方法文章

使用棒棒糖式超滤探针采集人口腔内源性唾液肽组：简化并增强临床质谱中的肽段检测

DOI：

10.3791/4108

⸱

2012年8月7日

 ,  , 
1Sanford-Burnham Medical Research Institute, 2Division of Dermatology, University of California, San Diego , 3VA San Diego Healthcare Center, 4Moores Cancer Center, University of California, San Diego

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

考虑到唾液取样在未来的临床应用，研制了一种棒棒糖状的超滤（LLUF）探针，以适应人口腔结构。通过NanoLC-LTQ质谱对未经消化的唾液进行直接分析，证明LLUF探针能够去除大分子蛋白和高丰度蛋白，从而使低丰度肽段更易于被检测到。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尽管人类唾液蛋白质组和肽组已被揭示1-2，但这些成分主要来源于唾液蛋白质经胰蛋白酶消化后的鉴定。由于人体唾液中的内源性肽段在疾病诊断、疾病进展预测以及治疗效果监测方面具有潜在价值，因此迫切需要在不使用外源酶预先消化的情况下，直接鉴定人类唾液的内源性肽组。合适的样本采集是提高人类唾液内源性肽组鉴定效果的关键步骤。传统的人类唾液采样方法通常包括离心去除碎片3-4，但该过程可能耗时过长，难以适用于临床实践。此外，通过离心去除碎片可能无法有效清除大多数感染性病原体，也无法去除高丰度蛋白质，而这些高丰度蛋白质常常会阻碍低丰度肽组的鉴定。

传统的蛋白质组学方法主要采用二维凝胶电泳（2-DE）结合胶内消化技术，能够鉴定出多种唾液蛋白质5-6。然而，该方法通常灵敏度不足，难以检测低丰度的肽段或蛋白质。基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）的蛋白质组学是一种无需预先进行2-DE分离即可鉴定蛋白质的替代方法。尽管该方法具有更高的灵敏度，但通常需要在分析前对样品进行预分级7以及胰蛋白酶预消化，这限制了其在临床中的应用。

为克服质谱分析中因样品制备带来的障碍，我们开发了一种称为毛细管超滤（capillary ultrafiltration, CUF）探针的技术8-11。实验室数据显示，CUF探针能够以动态且微创的方式从动物体内多种微环境中原位捕获蛋白质8-11。由于在样品采集过程中仅需通过注射器回抽即可产生负压，因此无需离心步骤。CUF探针与液相色谱-质谱联用（LC-MS）已成功鉴定出经胰蛋白酶消化后的蛋白质8-11。在本研究中，我们对超滤采样技术进行了改进，设计出一种棒棒糖状超滤（lollipop-like ultrafiltration, LLUF）探针，可轻松置于人口腔内。无需胰蛋白酶消化的直接LC-MS分析表明，人唾液中天然存在大量来源于多种蛋白质的肽段片段。使用LLUF探针采集唾液样品可避免离心操作，同时有效去除许多分子量较大且丰度较高的蛋白质。质谱分析结果表明，在利用LLUF探针滤除大分子蛋白质后，大量低丰度肽段得以被检测到。低丰度唾液肽段的检测不依赖于多步骤的色谱分离过程。在临床应用方面，LLUF探针结合LC-MS技术未来有望用于通过唾液监测疾病进展。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. LLUF 探针的制备

  1. 将聚醚砜膜（2 cm2）用三角形聚丙烯桨叶（加州大学圣地亚哥分校）密封，方法是在桨叶边缘用环氧树脂将膜粘合固定。使用一种带负电荷、截留分子量（MWCO）为30 kDa的聚醚砜膜。
  2. 将一根聚四氟乙烯氟化乙烯丙烯管（内径/外径，0.35/0.50 cm）连接至三角形聚丙烯桨叶的圆柱形出口，以便将LLUF探针连接至20 ml注射器。
  3. 将聚醚砜膜在培养皿（直径50 mm）中的人体唾液中浸泡后，通过抽拉注射器产生负压。带负压的注射器驱动超滤过程，用于从唾液中采集蛋白质。
  4. 探针在使用前用70%酒精灭菌过夜。为验证密封良好，我们将LLUF探针置于含有蓝色葡聚糖（50 mg/ml，平均分子质量为2,000 kDa）的溶液中2小时。采集样本中未检测到蓝色葡聚糖，表明探针制备和采样过程中无泄漏发生。

2. 唾液采集

  1. 从三名健康志愿者（两名男性和一名女性，年龄在20至40岁之间）收集全唾液样本，这些志愿者未服用任何药物，且无明显牙龈炎或龋齿症状6。
  2. 用水漱口后，通过自然吐出口腔内的唾液方式收集全唾液样本，不进行化学刺激，并将样本收集至冰浴冷却的容器中。
  3. 所有样本混合后，在采集过程中始终保持在冰上保存。
  4. 采集后立即取200 μl唾液用于LLUF探针采样，采样在4 °C的环境中进行。
  5. 含或不含LLUF探针采集的唾液蛋白（1.0 μg/μl）均直接进行纳米液相色谱-质谱分析，无需胰蛋白酶消化。蛋白质浓度采用Bio-Rad蛋白质测定法测定12。

3. 纳升液相色谱-线性离子阱质谱分析

  1. 未消化的唾液样本（5 μl）通过自动进样器直接上样至Eksigent NanoLC系统的捕获柱，使用100%缓冲液A（2%乙腈/0.1%甲酸）。NanoLC系统在线连接Finnigan LTQ质谱仪。
  2. 样本上样并清洗后，切换阀门，以500 nl/min的流速对捕获柱和分离柱（长度10 cm，内径100 μm，自制填充Synergi 4 μm C18填料）施加线性梯度洗脱。梯度在45分钟内从0%至50%缓冲液B（80%乙腈/0.1%甲酸）。
  3. NanoLC-LTQ MS仪器在Xcalibur软件控制下以数据依赖模式运行。对强度高于1 × 105的前四个最强MS离子进行MS/MS谱图采集，启用动态排除，碰撞能量设为35%。
  4. 每个样本均由NanoLC-LTQ MS系统重复运行两次，共使用三个独立制备的样本。在三个独立样本中均可检测到的肽段列于补充表1和表2中。NanoLC-LTQ MS谱图的代表性示例见图3。

4. 数据分析与蛋白质数据库搜索

  1. 每个 RAW 文件均使用 Readw.exe 转换为 mzXML 文件。
  2. 将 mzXML 文件输入 SEQUEST Sorcerer 2 系统，并针对由美国国家生物技术信息中心（NCBI）蛋白质数据库生成的人源数据库进行搜索，酶切特异性设为非特异性。母离子的质量容差设为 1.5 Da。为考虑甲硫氨酸氧化，在差异搜索中为其分子质量增加 16 Da。
  3. 在 SEQUEST 搜索之后，结果由 PeptideProphet 和 ProteinProphet [系统生物学研究所 (ISB)] 自动进行过滤、验证和展示。PeptideProphet 基于 SEQUEST 得分（Xcorr， ΔCn、Sp、RSp）以及所鉴定的每条肽段序列的附加信息。ProteinProphet 根据分配给 MS/MS 谱图的肽段，为每种蛋白质计算了一个从 0 到 1 的概率得分。
  4. 为尽量减少假阳性鉴定，我们采用了严格的筛选标准。首先，设定可接受肽段的最低 P 值得分阈值为 0.8，以确保极低的错误率（远低于 3%）并保持合理的高灵敏度。其次，排除所有含有 >0.8 的 P 值必须同时具有较高的交叉相关（Xcorr）得分：对于 +1、+2 和 +3 电荷态，分别为 1.9、2.2 和 3.0。

5. 使用 LLUF 探针去除口腔细菌

  1. 为确定LLUF探针对口腔细菌的清除能力，将LLUF探针采集前后（第3节）的唾液涂布于琼脂平板上进行细菌检测。
  2. 需氧细菌在无抗生素的Lauria-Bertani（LB）琼脂平板上于37 °C培养一天。
  3. 厌氧细菌在无抗生素的Brucella肉汤琼脂平板（BD，Sparks，MD）上，使用Gas-Pak（BD Biosciences，San Jose，CA）在37 °C厌氧条件下培养一天。

6. 代表性结果

1. LLUF 探针的制备及在模拟口腔环境中采集唾液

如果采集唾液的过程可以像吮吸棒棒糖一样完成，该方法将避免唾液在收集装置中发生降解13-14。更重要的是，这还将实现对患者口腔环境的动态和局部监测。此外，如果能够简化基于唾液的样本前处理过程，临床医生将能更便捷地实施该操作，从而加快下一步临床决策的制定。质谱分析是检测甚至在极短时间内对蛋白质进行测序的最灵敏技术之一。然而，复杂的样本前处理步骤限制了该技术在临床中的应用。此外，已知临床样本中高丰度蛋白或高分子量蛋白（例如唾液中的淀粉酶）会在质谱分析中掩盖低丰度蛋白15-16。为克服上述障碍，我们开发了一种名为LLUF探针的棒棒糖状超滤装置（图1）。将一片分子截留量为30 kDa的带负电荷聚醚砜膜（图1A，a）粘附于聚丙烯桨状柄上（图1A，b），并置于LLUF探针前端，用于过滤唾液中的大分子蛋白。为了模拟人口腔环境（图1A，g），将一块海绵（图1A，e）浸入培养皿中的唾液（图1A，f）内。在完全回抽注射器（图1A，d）后，过滤后的唾液开始沿连接管（图1A，c）流动并被收集。

2. 通过 NanoLC-LTQ 质谱鉴定本土唾液肽组

通过比较液相色谱图，我们发现唾液在使用LLUF采样前后的色谱图存在明显差异（图2），表明LLUF采样后唾液中的蛋白质组成发生了变化。为了确定蛋白质组成，我们采用了NanoLC-LTQ质谱分析技术，该技术已知能够快速对多种蛋白质混合物中的肽段进行测序。更重要的是，为了简化临床应用中的样品制备流程，我们直接将未经化学或酶解处理的全唾液用于NanoLC-LTQ MS分析。出乎意料的是，在未消化的唾液中鉴定出131个肽段（补充表1）。这些肽段来源于多种富含脯氨酸的蛋白质、肌动蛋白、α-淀粉酶、α1-珠蛋白、β-珠蛋白、组蛋白1、角蛋白1、黏蛋白7、聚合免疫球蛋白受体、唾液富酪蛋白以及S100A9。而在经过LLUF探针过滤后的唾液中，共鉴定出26个独特的肽段（补充表2），这些肽段主要来源于各种富含脯氨酸的蛋白质。来源于聚合免疫球蛋白受体（83.24 kDa）和α-淀粉酶等蛋白质的肽段则无法检测到，这证明了LLUF探针在去除大分子量且高丰度蛋白质方面的有效性。对应于α-淀粉酶内部肽段PFIAIHAEAESKL的MS/MS质谱图如图3A所示。最引人注目的是，在去除大分子蛋白质后，LLUF探针采集的唾液中可检测到26个测序肽段中的18个（表1）。这18个肽段来源于富含脯氨酸的蛋白质或假设蛋白质，其C末端为脯氨酸（P）-谷氨酰胺（Q）（-PQ）、-SR、-SP或-PP结构。图3B展示了在LLUF探针采样的唾液中检测到的PQGPPQQGGHPRPP肽段的MS/MS质谱图。该肽段可能来源于富含脯氨酸的蛋白质HaeIII亚家族1和2（表1）。

figure-protocol-1
图1. LLUF探针的组成及模拟人口腔中全唾液的采集。图A：(a) 截留分子量为30 kDa的半透性聚醚砜膜；(b) 聚丙烯桨片；(c) 聚四氟乙烯氟化乙烯丙烯共聚物管；(d) 20 ml注射器。图B：将一块海绵(e)（模拟舌体）浸入盛有人类唾液的培养皿(f)中，以构建人工口腔环境(g)。通过完全抽拉注射器产生的负压，使采集的液体沿连接管(箭头)流动并进入注射器内的空腔(箭头所示端点)。标尺：2.0 cm。

figure-protocol-2
图2. 唾液在LLUF采样前后的差异LC/MS/MS色谱图。 人全唾液中的蛋白质（1.0 μg/μl）经LLUF探针过滤或不经过滤处理。未进行胰蛋白酶消化的蛋白质直接上样至NanoLC-LTQ质谱系统，该系统与Eksigent Nano LC系统连接，具体操作如材料与方法部分所述。图中展示了LLUF采样前（A）和采样后（B）唾液的基峰色谱图（保留时间为44分钟）。

figure-protocol-3
图3. 通过 NanoLC-LTQ MS 测序检测唾液肽组。 如实验方法所述，使用 NanoLC-LTQ MS 分析了使用 LLUF 探针采集前（A）和采集后（B）的唾液蛋白。未经过胰蛋白酶消化的天然人唾液来源的唾液肽组数据见补充表1和2。一条来源于α-淀粉酶的肽段（PFIAIHAEAESKL）仅在未使用 LLUF 探针采集的唾液样本中被检测到（A），表明 LLUF 探针对大分子蛋白具有去除能力。许多具有-PQ、-SR、-SP 或 -PP C-末端的肽段仅存在于经 LLUF 探针超滤后的样本中。其中一条来源于多种富含脯氨酸蛋白的肽段（PQGPPQQGGHPRPP）如图（B）所示。MS/MS 谱图中特征性的“y”和“b”系列离子确认了这两个肽段的身份。

figure-protocol-4
图4. 使用LLUF探针去除口腔细菌。LLUF探针的构建方法如材料与方法部分所述。将探针置于模拟口腔环境的人类唾液中（图1）。通过回抽LLUF探针末端的注射器产生负压，驱动唾液取样的超滤过程。在取样过程中，全唾液选择性地穿过聚醚砜膜，并在注射器内部积聚。未经LLUF探针取样的全唾液作为对照。分别取LLUF探针取样前后的唾液各10 μl，涂布于琼脂平板上用于细菌检测。图A：将经过（+LLUF）和未经（-LLUF）LLUF探针取样的唾液并排涂布于无抗生素的LB琼脂平板，在37 °C下培养一天。图B：将经过和未经LLUF探针取样的唾液分别涂布于无抗生素的布氏肉汤琼脂平板，在厌氧条件下使用Gas-Pak（BD Biosciences，San Jose，CA）于37 °C培养一天。经LLUF探针取样的唾液未在琼脂平板上形成菌落，表明LLUF探针能够有效清除需氧及厌氧的口腔细菌。标尺：1.0 cm。

 肽序列/测定肽质量登录号名称
1AGNPQGPSPQGGNKPQ
GPPPPPGKPQ
2485.3		gi|41349484富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体2前体
  gi|41349482富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体1前体
  gi|60301553富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族2
2GGHQQGPPPPPPGKPQ
1576.9		gi|4826944富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族2
  gi|9945310富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族1
3GPPPAGGNPQQPQAPPA
GKPQGPPPPPQGGRPP
3126.2		gi|37537692富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族4前体
4GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ
2028.3		gi|113423660预测：假定蛋白
5GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP
2077.8		gi|113423262预测：假定蛋白异构体5
  gi|41349482富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体1前体
  gi|60301553富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族2
  gi|113423663预测：假定蛋白
  gi|41349484富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体2前体
  gi|41349486富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体3前体
6GPPPPPPGKPQGPPPQ
GGRPQGPPQGQSPQ
2918.5		gi|9945310富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族1
7GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ
2131.3		gi|113423660预测：假定蛋白
8GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ
2030		gi|113423663预测：假定蛋白
  gi|41349482富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体1前体
  gi|113423262预测：假定蛋白异构体5
  gi|60301553富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族2
9GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ
1866.6		gi|4826944富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族2
10GPPQQGGHPPPPQGRPQ
1713.8		gi|9945310富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族1
  gi|4826944富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族2
11GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ
2083.1		gi|9945310富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族1
  gi|4826944富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族2
12GRPQGPPQQGGHQQGP
PPPPPGKPQ
2512.6		gi|4826944富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族2
  gi|9945310富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族1
13NKPQGPPPPGKPQGPP
PQGGSKSRSSR
2720.2		gi|113423262预测：假定蛋白异构体5
  gi|113423663预测：假定蛋白
14PQGPPQQGGHPRPP
1450.1		gi|9945310富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族1
  gi|4826944富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族2
15QGRPQGPPQQGGHPRPP
1791.1		gi|4826944富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族2
  gi|9945310富含脯氨酸蛋白HaeIII亚家族1
16SPPGKPQGPPPQ
1186.9		gi|113423262预测：假定蛋白异构体5
  gi|41349482富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体1前体
  gi|60301553富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族2
  gi|113423663预测：假定蛋白
  gi|41349484富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体2前体
  gi|41349486富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体3前体
17SPPGKPQGPPPQGGNQ
PQGPPPPPGKPQ
2720.3		gi|113423663预测：假定蛋白
  gi|41349482富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1异构体1前体
  gi|113423262预测：假定蛋白异构体5
  gi|60301553富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族2
18SPPGKPQGPPQQEGNKPQ
1870.9		gi|37537692富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族4前体

表1. 肽类仅在LLUF采集的样本中可被检测到。

补充表 1. 点击此处查看补充表 1。

补充表 2。 请点击此处查看补充表 2。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们发现，人类未消化的唾液中存在大量肽段。这些肽段来源于多种富含脯氨酸的蛋白质、肌动蛋白、α-淀粉酶、α1-珠蛋白、β-珠蛋白、组氨肽1、角蛋白1、黏蛋白7、聚合免疫球蛋白受体、萨瑟肽、S100A9等。产生具有未确定切割位点的肽段可能受多种因素影响。例如，某些肽段可能天然存在于人全唾液中。已鉴定出许多具有-PQ羧基末端的肽段表1以及补充表1和2。富含脯氨酸的蛋白质可分为酸性、碱性或糖基化蛋白质，由位于单一区域的六个基因编码17由等位基因变异、差异性RNA剪接、蛋白水解加工以及翻译后修饰产生的富含脯氨酸的蛋白质有三十多种 17分泌后，酸性富含脯氨酸的蛋白质会迅速附着于牙齿表面，并通过牙菌斑的蛋白水解作用降解为潜在的天然免疫肽 18-19革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表达多种糖苷酶和蛋白酶 18已有报道称，酸性富含脯氨酸的蛋白质可在口腔中被降解为具有潜在类先天免疫活性的肽段 链球菌 和 放线菌属 物种 18谷氨酰胺（Gln）-甘氨酸（Gly）裂解在生物学上具有重要意...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究工作得到了美国国立卫生研究院基金（R01-AI067395-01、R21-R022754-01 和 R21-I58002-01）的支持。我们感谢 C. Niemeyer 对稿件的审阅。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚醚砜膜Pall Corporation30 kDa 截留分子量
聚四氟乙烯氟化乙烯丙烯管Upchurch Scientific
蓝色葡聚糖Sigma
纳升液相色谱系统Eksigent
C18 捕获柱Agilent5065-9913
LTQ 线性离子阱质谱仪Thermo Fisher
Sorcerer 2Sage-N Research
乙腈-0.1% 甲酸J.T. Baker9832-03LC/MS 级
水-0.1% 甲酸J.T. Baker9834-03LC/MS 级

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
  2. Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
  3. Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
  4. Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
  5. Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
  6. Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
  7. Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
  8. Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
  9. Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
  10. Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
  11. Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
  12. Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
  13. Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
  14. Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
  15. Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
  16. Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
  17. Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
  18. Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
  19. Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
  20. Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
  21. Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
  22. Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
  23. Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
  24. Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
  25. Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
  26. Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
  27. Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
  28. Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
  29. Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
  30. Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
  31. Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
  32. Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
  33. Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
  34. Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
  35. Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
  36. Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
  37. Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
  38. Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章