高吞吐量的单细胞和多细胞微胶囊

Summary

结合单分散细胞和颗粒的惯性顺序降代，我们描述了一种方法封装在一个单一千赫率下降所需的细胞或颗粒数。我们证明效率两次超过无序封装的单粒子和双滴。

Abstract

微流控包封方法以前用于以皮升级单分散水滴捕获细胞，提供与本体流体环境的限制，适用于高通量筛选、细胞术和质谱分析。我们描述了一种方法，该方法不仅可以封装单个细胞，还可以重复捕获一定数量的细胞（这里我们演示了单细胞和双细胞封装），以研究分离和受控大小组中细胞之间的相互作用。通过将液滴生成技术与细胞和颗粒排序相结合，我们展示了细胞大小颗粒的受控包埋，以实现高效、连续的包埋。使用水性颗粒悬浮液和不混溶的氟碳油，我们通过聚焦喷嘴在油中生成水滴。水流速足够高，可以产生颗粒的有序性，这些颗粒以液滴生成频率的整数倍频率到达喷嘴，从而在每个液滴中封装受控数量的细胞。为了获得代表性结果，使用 9.9 μm 聚苯乙烯颗粒作为细胞替代物。 本研究表明，单颗粒包埋效率 P_k=1 为 83.7%，双颗粒包埋效率 P_k=2 为 79.5%，而它们各自的泊松效率分别为 39.3% 和 33.3%。事实证明，一致的细胞和颗粒浓度对于高效包埋非常重要，并且还解决了滴落到喷射过渡的问题。

简介

连续培养基含水细胞悬液共享一个共同的流体环境，该环境允许细胞平行相互作用，并且还可以均匀化培养基测量中特定细胞的影响。将细胞高通量封装到皮升级液滴中，限制样品以保护液滴免受交叉污染，能够测量样品内的细胞多样性，防止试剂和表达的生物标志物稀释，并放大来自生物反应器产品的信号。液滴还能够将液滴重新融合到更大的水性样品中，或与其他液滴一起用于细胞间信号转导研究。^1,2 稀释度的减少意味着更强的检测信号可实现更高精度的测量，并且能够减少可能昂贵的样品和试剂量。³ 液滴中的细胞包埋已用于改进蛋白质表达、⁴ 抗体、^5,6 酶⁷ 和代谢活性⁸ 的检测，用于高通量筛选，并可用于改进高通量细胞术。⁹ 其他研究介绍了用于质谱¹⁰ 和目标表面细胞涂层的含细胞液滴的生物电喷涂中的应用。¹¹ 然而，由于缺乏控制液滴中封装的细胞数量的能力，某些应用受到限制。在这里，我们提出了一种有序封装¹² 的方法，该方法提高了 1 个和 2 个单元的封装效率，并且可以外推为大量单元的封装。

为了实现单分散液滴的生成，微流体"流动聚焦"通过使用流体汇聚的喷嘴，可以在另一种流体（连续油相）中产生一种流体（水细胞混合物）的可控尺寸液滴。¹³ 对于给定的喷嘴几何形状，可以通过调整油和水流速 Q_oil 和 Q_aq 来改变液滴产生频率 f 和液滴大小。随着流速的增加，流量可能会从液滴产生转变为水性流体从喷嘴不稳定地喷射。¹⁴

当水溶液中含有悬浮颗粒时，颗粒在喷嘴处被封装并彼此隔离。 对于使用随机分布的水性细胞悬液生成液滴，含有 k 个细胞的液滴 D_k 的平均分数由泊松统计决定，其中 D_k = λ^k exp（-λ）/（k！），λ 是每滴的平均细胞数。最终进入"正确"封装的液滴中的细胞分数使用 P_k = （k x D_k）/Σ（k' x D_k'） 计算。这两个指标之间的细微差别是 D_k 与水性液体的利用率和封装后必须完成的液滴分选量有关，而 P_k 与细胞样品的利用率有关。例如，可以使用稀释的细胞悬液（低 λ）来封装液滴，而大多数含有细胞的液滴只包含一个细胞。虽然效率指标 P_k 很高，但大多数液滴都是空的（低 D_k），因此需要一种分拣机制来去除空液滴，这也降低了通量。¹⁵

将 drop 生成与惯性排序相结合，可以以每层更可预测的单元数和比随机封装更高的吞吐量来封装 drop。惯性聚焦最早由 Segre 和 Silberberg¹⁶ 发现，指的是有限大小的粒子在通道流中迁移到横向平衡位置的趋势。惯性排序是指粒子和单元被动地组织成等间距、交错、等速序列的趋势。聚焦和排序都需要足够高的流速（高雷诺数）和粒径（高颗粒雷诺数）。^17,18 这里，雷诺数 Re =uD_h/ν 和粒子雷诺数 Rep =Re（a/D_h）²，其中 u 是特征流速，D_h [=2wh/（w+h）] 是水力直径，ν 是运动粘度，a 是颗粒直径，w 是通道宽度，h 是通道高度。从经验上讲，实现完全有序列车所需的长度随着 Re 和 Re_p 的增加而减少。请注意，高 Re 和 Re_p 要求（在本研究中分别为 5 和 0.5 量级）可能与保持低水流速以避免在液滴发生喷嘴处喷射的需求相冲突。此外，高流速会导致细胞上的更高剪切应力，这在本协议中没有解决。先前的有序包埋研究表明，在与本研究中的细胞相似的流动条件下，超过 90% 的单包埋 HL60 细胞保持了细胞膜的完整性。¹² 然而，在推断不同的单元类型和流动参数时，需要仔细考虑剪切应力的大小和时间尺度的影响。细胞排序、液滴生成和细胞活力水性流速约束的重叠为单个和多个细胞的受控包封提供了理想的作方案。

因为很少有研究涉及粒子间的序列间距，^19,20 确定间距最容易通过经验完成，并且取决于通道几何形状、流速、颗粒大小和颗粒浓度。尽管如此，列车之间相等的横向间距意味着单元以可预测的、一致的时间间隔到达。当液滴生成速度与有序细胞到达喷嘴的速度相同时，细胞以受控方式被包裹在液滴中。该技术已被用于封装单细胞，吞吐量约为 15 ^kHz，12 与之前报告约 60-160 Hz 的封装速率的研究相比，这是一个显着的改进^4,15在受控封装工作中，超过 80% 的液滴包含且仅包含一个细胞，与泊松（随机）统计相比，效率显著提高， 预计平均效率低于 40%。¹²

在之前的受控封装工作中，¹² 调整了每滴 λ 的平均颗粒数以提供单细胞封装。我们假设，通过调整流速，当 λ 等于或接近每滴所需的细胞数时，我们可以有效地封装每滴任意数量的细胞。虽然单细胞封装在确定单个细胞对刺激的反应方面很有价值，但多细胞封装提供了与受控数量和类型的细胞相互作用相关的信息。在这里，我们提出了一个协议，使用聚苯乙烯微球的代表性结果，并讨论了使用被动惯性排序通道和液滴生成喷嘴对多个细胞进行受控封装。

Protocol

本节中的协议描述了利用，特别是获得实验结果提出的材料和设备。需要注意的是可利用替代化学品和设备供应商。

1。设备制造和软光刻技术

标准软光刻技术^，21日已在以前的朱庇特的文章特色的数字^，22个用于创建聚二甲基硅氧烷（PDMS）粘接到玻璃基板的微网络。除了从主副本SU-8光刻的模具制造，过程可能进行洁净室或洁净罩外;然而，尘埃和微粒仍然应该最小化，以达到一致的结果。

1. 在AutoCAD（Autodesk公司）在图1所示，设计了一个微通道模式。聘请第三方制造商（Fineline影像公司）打印一个高分辨率（50,000 dpi）的反麦拉片或石英的渠道是一个黑暗的背景上透明的透明度面具。
2. 创建一个副本成型的硅和SU-8光阻主。简言之，旋转SU-8 2050年（MicroChem）负光阻旋转涂布机，以创造一个干净的7.5厘米或10厘米硅片上的厚厚的一层52微米的制造商建议的转。经过软烤，边珠去除紫外线照射，通过接触口罩，接触后烘，发展，和洪水接触，测量的SU-8层，使用的Dektak轮廓（Veeco公司）的实​​际厚度。磁带准备PDMS的副本成型模具师傅到4"或5"培养皿的底部。
3. 混合硅橡胶弹性体弹性体固化剂，在10:1的比例W / W基固化剂（道康宁）的基础上。倒入硅主充分混合的PDMS先导，以创建一个最终层厚度2-3毫米。一个橡胶基地20克，2克固化剂的混合物，是足以应付4"直径表面。
4. 放置的肥大ŕ模具和PDMS（Jencons）在真空干燥器的气体固化硅橡胶。使用压力调节器（科尔帕默），缓慢下降超过20分钟-27"汞"汞从0腔表压，以避免过多的泡沫。 -27"汞留在30分钟或直到气泡消失在真空室设备。
5. 释放真空，将主模和PDMS为65°C的烘箱中至少四小时（Thermo Scientific的）。该设备可能会留在一夜之间改善固化烤箱。
6. 从烤箱取出设备，并允许降温。仔细剪裁的PDMS周围圆形晶圆用一个精确的刀和剥离出的PDMS。 如图1所示，用手术刀切割设备的轮廓。
7. 打孔流体端口（每台设备3）在图1所示的三个圆形区域使用活检冲。此设备，使用0.75毫米外径冲（哈里斯）。
8. 坚持透明胶带图案的PDMS和剥离面，以消除任何灰尘。为节省成本，但可行的替代传统的氧等离子体仪器^，21,22血浆治疗的PDMS和清洁3"×1"玻璃显微镜幻灯片的图案边，使用手持式实验室电晕处理机（电解工艺制品有限公司^。）23请注意，此设备应在通风橱或通风良好的地方由于臭氧放电，所有手表和手机应保持至少10英尺的距离。调整最小的火花，达到一个稳定的电晕，电晕放电。慢慢地挥动电极约1/4"以上每面约20秒钟，然后立即把处理后的表面接触，形成了强大的永久债券前返回他们的原生状态的PDMS表面。
9. 设备上放置一块金属板，在阴凉烤箱，设定烤箱至120°C，烤一夜之间完成粘接的PDMS在这种高温烘烤，T返回到其原有的疏水状态^。24他的玻璃表面的通道也将呈现疏水由于薄的疏水层的玻璃上沉积。另外，疏水涂层，如Aquapel（PPG工业公司）可能会被注入流体用1毫升注射器和针头端口^12。谨慎但坚定地注入清除空气流体端口的PDMS没有打破玻璃债券Aquapel 。关闭任何多余Aquapel的边擦，以避免任何可能堵塞后，干燥的渠道存款，积极地重复对所有进口和出口的空气净化。

2。样品制备

1. 根据您所选择的细胞类型的既定程序，准备细胞培养。 8-15微米的颗粒或细胞在这项研究中所使用的特殊设备，应充分订购封装。较小或较大的细胞类型，可能需要改变的重点通道的尺寸，以达到足够的再_带够 。对于我本文thod示范结果表明，9.9微米的聚苯乙烯微球（G1000的Thermo Scientific的）被用作细胞的代理人。
2. 准备通过温和的混合水粒子或细胞悬液。当使用电池或聚苯乙烯颗粒，浓度控制是必要的（ 见图4），以达到理想的有序封装。使用以前的数据为指导，计算出所需的细胞或粒子浓度的基础上有序的列车间距和微通道尺寸为:一个细胞或颗粒每预期的纵向列车间隔时间聚焦通道截面积。如果股票浓度（1％W / W）是不够的，增加浓度（1.5％W / W）股票样本轻轻离心，除去上清液，和再悬浮旋涡混合，或温和的混合颗粒当使用电池。准备足够的量，占所需收集的数量和运行时间与FLOW调整。
3. 两种细胞和聚苯乙烯颗粒有一个特定的重力大于一。虽然没有在这个协议表明，持续多少分钟到几个小时的秩序的长期实验，浮力匹配的解决方案，通过添加溶质，如_氯化钙颗粒或细胞OptiPrep（Sigma-Aldrich公司）。
4. 准备10毫升样品的连续氟碳油相混合氟碳油FC-40（3M）和聚醚-聚乙二醇嵌段共聚物表面活性剂（2.5％W / ^W）25（飞雨）在15 mL离心管。另外，轻矿物油，（交汇处过程化学品），可以利用ABIL-EM 90表面活性剂（2.5％W / W）（赢创高施米特公司）。

3。实验装置

1. 倒置光学显微镜（Axio上观察，蔡司）和高速摄影机（幻影V310，视觉研究）的电源。重点和检查和杂物堵塞的渠道，或通过手动移动设备使用电动显微镜阶段。当液体流经一些小碎片可能会被推。对于大型的碎片或明显的木屐，选择另一个设备上的通道，在重点通道的碎片可以订购质量显着降低。请注意，木屐通常可以根据流量按上述钝镊子受灾地区的PDMS表面上牢固删除。
2. 切水入口的长度为（0.01"ID/0.03"外径，聚乙烯）PVC管材，进油口，和乳液插座。为了尽量减少死体积，减少刚够油管，以达到从注射器泵在显微镜阶段。切断油管两端45°角，以方便插入到流体港口。
3. 使用镊子，按适应管在第1步砸出流体端口结束，然后按各自的水和油口管（无粘合剂必要）的自由端放入两个30号钝尖不锈钢注射器针头（SmallParts） 。放入废物ŕ的出口管eservoir。该管稍后将搬进一家集水库。
4. 移动设备和连接管显微镜的阶段，调整，集中在设备的使用提供客观的喷嘴（20倍，本实验所用）。调整ķhler照明和其他显微镜设置为最佳录音。
5. 混合水相和油相的解决方案，准备在第2步3毫升注射器（BD），填补了1毫升注射器（BD）。请注意，任何体积的注射器，可使用取决于所需的运行时间和最小化任何搏动，应慎重选择。倾斜注射器垂直轻弹气泡移动到注射器插座。慢慢压低柱塞足以推动注射器尖端的空气。拿着注射器垂直，连接到步骤3.3的设备已经连接到各自的注射器针头的注射器。压下柱塞强行通过注射器针头死体积的空气，直到流体是p通过油管设备几乎ushed。牢固安装注射器，注射器泵（NEXUS 3000 Chemyx）和从事柱塞块。第二注射器重复的连接，并安装到第二个注射泵。
6. 每个注射泵的权力和程序，使用泵制造商的协议。设置初始流量为 Q _油 = 50μL/分钟和 Q _AQ = 5μL/分钟，分别为油相和水相中。启动泵。
7. 等待每个流体进入设备填补渠道，推动了其余的死气。这可能需要几分钟。如果有大量的空气入口管，临时增加每个流量，直到空气被驱逐。不增加流量率如此之高，发生大的压力的通道，可能会导致硅橡胶，玻璃债券失败。
8. 使用初始流速，观察滴在喷嘴形成（结果显示在这里:20X magnificatioN，帧频21005 FPS，曝光3微秒）。减少相机领域的观点只喷嘴，以最大限度地提高帧速率和减少内存需求，如果可能的话。捕获样本的影片，并确认采样率是足够的，以避免走样。
9. 为了避免喷射（ 见图2），开始与低水的流速。慢慢增加水的流速，观察颗粒订货，只要流量的增加水溶液通道。
10. 如果颗粒物浓度太低提供相对较少的"失踪"的粒子和样品不匹配浮力的火车，身体倾斜，向注射泵的注射器出口提供的粒子向注射器出口的逐步解决。这种方法被证明在视频协议。定期注射器沿其轴线旋转，也可减少不受欢迎的沉淀。
11. 一旦发生足够的顺序，调整油流量调整代频率和滴的大小。可以计算平均下降量，利用水的流速由下拉代视频捕捉测量频率划分。反复调整两个流率，以达到预期的包封率和降量。
12. 一旦稳定有序封装证实，从废物水库出口油管移动到一个集合水库或送入另一个随后的测试设备。
13. 确定集合时间，根据所需数量的飞沫和计算的发电频率。
14. 记录包含0，1，2，...，N粒子使用或吸取样品收集乳液检查或者降代视频结果量化效率下降的一小部分。

4。代表结果

结果，提出了实现同时控制单粒子和控制的双粒子封装（ 图3）。通过削减FC-40在半油流率，单粒子封装成为两粒子封装。相反，我们可以增加水的流速，更迅速地提供颗粒的喷嘴，但我们也将增加喷射水流的风险。在图3的直方图提出该两宗案件的每一滴水颗粒小数，随着泊松统计的比较。零颗粒，偶尔滴，主要是由于"失踪"在有序的列车颗粒，而那里有从局部高颗粒浓度和颗粒有时朝两个垂直聚焦位置迁移的结果比预期的更封装颗粒的案件。请注意没有利用浮力匹配，如在第2节所述。相反，注射泵，身体倾斜，允许向注射器出口的粒子沉降，导致高浓度的运行过程中的颗粒。

如图4所示。没有充分的顺序，颗粒秩序的本地化团体和封装，但很多滴，无颗粒。直方图显示所需的颗粒封装包封率下降。

图1。封装设备。 a）整体设备入口，出口和长期订购通道。设备高度为52μm和订购的通道宽度为27微米。 B）水和油入口有大的杂物过滤器订购通道宽度放大的进油口秩序的差距。三）扩大喷嘴视图显示等通道宽度由22微米的喷嘴，突然扩展到更宽的61微米通道收缩水和油的渠道，其次为27微米。请注意，这里显示设备的尺寸已经验证，使用后微细1轮廓，从面具的标称尺寸略有不同。订购通道和喷嘴的真实形象可在网上作为参考图1 。 AutoCAD的掩码文件也被列入网上这个手稿的补充。

图2。一个滴水喷射过渡使用更广泛的设备（高80μm宽×22微米）的迟滞。一）常数的FC-40流量（问_油 = 45μL/分钟），采用水溶液流量 Q _AQ = 8μL/ min的稳步下降的形成发生在10 kHz。由于水的流速缓慢上升到10＆MU;升/分钟，水流体流喷射触发。 b）当流量返回到8μL/ min的喷射持续。注意稳步下降形成简要暂停水流量泵（1秒的停顿是典型的），可以重新建立。

图3。单粒子和双封装。掉落的形成与每下降一个细胞（）Q _油 = 60μL/分钟，问_AQ = 9μL/分钟）下降了6.1 kHz的生成率，平均降幅大小24.4 PL，和_ðK = _79.5％，P K = n个样本大小为83.7％（λ= _0.95）D = 517滴和_N P = 491颗粒。 二）与两个细胞下降形成一种单细胞的采集效率每一滴水，实现简单的FC-40 流量 Q _石油减少30μ升/分钟。较大（39.8 PL）下降3.8千赫的速度形成两个细胞的采集效率_{ðķ= 71.5％，P} K = 79.5％（λ= 1.80）为n 的样本大小₌ 383滴和 n _P = 689粒子。CD）两个直方图比较下降封装颗粒效率D的定购单和双粒子与泊松统计（随机封装）封装_ķ。请注意，这两种情况下，完全有序，交替颗粒在流动方向的粒子间距约17-18微米。补充视频显示单粒子和双封装可在网上点击这里查看补充电影3A 点击这里查看补充电影3B 。

图4。浓度的包封率有很大影响。A）随着浓度的降低，充分顺序不会发生，因此，"洞"在列车的出现，留下一些下降少于预期颗粒。 二）直方图显示的效率下降（ _{ðķ= 55.9％，P} K = 70.9％，为两粒子的封装，由于较低的λ值= 1.57那里有几乎同样多的单粒子下降，因为有双粒子滴）。这个数字结果从 Q _油 = 30μL/ min的和 Q _AQ = 9μL/ min的相同流量条件下， 图3b。一位代表补充视频可在网上点击这里查看补充电影4 。

Discussion

尽管订货度比较高，并非所有滴将包含适当数量的粒子或细胞。包封可以封装成为在滴除以他们的总人数所需占用的细胞或颗粒的数量计算。无论是从一个自动化的高速视频算法或从成像收集乳液样品，可以得到这些原始数据。这可以相比下降封装在一个包含k粒子和分数，将包含ķ颗粒含滴_ðK粒子的_P K的分数。从图3中 ，单和双颗粒封装效率优于随机包封由以上两个因素，大大降低了所需的粒子数比数滴图4演示了适当的浓度为高效率的需要。也就是说，与lambd A;颗粒浓度和滴体积的功能，应该等于或接近每一滴水所需的细胞，以最大限度地正确封装的颗粒或细胞的数量。请注意，一个粒子或细胞的浓度较高，通常是一件好事，为全面有序密集的列车往往随着时间的推移和传播，填补空虚地区之间的列车。另一方面，如果浓度过高，高颗粒的数量可能会导致界面不稳定性引起的喷嘴喷射。在具体的研究（如单细胞封装，例如，），它可能会更有利引进几个空的水滴的费用，以避免在多细胞的液滴，因此λ将稍低于预期。这也适用于在两个细胞之间的相互作用之间的细胞和颗粒...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
AutoCAD的	欧特克
透明面具	fineline成像公司
SU-8胶	MicroChem	2050
dektak轮廓	Veeco公司
培养皿	屋宇署猎鹰	351058
硅橡胶硅橡胶套件	道康宁公司	sylgard 184，材料编号（240）4019862
真空干燥器	jencons	250-030
真空泵	阿尔卡特高真空技术	2010的C2
真空调节器	科尔 - 帕默	EW-00910-10
烤箱	Thermo Scientific的	林德伯格蓝M，OV800F
活检冲床，0.75毫米	哈里斯	统一的核心15072
实验室电晕处理机	电，工艺制品有限公司	BD-20AC，12051A的SKU
载玻片	金印	3010
aquapel	PPG工业公司		替代战略
聚苯乙烯微球，9.9微米	热	G1000的
OptiPrep	Sigma-Aldrich公司	D1556	没有表现出
鲁尔 - 乐注射器	屋宇署	1毫升:309628 3毫升:309585
FC-40氟碳油	3M公司	Sigma Aldrich公司，F9755
聚醚 - 聚乙二醇含氟表面活性剂	飞雨技术
轻质矿物油	公共交通交汇处过程化学品	08042-47-5	替代战略
矿物油表面活性剂	赢创高施米特公司	ABIL的EM 90	替代战略
聚乙烯聚氯乙烯管	SmallParts	TGY-010
30计鲁尔乐注射器针头，1/2"	SmallParts	ñ-301PL-C的
倒置显微镜	卡尔蔡司影像	AXIO Observer.Z1
高速摄影机	视觉研究	幻影V310
注射泵（2）	chemyx公司	NEXUS 3000
硅油	道康宁	200液，10 CST	乳化存储可选