考虑到唾液取样在未来的临床应用，研制了一种棒棒糖状的超滤（LLUF）探针，以适应人口腔结构。通过NanoLC-LTQ质谱对未经消化的唾液进行直接分析，证明LLUF探针能够去除大分子蛋白和高丰度蛋白，从而使低丰度肽段更易于被检测到。
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摘要
摘要
尽管人类唾液蛋白质组和肽组已被揭示1-2，但这些成分主要来源于唾液蛋白质经胰蛋白酶消化后的鉴定。由于人体唾液中的内源性肽段在疾病诊断、疾病进展预测以及治疗效果监测方面具有潜在价值，因此迫切需要在不使用外源酶预先消化的情况下，直接鉴定人类唾液的内源性肽组。合适的样本采集是提高人类唾液内源性肽组鉴定效果的关键步骤。传统的人类唾液采样方法通常包括离心去除碎片3-4，但该过程可能耗时过长，难以适用于临床实践。此外，通过离心去除碎片可能无法有效清除大多数感染性病原体，也无法去除高丰度蛋白质，而这些高丰度蛋白质常常会阻碍低丰度肽组的鉴定。
传统的蛋白质组学方法主要采用二维凝胶电泳（2-DE）结合胶内消化技术，能够鉴定出多种唾液蛋白质5-6。然而，该方法通常灵敏度不足，难以检测低丰度的肽段或蛋白质。基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）的蛋白质组学是一种无需预先进行2-DE分离即可鉴定蛋白质的替代方法。尽管该方法具有更高的灵敏度，但通常需要在分析前对样品进行预分级7以及胰蛋白酶预消化，这限制了其在临床中的应用。
为克服质谱分析中因样品制备带来的障碍，我们开发了一种称为毛细管超滤（capillary ultrafiltration, CUF）探针的技术8-11。实验室数据显示，CUF探针能够以动态且微创的方式从动物体内多种微环境中原位捕获蛋白质8-11。由于在样品采集过程中仅需通过注射器回抽即可产生负压，因此无需离心步骤。CUF探针与液相色谱-质谱联用（LC-MS）已成功鉴定出经胰蛋白酶消化后的蛋白质8-11。在本研究中，我们对超滤采样技术进行了改进，设计出一种棒棒糖状超滤（lollipop-like ultrafiltration, LLUF）探针，可轻松置于人口腔内。无需胰蛋白酶消化的直接LC-MS分析表明，人唾液中天然存在大量来源于多种蛋白质的肽段片段。使用LLUF探针采集唾液样品可避免离心操作，同时有效去除许多分子量较大且丰度较高的蛋白质。质谱分析结果表明，在利用LLUF探针滤除大分子蛋白质后，大量低丰度肽段得以被检测到。低丰度唾液肽段的检测不依赖于多步骤的色谱分离过程。在临床应用方面，LLUF探针结合LC-MS技术未来有望用于通过唾液监测疾病进展。
方案
1. LLUF 探针的制备
- 使用环氧树脂将聚醚砜膜（2 cm2）粘合在聚丙烯三角桨片（University of California, San Diego）的边缘，实现密封。实验采用带负电荷、截留分子量（MWCO）为30 kDa的聚醚砜膜。
- 将特氟龙氟化乙烯丙烯管（内径/外径，0.35/0.50 cm）连接至聚丙烯三角桨片的圆柱形出口，以便将LLUF探针连接至20 ml注射器。
- 将聚醚砜膜浸泡于培养皿（直径50 mm）中的人类唾液后，通过抽拉注射器产生负压。在负压作用下，注射器驱动超滤过程，实现唾液中蛋白质的采样。
- 探针在使用前用70%酒精灭菌过夜。为验证密封性良好，将LLUF探针置于含蓝色葡聚糖（50 mg/ml，平均分子质量为2,000 kDa）的溶液中2小时。收集样品中未检出蓝色葡聚糖，表明探针制备和采样过程中无泄漏发生。
2. 唾液采集
- 从三名健康志愿者（两名男性和一名女性，年龄在20至40岁之间）收集全唾液，这些志愿者未服用任何药物，且无明显牙龈炎或龋齿症状6。
- 用水漱口后，通过自然吐出的方式收集全唾液样本，不进行化学刺激，并将样本收集至冰浴冷却的容器中。
- 所有样本混合后，在采集过程中始终保持在冰上。
- 采集后立即取唾液（200 μl）用于LL....
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讨论
我们发现，人类未消化的唾液中存在大量肽段。这些肽段来源于多种富含脯氨酸的蛋白质、肌动蛋白、α-淀粉酶、α1-珠蛋白、β-珠蛋白、组氨肽1、角蛋白1、黏蛋白7、聚合免疫球蛋白受体、萨瑟肽、S100A9等。产生具有未确定切割位点的肽段可能受多种因素影响。例如，某些肽段可能天然存在于人全唾液中。已鉴定出许多具有-PQ羧基末端的肽段表1以及补充表1和2。富含脯氨酸的蛋白质可分为酸性、碱性或糖基化蛋白质，由位于单一区域的六个基因编码17由等位基因变异、差异性RNA剪接、蛋白水解加工以及翻译后修饰产生的富含脯氨酸的蛋白质有三十多种 17分泌后，酸性富含脯氨酸的蛋白质会迅速附着于牙齿表面，并通过牙菌斑的蛋白水解作用降解为潜在的天然免疫肽 18-19革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表达多种糖苷酶和蛋白酶 18已有报道称，酸性富含脯氨酸的蛋白质可在口腔中被降解为具有潜在类先天免疫活性的肽段 链球菌 和 放线菌属 物种 18谷氨酰胺（Gln）-甘氨酸（Gly）裂解在生物学上具有重要意.......
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致谢
本研究工作得到了美国国立卫生研究院基金（R01-AI067395-01、R21-R022754-01 和 R21-I58002-01）的支持。我们感谢 C. Niemeyer 对稿件的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚醚砜膜 | Pall Corporation | 30 kDa 截留分子量 | |
| 聚四氟乙烯氟化乙烯丙烯管 | Upchurch Scientific | ||
| 蓝色葡聚糖 | Sigma | ||
| 纳升液相色谱系统 | Eksigent | ||
| C18 捕获柱 | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ 线性离子阱质谱仪 | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| 乙腈-0.1% 甲酸 | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS 级 |
| 水-0.1% 甲酸 | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS 级 |
参考文献
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098<....
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