或明显堵塞，应选择芯片上的其他通道，因为聚焦通道内的碎屑会显著降低颗粒有序排列的质量。注意：在流动条件下，可通过用钝头镊子用力按压受影响区域上方的PDMS表面来清除堵塞。
- 剪取三段PVC管（内径0.01英寸，外径0.03英寸，Tygon），分别用于水相入口、油相入口和乳液出口。为尽量减少死体积，剪取刚好能从注射泵连接到显微镜载物台的管长。将管端以45°角斜切，以便顺利插入流体接口。
- 使用镊子将管端压入第1步中打孔的流体接口，然后将两根30号钝头不锈钢注射针头（SmallParts）分别压入水相和油相入口管的自由端（无需粘合剂）。将出口管插入废液收集容器中，后续实验中可将其转移至收集容器。
- 将装置及连接的管路移至显微镜载物台上，对齐并使用物镜（本实验使用20倍物镜）对准装置喷嘴进行调焦。根据需要调整科勒照明及其他显微镜设置，以获得最佳成像效果。
- 用1 mL注射器（BD）吸取充分混合的水相，用3 mL注射器（BD）吸取第2步中配制的油相溶液。注意：可使用任意体积的注射器，应根据所需的运行时间和脉动最小化进行仔细选择。将注射器垂直倾斜并轻弹，使气泡移至出口端。缓慢推动活塞，将空气推至针尖。保持注射器垂直，将其连接至第3.3步中已安装在装置上的对应注射针头。推动活塞，将空气通过针头死体积排出，直至液体几乎到达装置入口。将注射器牢固安装至注射泵（Nexus 3000, Chemyx）并固定活塞块。对第二个注射器重复上述连接步骤，并将其安装至第二个注射泵。
- 开启每台注射泵，按照泵制造商的操作规程进行编程。将初始流速设置为油相 Qoil = 50 μL/min，水相 Qaq = 5 μL/min。启动泵。
- 等待两种流体进入装置并充满通道，排出残留的空气。此过程可能需要数分钟。若入口管路中存在大量空气，可暂时提高各流速直至空气排出。切勿将流速调得过高，以免通道内产生过大压力，导致PDMS与玻璃之间的键合失效。
- 在初始流速下，观察喷嘴处液滴的形成（本实验结果：20倍放大，帧率21005 fps，曝光时间3 μs）。尽可能缩小相机视野至仅包含喷嘴区域，以最大化帧率并降低内存需求。采集样本视频，并确认采样率足够高，以避免混叠现象。
- 为避免射流现象（见图2），初始水相流速应保持较低。缓慢增加水相流速，观察随着流速升高，长水相通道中颗粒的有序排列情况。
- 若颗粒浓度过低，导致颗粒链中“缺失”颗粒较多，且样品未进行浮力匹配，可将注射泵物理倾斜，使注射器出口朝下，促使颗粒逐渐沉降至注射器出口端。该方法在视频方案中有演示。定期绕轴旋转注射器也可能减少不必要的沉降。
- 当实现充分有序排列后，调节油相流速以调节液滴生成频率和尺寸。平均液滴体积可通过水相流速除以视频捕捉测得的液滴生成频率计算得到。通过迭代调节两个流速，以达到所需的包封率和液滴体积。
- 一旦确认稳定有序的包封状态，将出口管路从废液容器转移至收集容器，或将其接入另一装置以进行后续测试。
- 根据所需液滴数量和计算得到的生成频率确定收集时间。
- 记录含有0、1、2、…、N个颗粒的液滴比例，以量化包封效率，可通过液滴生成视频结果或通过移液取样收集的乳液进行显微观察来完成。
4. 典型结果
结果显示，可实现受控的单颗粒和双颗粒封装（图3）。通过将FC-40油相流速减半，单颗粒封装转变为双颗粒封装。相反，我们本可以提高水相流速以更快地将颗粒输送至喷嘴，但这也会增加水相射流的风险。图3中的直方图展示了两种情况下每液滴内颗粒数的分布比例，并与泊松统计结果进行了比较。含有零个颗粒的液滴偶尔出现，主要原因是有序颗粒列队中存在“缺失”的颗粒；而封装颗粒数超过预期的情况，则源于局部颗粒浓度过高以及部分颗粒有时会向两个垂直聚焦位置之一迁移。需要注意的是，本实验未采用第2节中所述的浮力匹配方法。取而代之的是，将注射泵物理倾斜，使颗粒沉降至注射器出口端，从而在实验过程中形成较高的颗粒浓度。
一个实验运行示例说明了正确粒子和细胞浓度的必要性，如图所示 图4在没有完全有序的情况下，局部区域的颗粒发生有序排列并被包裹，但许多液滴中不含颗粒。直方图显示了目标为两个颗粒包裹的封装效率下降。
图 1. 包封装置。a) 包含入口、出口和长排列通道的整体装置。装置高度为 52 μm，排列通道宽度为 27 μm。b) 水相和油相入口均设有大尺寸去杂质过滤器，其缝隙大小与排列通道宽度相当，图中为油相入口的放大视图。c) 喷嘴放大视图显示水相和油相通道的宽度均为 27 μm，随后喷嘴收缩至 22 μm，并突然扩张至更宽的 61 μm 通道。请注意，此处所示装置的尺寸已在微加工后使用轮廓仪验证，与掩模上的标称尺寸略有差异。排列通道和喷嘴的真实图像可在线获取，见补充图 1。本论文的补充材料中还提供了AutoCAD 掩模文件。
图 2. 使用较宽装置（80 μm 宽 × 22 μm 高）时从滴落模式向射流模式转变的滞后现象。a) 在恒定的 FC-40 流速（Qoil = 45 μL/min）下，当水相流速 Qaq = 8 μL/min 时，在 10 kHz 下可实现稳定的液滴生成。当水相流速缓慢增加至 10 μL/min 时，水相流体开始出现射流现象。b) 当流速恢复至 8 μL/min 时，射流仍持续存在。注意：通过短暂停止水相流体泵（通常暂停 1 秒）可重新建立稳定的液滴生成。
图3. 单颗粒与双颗粒包封。a) 每个液滴包含一个细胞的液滴生成（Qoil = 60 μL/min，Qaq = 9 μL/min），液滴生成速率为6.1 kHz，平均液滴体积为24.4 pL，在样本量为nd = 517个液滴和np = 491个颗粒的条件下，单颗粒捕获效率Dk = 79.5%，Pk = 83.7%（λ = 0.95）。b) 通过将FC-40油相流速Qoil降低至30 μL/min，即可实现每个液滴包含两个细胞的液滴生成。较大体积的液滴（39.8 pL）以3.8 kHz的速率生成，在样本量为nd = 383个液滴和np = 689个颗粒的条件下，双颗粒捕获效率Dk = 71.5%，Pk = 79.5%（λ = 1.80）。c-d) 两个直方图比较了有序单颗粒与双颗粒包封的液滴包封颗粒效率Dk与泊松统计（随机包封）的结果。注意，在两种情况下，流动方向上颗粒间距约为17–18 μm，对应完全有序、交替排列的颗粒。有关单颗粒和双颗粒包封的补充视频可在线获取。 点击此处查看补充视频3a。 点击此处查看补充视频3b。
图 4. 浓度显著影响包封效率。a) 随着浓度降低，无法实现完全有序排列，因此在液滴序列中出现“空位”，导致部分液滴所含颗粒数少于预期。b) 直方图显示，由于λ值较低（λ = 1.57），单颗粒液滴数量几乎与双颗粒液滴数量相当，导致双颗粒包封效率下降（Dk = 55.9%，Pk = 70.9%）。该结果是在油相流速 Qoil = 30 μL/min、水相流速 Qaq = 9 μL/min 的条件下获得，流动条件与图 3b相同。相关补充视频可在线获取。 点击此处查看补充视频 4。
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讨论
尽管有序程度相对较高，但并非所有液滴都含有正确数量的颗粒或细胞。封装效率可计算为：具有目标 occupancy 的液滴中成功封装的细胞或颗粒数量，除以细胞或颗粒的总数。这些原始数据可通过自动高速视频算法获得，也可通过成像收集的乳液样品获得。该结果可与以下两个分数进行比较：被封装在含有 k 个颗粒的液滴中的颗粒比例 Pk，以及含有 k 个颗粒的液滴比例 Dk。图3显示，单颗粒和双颗粒的封装效率均比随机封装效率高出两倍以上，并显著减少了含有超过目标数量颗粒的液滴数目。图4表明，为实现高效率，必须选择合适的浓度；即 λ（颗粒浓度和液滴体积的函数）应等于或接近每个液滴中期望的细胞数，以最大化正确封装的颗粒或细胞数量。需要注意的是，较高的颗粒或细胞浓度通常有利于完全有序，因为密集的颗粒列阵 tends to 随时间扩散并填充列阵之间的空缺区域。然而，如果浓度过高，大量颗粒可能导致界面不稳定，从而在喷嘴处引发射流现象。在某些特定研究中（例如单细胞封装），可能更倾向于避免多细胞液滴，即使这意味着会产生稍多...
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披露
JE 是一项正在申请专利的发明人，该专利基于本文稿中使用的技术。
致谢
我们感谢RainDance Technologies为本研究提供的PFPE-PEG表面活性剂样品，同时感谢BioMEMS资源中心（Mehmet Toner主任）提供用于制作PDMS通道复制品的硅晶片模具。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AutoCAD | AutoDesk | ||
| 透明度蒙版 | Fineline Imaging Inc. | ||
| SU-8 光刻胶 | MicroChem Corp. | 2050 | |
| Dektak 台阶仪 | Veeco Instruments, Inc. | ||
| 培养皿 | BD Biosciences | 351058 | |
| PDMS 硅橡胶弹性体试剂盒 | 道康宁（Dow Corning） | Sylgard 184，材料编号 (240)4019862 | |
| 真空干燥器 | Jencons | 250-030 | |
| 真空泵 | Alcatel Vacuum Technology | 2010 C2 | |
| 真空调节阀 | Cole-Parmer | EW-00910-10 | |
| 烘箱 | 赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific, Inc.） | Lindberg Blue M, OV800F | |
| 活检打孔器，0.75 mm | Harris | Uni-Core 15072 | |
| 实验室电晕处理仪 | Electro-Technic Products Inc. | BD-20AC, SKU 12051A | |
| 载玻片 | Gold Seal | 3010 | |
| Aquapel | PPG Industries | 替代策略 | |
| 聚苯乙烯微球，9.9 μm | 赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific, Inc.） | G1000 | |
| OptiPrep | Sigma-Aldrich | D1556 | 未演示 |
| 鲁尔锁紧式注射器 | BD Biosciences | 1 mL: 309628；3 mL: 309585 | |
| FC-40 氟碳油 | 3M 公司（3M Inc.） | Sigma Aldrich, F9755 | |
| PFPE-PEG 氟化表面活性剂 | RainDance Technologies | ||
| 轻质矿物油 | PTI Process Chemicals | 08042-47-5 | 替代策略 |
| 矿物油表面活性剂 | 赢创金氏公司（Evonik Goldschmidt Corporation） | ABIL EM 90 | 替代策略 |
| Tygon PVC 软管 | Small Parts, Inc. | TGY-010 | |
| 30 号鲁尔锁紧式注射针头，1/2" | Small Parts, Inc. | NE-301PL-C | |
| 倒置显微镜 | 卡尔·蔡司成像系统（Carl Zeiss Imaging） | Axio Observer.Z1 | |
| 高速相机 | Vision Research | Phantom V310 | |
| 注射泵（2 台） | Chemyx Inc. | Nexus 3000 | |
| 硅油 | 道康宁（Dow Corning） | 200 流体，10 cSt | 乳液储存可选 |
参考文献
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