我们展示了一种实验方案，该方案通过给予小鼠致基因毒性试剂偶氮甲烷（AOM），随后进行三轮促炎剂葡聚糖硫酸钠（DSS）处理，可快速且稳定地诱导小鼠结肠肿瘤形成，其形态学和分子特征与人类结肠炎相关性癌症中的肿瘤具有相似性。
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摘要
摘要
炎症性肠病（IBD）患者，如克罗恩病（CD）或溃疡性结肠炎（UC）患者，相较于健康人群，发生结直肠癌（CRC）的风险更高。该风险与疾病持续时间和累及范围呈正相关，在病程较长且结肠广泛受累的UC患者中，累积发病率可高达30%1。IBD相关的结肠异型增生及结肠炎相关性癌（CAC）被认为是在慢性炎症细胞因子环境中，上皮细胞反复经历损伤与修复循环的结果2。尽管自发性结直肠癌与结肠炎相关性癌均属于腺癌，但其潜在的分子事件发生顺序被认为存在差异3。这一区别凸显了建立特定CAC动物模型的必要性。
目前已有多种小鼠模型可用于结肠炎相关性癌（CAC）的研究。葡聚糖硫酸钠（DSS）是一种对结肠上皮具有直接毒性作用的试剂，可通过饮水方式在小鼠中以多个周期给药，从而诱导慢性炎症状态。在足够长的时间后，部分小鼠将发展出肿瘤。4 若在促癌环境中使用该模型，肿瘤的发生将被加速。这包括携带肿瘤发生通路相关基因突变的小鼠（如 APC、p53、Msh2），以及预先用致突变剂处理的小鼠（如偶氮甲烷 [AOM]、1,2-二甲基联氨 [DMH]）。5
将DSS与AOM联合用于结肠炎相关性癌症的动物模型因其可重复性强、效果显著、成本低廉且操作简便而广受青睐。尽管AOM与DMH具有相似的作用机制，但研究发现AOM在溶液中比DMH更具活性且更稳定。在其他模型中，肿瘤的形成通常需要数月时间，而经AOM注射后给予DSS处理的小鼠在短短7至10周内即可形成充分的肿瘤6, 7。此外，AOM和DSS可应用于任何遗传背景的小鼠（如基因敲除、转基因等），无需与特定的致瘤品系进行杂交。本文展示了一种在小鼠中诱导炎症驱动的结肠肿瘤发生的实验方案，具体为单次注射AOM后，在10周内进行三个为期7天的DSS处理周期。该模型所诱导的肿瘤在组织学和分子改变方面与人类结肠炎相关性癌症（CAC）高度相似，为研究该疾病中的肿瘤发生机制及化学预防提供了极为有价值的实验平台8。
方案
1. 结肠炎相关性癌症诱导
- 准备若干笼性别和年龄匹配的6-8周龄小鼠，用于实验组和对照组。可通过尾部标记或耳标对小鼠进行个体标识。
- 第0天，记录小鼠的基线体重，并通过腹腔注射（IP）给予每只小鼠10 mg/kg的AOM工作溶液（用等渗盐水配制成1 mg/ml，由保存于-20 °C的dH2O中10 mg/ml储备液稀释而来）。根据经验，该剂量可在7-14 mg/kg范围内调整和/或在实验早期重复给药。
注意：AOM 是一种易挥发的遗传毒性试剂，应根据随附的材料安全数据表（MSDS）小心操作。稀释液应在通风橱中配制，置于冰上保存，并按照各机构特定的规程进行废弃处理。
- 在蒸馏水中配制2.5%（2.5 g/100 ml）的DSS溶液，并通过真空过滤装置经0.22 μm醋酸纤维素滤膜过滤。该浓度可根据小鼠品系和饲养环境在1–3.5%之间调整。配制好的DSS溶液可在4°C冰箱中保存最多1周。
- 第7天起，将DSS溶液作为小鼠的饮用水供给。每更换一次DSS溶液，每个笼盒大约需要250 ml，最多可供应5只小鼠；但具体用量会因动物设施所使用的饮水瓶类型而有所差异，此处仅为估算值。
- 为确保连续7天的DSS供给，应在该期间内每2–3天更换一次溶液，共更换三次，使用清洁的饮水瓶。部分研究人员会在更换新溶液前测量小....
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讨论
采用AOM和DSS处理小鼠可快速且有效地模拟人类结肠炎相关性癌症。通过基因工程小鼠可方便地研究与结肠炎相关性癌症相关的遗传因素的假设。13, 16 或者，可利用野生型小鼠研究药物靶点在结肠炎相关性癌症中的作用。
尽管该模型在炎症背景下研究结肠肿瘤发生方面备受重视，但仍存在局限性。在此模型中，小鼠所表现出的疾病程度可能因小鼠品系及饲养条件（笼具、喂养、微生物群等）的不同而有显著差异。Suzuki 等人报道，Balb/c 小鼠对 AOM/DSS 最为敏感，随后依次为肿瘤发生率和数量递减的 C57BL/6N、C3H/HeN 和 DBA/2N 小鼠17。单独使用 DSS 和 AOM 对 129/Sv 小鼠进行的实验结果提示，其对联合处理的反应程度中等，与 C57BL/6J 小鼠相似18,19。因此，根据可用的设施和资源，可能需要开展预实验以确定最有效的给药方案。虽然 AOM/DSS 诱导的结肠肿瘤在组织学上类似于人类结直肠癌，但极少发生转移。在分子水平上，已有报道显示 β-catenin、COX-2 和 iNOS 发生改变，.......
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致谢
本工作部分由DK089016和L30 RR030244（MAC）、CA153036（AS）以及P30-DK52574（资助华盛顿大学消化系统疾病研究中心）提供资金支持。A.I.T. 是霍华德·休斯医学研究所医学研究培训研究员。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C57BL/6J 小鼠 | 杰克逊实验室 | 000664 | |
| 偶氮甲烷（AOM） | Sigma Aldrich | A5486-100MG | 储存液：用蒸馏水稀释至 10 mg/ml，分装为 0.5 - 1 ml 每份，于 -20 °C 保存。 工作液：将储存液用等渗（0.9%）生理盐水稀释至 1 mg/ml |
| 葡聚糖硫酸钠（DSS） | TdB 咨询公司 | DB001 | 分子量 40 kDa（其他来源的 36-50 kDa 制剂也可接受；单次实验应使用同一批号）6 |
| Coloview 微型内窥镜系统 | Karl Storz | 多种型号 | 有关设备和设置的详细说明，请参见 Becker et al.11 |
| TPP Rapid FILTERMAX 500 ml 瓶式滤器，0.22 μm PES | Midwest Scientific | TP99500 | 任何标准组织培养滤器均可接受 |
| 200 证明乙醇 ASC/USP | Pharmaco-AAPER（或其他） | 11ACS200 | 用蒸馏水稀释至 70% |
| 异氟烷，USP | Butler 动物健康供应公司 | 4029405 | 将小鼠放入装有浸有麻醉剂的纱布或小块布料的玻璃罐中 |
| 18G 直式灌胃针 | Braintree Scientific | N-008 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma Aldrich | P5493 | 用蒸馏水稀释至 1X（0.01 M） |
| 冷冻托盘（Tissue Tek II 冷冻板） | 赛默飞世尔科技公司 | NC9491941 | 于 -20 °C 保存 |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院（免费下载） | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| 甲醛（37%） | 赛默飞世尔科技公司 | F79-500 | 用 PBS 稀释至 10% |
| BD Bacto 琼脂 | 赛默飞世尔科技公司 | DF0140-01-0 | 使用加热板在蒸馏水中配制 2% 溶液 |
| Miltex 眼科敷料镊 | MedPlus 公司 | 18-780 | |
| Miltex 眼科剪 | MedPlus 公司 | 18-1430 | 弯曲尖端可在打开结肠时防止损伤组织。 |
| 阿尔新蓝 8GX（粉末） | Sigma Aldrich | A5268 | 将 1 g 粉末加入 100 ml 3% 乙酸溶液中（3 ml 冰乙酸 + 97 ml 蒸馏水） |
| 1 mL 结核菌素注射器，配 26 G × 3/8 英寸皮内斜面针头 | BD | 305946 | 用于 AOM 注射 |
参考文献
- Ekbom, A. Ulcerative colitis and colorectal cancer. A population-based study. N. Engl. J. Med. 323, 1228-1233 (1990).
- Terzic, J. Inflammation and colon cancer. Gastroenterology. 138, 2101-2114 (2010).
- Ullman, T. A., Itzkowitz, S. H.
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