结合单分散液滴生成与细胞及颗粒的惯性有序排列，我们描述了一种在千赫兹速率下单个液滴内封装特定数量细胞或颗粒的方法。对于单颗粒和双颗粒液滴，该方法的封装效率是无序封装的两倍以上。
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摘要
摘要
微流控封装技术先前已被用于在皮升级水相、单分散液滴中捕获细胞，使细胞与主体流体环境隔离，应用于高通量筛选、细胞计数和质谱分析。本文描述了一种不仅能够封装单个细胞，而且能够重复捕获特定数量细胞（本文展示了单细胞和双细胞封装）的方法，以研究细胞的分离状态以及在大小可控的细胞群体中的相互作用。通过结合液滴生成技术与细胞及微粒的有序排列，我们实现了对细胞尺寸微粒的可控封装，从而实现高效、连续的封装过程。利用水相微粒悬浮液与不相溶的氟化碳油，我们通过聚焦流喷嘴在油相中生成水相液滴。水相流速足够高，可使微粒在到达喷嘴时以液滴生成频率的整数倍频率有序排列，从而在每个液滴中封装可控数量的细胞。为展示代表性结果，采用9.9 μm的聚苯乙烯微粒作为细胞替代物。本研究显示，单微粒封装效率Pk=1达到83.7%，双微粒封装效率Pk=2达到79.5%，相较于相应的泊松分布效率（分别为39.3%和33.3%）显著提高。实验表明，稳定的细胞和微粒浓度对实现高效封装具有重要意义，同时本文也探讨了滴落模式向射流模式转变的影响。
引言
连续相水性培养基中的细胞悬浮液共享相同的流体环境，使细胞能够并行相互作用，同时在培养基的检测中均一化单个细胞的影响。将细胞高通量封装至皮升级液滴中，可将样品限定在独立单元内，防止交叉污染，实现对样品内细胞多样性的检测，避免试剂及表达的生物标志物被稀释，并放大生物反应产物的信号。液滴还具备重新融合的能力，可将液滴合并为更大的水相样品或与其他液滴融合，用于细胞间信号传导研究1,2。稀释程度的降低意味着检测信号更强，测量精度更高，同时也可减少昂贵的样品和试剂用量3。细胞在液滴中的封装已被用于提升蛋白质表达4、抗体5,6、酶7以及代谢活性8的检测，适用于高通量筛选，并有望用于改进高通量流式细胞分析9。其他研究还展示了含细胞液滴在质谱分析中的生物电喷雾10以及靶向表面细胞涂层方面的应用11。然而，部分应用受限于无法精确控制封装进液滴的细胞数量。本文介绍一种有序封装方法12，该方法提高了单细胞和双细胞封装效率，并可外推用于封装更多数量的细胞。
为了实现单分散液滴的生成，微流控“流动聚焦”技术可通过使用两种流体汇聚的喷嘴，在一种流体（连续油相）中生成另一种流体（水相细胞混合液）的尺寸可控的单分散液滴。13 在给定喷嘴几何结构的情况下，通过调节油相和水相的流速 Qoil 和 Qaq，可改变液滴生成频率 f 和液滴尺寸。随着流速增加，流动状态可能从液滴生成转变为水相液体从喷嘴处不稳定喷射。14
当水溶液中含有悬浮颗粒时，颗粒会在喷嘴处被包裹并相互隔离。使用随机分布的水相细胞悬液生成液滴时，含有 k 个细胞的液滴平均比例 Dk 由泊松统计决定，即 Dk = λk exp(-λ)/(k!)，其中 λ 表示每个液滴的平均细胞数。最终进入“正确”包裹液滴中的细胞比例通过 Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk') 计算得出。这两个指标之间的细微差别在于：Dk 反映了水相液体的利用效率以及包裹后所需完成的液滴分选工作量，而 Pk 则反映细胞样品的利用效率。例如，可以使用稀释的细胞悬液（低 λ）进行包裹，使大多数含细胞的液滴仅包含一个细胞。此时，效率指标 Pk 会较高，但大多数液滴为空（Dk 较低），因此需要分选机制去除空液滴，从而降低通量。15
将液滴生成与惯性排序相结合，能够实现比随机包封更可预测的每液滴细胞数量以及更高的通量。惯性聚焦最初由 Segre 和 Silberberg16 发现，指的是有限尺寸颗粒在通道流动中迁移到侧向平衡位置的趋势。惯性排序则指颗粒和细胞被动地排列成等间距、交错且恒速的序列。聚焦和排序均需要足够高的流速（高雷诺数）和颗粒尺寸（高颗粒雷诺数）17,18。此处，雷诺数 Re =uDh/ν，颗粒雷诺数 Rep =Re(a/Dh)2，其中 u 为特征流速，Dh [=2wh/(w+h)] 为水力直径，ν 为运动粘度，a 为颗粒直径，w 为通道宽度，h 为通道高度。经验表明，实现完全有序序列所需的长度随 Re 和 Rep 的增加而减小。需要注意的是，较高的 Re 和 Rep 要求（本研究中分别约为 5 和 0.5）可能与需要保持较低水相流速以避免液滴生成喷嘴处出现射流的现象相冲突。此外，高流速会导致细胞承受更高的剪切应力，但本方案未涉及此问题。先前的有序包封研究表明，在与本研究相似的流动条件下，超过 90% 的单细胞包封 HL60 细胞保持了细胞膜完整性12。然而，在推广至不同类型细胞和流动参数时，必须仔细考虑剪切应力的大小和时间尺度的影响。细胞有序化、液滴生成以及细胞活性对水相流速的限制条件之间的重叠区域，为单细胞和多细胞的可控包封提供了理想的运行区间。
由于极少有研究涉及颗粒间列的间距19,20，因此确定该间距最简便的方法是通过实验确定，且其值取决于通道几何形状、流速、颗粒尺寸和颗粒浓度。尽管如此，列之间相等的横向间距意味着细胞将以可预测且一致的时间间隔到达。当液滴生成速率与有序排列的细胞到达喷嘴的速率相同时，细胞便能以受控方式被封装进液滴中。该技术已被用于单细胞封装，通量可达约15 kHz12，相较于此前报道的60–160 Hz封装速率的研究有显著提升4,15。在受控封装实验中，超过80%的液滴包含且仅包含一个细胞，相较于泊松（随机）统计所预测的平均不足40%的效率，显著提高了封装效率12。
在以往的受控封装研究中12，通过调节每个液滴中的平均颗粒数 λ，以实现单细胞封装。我们假设，通过调节流速，当 λ 等于或接近每个液滴所需细胞数量时，可高效地实现任意数量细胞的封装。虽然单细胞封装在确定细胞对刺激的个体反应方面具有重要价值，但多细胞封装则可提供有关受控数量和类型细胞之间相互作用的信息。本文介绍了一种利用被动惯性排列通道与液滴生成喷嘴实现多细胞受控封装的实验方案、以聚苯乙烯微球为例的代表性结果以及相关讨论。
方案
本节中的实验方案描述了为获得所展示实验结果而专门使用的材料和设备。请注意，化学品和设备可使用其他供应商的产品。
1. 装置制备与软光刻技术
采用标准的软光刻技术21，其中一些技术已在先前的 JOVE 文章中介绍过22，用于制备键合在玻璃基底上的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道网络。除通过 SU-8 光刻制备母模复制品外，其余步骤可在无洁净室或洁净罩的环境中进行；然而，仍应尽量减少灰尘和颗粒物，以获得稳定一致的实验结果。
- 使用 AutoCAD (AutoDesk Inc.) 设计如图1所示的微通道图案。委托第三方制造商（Fineline Imaging Inc.）在聚酯薄膜（Mylar）或石英基底上制作高分辨率（50,000 dpi）透明掩膜，其中通道区域为透明，背景为深色。
- 制备硅片和 SU-8 光刻胶母模用于复制成型。简要步骤如下：将 SU-8 2050（MicroChem）负性光刻胶按照制造商推荐的转速在匀胶机上旋涂于洁净的 7.5 cm 或 10 cm 硅片表面，形成厚度为 52 μm 的薄膜。依次经过前烘、去边、通过接触式掩膜进行紫外曝光、曝光后烘烤、显影及泛光曝光后，使用 Dektak 台阶仪（Veeco）测量 SU-8 层的实际厚度。将制备好的母模用胶带固定于 4 英寸或 5 英寸培养皿底....
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讨论
尽管有序程度相对较高，但并非所有液滴都含有正确数量的颗粒或细胞。封装效率可计算为：具有目标 occupancy 的液滴中成功封装的细胞或颗粒数量，除以细胞或颗粒的总数。这些原始数据可通过自动高速视频算法获得，也可通过成像收集的乳液样品获得。该结果可与以下两个分数进行比较：被封装在含有 k 个颗粒的液滴中的颗粒比例 Pk，以及含有 k 个颗粒的液滴比例 Dk。图3显示，单颗粒和双颗粒的封装效率均比随机封装效率高出两倍以上，并显著减少了含有超过目标数量颗粒的液滴数目。图4表明，为实现高效率，必须选择合适的浓度；即 λ（颗粒浓度和液滴体积的函数）应等于或接近每个液滴中期望的细胞数，以最大化正确封装的颗粒或细胞数量。需要注意的是，较高的颗粒或细胞浓度通常有利于完全有序，因为密集的颗粒列阵 tends to 随时间扩散并填充列阵之间的空缺区域。然而，如果浓度过高，大量颗粒可能导致界面不稳定，从而在喷嘴处引发射流现象。在某些特定研究中（例如单细胞封装），可能更倾向于避免多细胞液滴，即使这意味着会产生稍多.......
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披露
JE 是一项正在申请专利的发明人，该专利基于本文稿中使用的技术。
致谢
我们感谢RainDance Technologies为本研究提供的PFPE-PEG表面活性剂样品，同时感谢BioMEMS资源中心（Mehmet Toner主任）提供用于制作PDMS通道复制品的硅晶片模具。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AutoCAD | AutoDesk | ||
| 透明度蒙版 | Fineline Imaging Inc. | ||
| SU-8 光刻胶 | MicroChem Corp. | 2050 | |
| Dektak 台阶仪 | Veeco Instruments, Inc. | ||
| 培养皿 | BD Biosciences | 351058 | |
| PDMS 硅橡胶弹性体试剂盒 | 道康宁（Dow Corning） | Sylgard 184，材料编号 (240)4019862 | |
| 真空干燥器 | Jencons | 250-030 | |
| 真空泵 | Alcatel Vacuum Technology | 2010 C2 | |
| 真空调节阀 | Cole-Parmer | EW-00910-10 | |
| 烘箱 | 赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific, Inc.） | Lindberg Blue M, OV800F | |
| 活检打孔器，0.75 mm | Harris | Uni-Core 15072 | |
| 实验室电晕处理仪 | Electro-Technic Products Inc. | BD-20AC, SKU 12051A | |
| 载玻片 | Gold Seal | 3010 | |
| Aquapel | PPG Industries | 替代策略 | |
| 聚苯乙烯微球，9.9 μm | 赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific, Inc.） | G1000 | |
| OptiPrep | Sigma-Aldrich | D1556 | 未演示 |
| 鲁尔锁紧式注射器 | BD Biosciences | 1 mL: 309628；3 mL: 309585 | |
| FC-40 氟碳油 | 3M 公司（3M Inc.） | Sigma Aldrich, F9755 | |
| PFPE-PEG 氟化表面活性剂 | RainDance Technologies | ||
| 轻质矿物油 | PTI Process Chemicals | 08042-47-5 | 替代策略 |
| 矿物油表面活性剂 | 赢创金氏公司（Evonik Goldschmidt Corporation） | ABIL EM 90 | 替代策略 |
| Tygon PVC 软管 | Small Parts, Inc. | TGY-010 | |
| 30 号鲁尔锁紧式注射针头，1/2" | Small Parts, Inc. | NE-301PL-C | |
| 倒置显微镜 | 卡尔·蔡司成像系统（Carl Zeiss Imaging） | Axio Observer.Z1 | |
| 高速相机 | Vision Research | Phantom V310 | |
| 注射泵（2 台） | Chemyx Inc. | Nexus 3000 | |
| 硅油 | 道康宁（Dow Corning） | 200 流体，10 cSt | 乳液储存可选 |
参考文献
- Zagnoni, M., Lain, G. L. e, Cooper, J. M. Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).
- Niu, X. Z., Gielen, F., Edel, J. B., deMello, A. J.
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重印与许可
