本文描述了一种利用HMBA树脂上“安全捕获”裂解方法高效固相合成功能化双肽三聚体的方案。
本文内容
摘要
摘要
1962年，R.B. Merrifield 发表了首个采用固相多肽合成法高效合成多肽的新途径。该技术在时间和劳动成本方面迅速显示出优于其液相前体方法的优势。在过去五十年中，关于固相载体性质、所用保护基团以及偶联方法的不断改进，进一步提升了Merrifield原始体系的实用性。如今，最常用的多肽合成方法主要包括由R.C. Sheppard开创的Boc保护基与碱/亲核试剂可裂解树脂策略，或Fmoc保护基与酸可裂解树脂策略1。
受 Merrifield 固相合成策略的启发，我们开发了一种用于组装功能化双肽的 Boc/叔丁基固相合成策略2，本文对此进行了描述。与溶液相方法相比，固相合成不仅如 Merrifield1所述在时间和劳动方面具有优势，而且更便于双肽库的合成。我们在此展示的合成方法包含一个最终裂解步骤，采用两步“安全捕获”机制，通过二酮哌嗪的形成将功能化双肽从树脂上释放出来。
双肽是一类刚性的螺环梯状双氨基酸低聚物，其功能基团的排列方式具有可预测性和可设计性，由单体单元的类型、立体化学性质以及各单体之间的连接方式所控制。每个双氨基酸均为立体化学纯的环状骨架结构，包含两个氨基酸（即带有α-氨基的羧酸）3,4。本实验室目前正在研究功能化双肽在催化、蛋白质-蛋白质相互作用以及纳米材料等多个领域的潜在应用。
方案
1. 实验准备
- 固相合成反应的装置是一个聚丙烯过滤筒或玻璃反应器，通过聚丙烯管路连接至真空条件下的封闭式抽滤瓶，如图1所示。反应可通过磁力搅拌子搅拌，或通过向反应器中通入氮气鼓泡实现混合。
- 建议使用连接至氩气钢瓶的气体分配系统，并配备干燥管和油封鼓泡器，以便在惰性气氛下进行反应，并可方便地从密闭容器中移除试剂。
- 所有操作均应在通风橱中进行，并需佩戴适当的个人防护装备（安全眼镜、实验服和腈类手套）。
2. 将第一个双肽加载到树脂上
- 将 114 mg HMBA-AM 树脂（载量 0.88 mmol/g，100 μmol）称取至 8 mL 反应瓶中，并加入磁力搅拌子。用橡胶塞密封反应瓶口，通入氩气至少 5 分钟以充分吹扫管路。
- 同时，将 117.3 mg 化合物 1（见图 3，586.63 g/mol，2 当量）和 59.2 mg 1-(均三甲苯-2-磺酰基)-3-硝基-1,2,4-三唑（MSNT，296.0 g/mol，2 当量）称取至一个 15 mL 一次性离心管中，加入 2 mL 无水二氯甲烷（DCM）溶解。向溶液中加入 24 μL 1-甲基咪唑（NMI，80.81 mL/mol，3 当量），混合至完全溶解。
- 用注射器将活化后的溶液转移至反应瓶中，在氩气氛围下搅拌过夜（约 10 小时）。
- 取下橡胶塞，排空反应混合物。用二氯甲烷（DCM）洗涤树脂 5 次，再用二甲基甲酰胺（DMF）洗涤 5 次。按照第 10.1 节所述进行“甲基红测试”，以评估树脂的载量程度。若甲基红测试中树脂仍呈红色，则应重复步骤 2.2 和 2.3。理想的测试结果为黄色，表明甲基红测试阴性；但由于下一步中所有残留的羟基将被封闭，因此轻微阳性结果（树脂呈浅橙色）也可接受。
3. 第一个双肽的脱保护及同时进行的树脂封端
- 向反应容器中加入 1 mL DCM，然后在 30 秒内逐滴加入 1 mL 33% 溴化氢的乙酸溶液（出现冒泡现象），搅拌 15 分钟。排液后用 DCM 洗涤树脂（5 次），再重复此过程一次。
- 用 DCM 洗涤树脂（5 次），然后用 DMF 洗涤（5 次）。用 5% v/v N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）的 DMF 溶液洗涤树脂两次以中和，再用 DCM（5 次）和 DMF（5 次）洗涤。进行第 10.1 和 10.2 节中所述的“甲基红试验”和“氯醌试验”。甲基红试验结果应为阴性，氯醌试验结果应为阳性。
4. 偶联Boc/tBu保护的功能化双氨基酸
- 通过用无水二氯甲烷（DCM）冲洗三次，向含有树脂的反应容器中重新引入惰性气氛，然后安装橡胶隔膜和氩气管线。加入1-2 mL无水DCM，搅拌30秒，随后排空容器直至氩气管线的鼓泡器开始上升，以此对容器进行吹扫和清洗。此步骤至少重复一次。
- 在氩气氛围下，于火焰干燥的试管中配制0.15 M功能化双氨基酸（3当量）与245 mg 1-羟基-7-氮杂苯并三唑（HOAt，136.11 g/mol，18当量）溶于2 mL 2:1 DCM:DMF的溶液。加入47 μL二异丙基碳二亚胺（DIC，156.6 mL/mol，3当量），搅拌90分钟。
- 将35 μL N,N-二异丙基乙胺（DIPEA，174.19 mL/mol，2当量）溶于666 μL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）后加入树脂中，搅拌5分钟。
- 用注射器将预活化的双氨基酸溶液转移至反应容器中，持续搅拌过夜。
- 排空反应混合物，并在氩气氛围下用无水DCM洗涤两次。
- 为促进二酮哌嗪环的闭环反应，加入4 mL含0.25 M HOAt（136.11 g/mol，10当量）和DIC（156.6 mL/mol，10当量）的1:1 DCM:DMF溶液，在氩气氛围下搅拌1小时。
- 移除橡胶隔膜，排空反应混合物。依次用DCM（5次）和DMF（5次）洗涤树脂。如需要，可进行第10.2节所述的“氯醌试验”。
5. 脱除 Boc/tBu 保护的官能化双氨基酸的保护基
- 向反应容器中加入 2 mL 95:5 的三氟乙酸（TFA）: 三异丙基硅烷（TIPS）溶液，搅拌反应 1 小时。用二氯甲烷（DCM）洗涤树脂约 30 秒（5 次），然后重复此过程一次。
- 用二氯甲烷（DCM）洗涤树脂（5 次），再用 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤（5 次）。用 5% v/v 的 N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）DMF 溶液洗涤两次以中和树脂，随后再次用二氯甲烷（DCM）洗涤（5 次）和 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤（5 次）。如需要，可进行第 10.2 节中所述的“氯萘试验”。
6. 根据需要重复步骤 4 和 5，以合成目标双肽。
7. 双肽脯氨酸末端的功能化
- 生长中的双肽的脯氨酸末端可通过二酮哌嗪独立或同时进行酰化。此外，该末端也可保留保护基团，后续再行裂解，从而得到游离氨基酸。如需评估偶联效率，可进行第10.2节中所述的“氯醌试验”。
8. 双肽季铵末端的Fmoc脱保护与酰化
- 加入2 mL含20%哌啶的DMF溶液，混合反应20分钟。抽干后用DMF洗涤树脂（5次），再重复此过程一次。
- 用DCM洗涤树脂（5次），然后用DMF洗涤（5次）。
- 在2 mL N-甲基吡咯烷酮（NMP）中配制0.15 M氨基酸（3当量）溶液，加入114 mg 2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU，380.2 g/mol，3当量）和104.5 μL N,N-二异丙基乙胺（DIPEA，174.19 mL/mol，6当量），充分混合。将该溶液加入反应容器中，搅拌反应6小时。
- 用DCM洗涤树脂（5次），然后用DMF洗涤（5次）。
9. 从树脂结合的氨基酸上脱除Boc基团并从树脂上裂解
- 向反应容器中加入 2 mL 1:1 的 TFA:DCM 溶液，搅拌 30 分钟。滤出溶液，并用 DCM 洗涤树脂（5 次），然后重复此过程一次。
- 用 DCM 洗涤树脂并排干 30 秒（5 次），再用 DMF 洗涤并排干（5 次）。
- 加入 2 mL 含 10% DIPEA 的无水 DMF 溶液，搅拌 24–48 小时。
- 将反应混合物收集至预先称重的圆底烧瓶中。取 30 μL 该溶液转移至含有 450 μL THF 的 LC-MS 小瓶中，送样进行分析。用额外的 DMF 份量洗涤树脂，并将洗涤液收集至圆底烧瓶中，然后在减压下除去溶剂。
10. 双肽的纯化
- 将粗品双肽溶于最小量的二甲基亚砜（100–250 μL）中，转移至HPLC小瓶内插管。将内插管放入配备XTerra Prep MS C18 5 μm 7.8×150 mm色谱柱和100 μL进样环的半制备型HPLC系统（Hewlett Packard 1100系列）自动进样器中。
- 使用水-乙腈（含0.1%甲酸）梯度程序（5–95%乙腈，30分钟内）对样品进行多次50 μL进样，并在274 nm处监测。将产物峰收集至预先称重的一次性离心管中，使用冷冻干燥机冻干。首次运行时应谨慎操作，因为与分析型LCMS相比，通常会观察到峰保留时间的轻微偏移。
11. 评估方法
- 甲基红试验7：用一次性移液管取约1 mg干燥树脂，冲洗至4 mL反应瓶中。加入含有20 mg甲基红、50 μL N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）和5 mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP）的无水二氯甲烷（DCM）溶液500 μL，搅拌5–10分钟。排干溶液，并用DCM洗涤树脂，直至滤液无色。阳性结果为树脂珠粒保持橙色或红色。
- 氯醌试验12：用一次性移液管将约1 mg干燥树脂转移至小样品瓶中。加入0.8 mM氯醌的DMF溶液和2%乙醛的DMF溶液各3滴，室温下静置5–10分钟。阳性结果为树脂珠粒变为蓝色或紫色。
- 活化陷阱试验：合成过程中产生的活化化合物可通过将少量活化溶液（5–10 μL）转移至含有50 μL吡咯烷的液相色谱-质谱（LC-MS）样品瓶中进行评估。手动混匀数秒（溶液应变为黄色），然后用450 μL四氢呋喃（THF）稀释，并送样进行LC-MS分析。
- 分析型LC-MS：采用配备Waters Xterra MS C18 3.5 μm 4.6 mm × 150 mm色谱柱的HP 1200系列LC-MS系统，通过在30分钟内使用含0.1%甲酸的水-乙腈梯度（5%–95%乙腈）对最终产物和活化中间体进行分析。
12. 代表性结果
提供了粗产物（图4）和纯化产物（图5）的液相色谱-质谱（LCMS）图谱示例。采用上述方法进行纯化，预期收率约为10%。
图 1. 固相合成实验装置示意图。
图 2. 双氨基酸/双肽的相关命名法。
图 3. 总体合成路线。 点击此处查看大图。
图 4a. 粗产物在 274 nm 处的高效液相色谱图。
图 4b. 粗产物峰的质谱图。
图 5a. 纯化产物在 274 nm 处的高效液相色谱迹线。
图 5b. 纯化产物峰的质谱图。
讨论
本文介绍的合成方法提供了一种利用常见的固相多肽合成技术，从双氨基酸构筑单元合成功能化双肽的途径。这些“Pro4”构筑单元从反式-4-羟基脯氨酸3出发的单体合成具有高度可放大性，已成功在600 mmol（234 g）规模上完成至乙内酰脲阶段（未发表）。一旦获得单体，采用固相技术相较于当前的溶液相方法4可更快速地合成双肽，因其无需进行反应后处理和中间体纯化。
固相合成中的主要挑战在于反应进程的诊断与问题排查，因为中间产物无法被分离出来。这促使了多种比色检测方法的发展，包括用于鉴定树脂上是否暴露有游离胺基（Kaiser试验10）或游离羟基（甲基红试验7）的方法。然而，由于在我们的固相合成中几乎 exclusively 使用仲胺或连接于季碳上的胺基，常用的 Kaiser 试验10通常不适用。在 HMBA 树脂上进行评估的其他方法包括使用肼等亲核试剂进行小规模裂解试验11、通过紫外-可见光谱法监测 Fmoc 基团的定量脱除1,11，以及捕获并分析进入的活化化合物。
固相合成中的另一个常被忽视的问题是操作人员需要重复执行的合成步骤。鉴于此，作者强烈建议在进行任何手动固相多肽合成时，使用电子表格或检查清单。
与常见的α-氨基酸相比，使用双肽（bis-peptides）进行固相合成的难点包括：由于空间位阻可能导致更难的偶联反应、需要在树脂上进行二酮哌嗪环化以及同时脱保护（Boc/tBu；Cbz/tBu）。另一个难点在于，与更常规的方法相比，采用这种“安全捕获”（safety catch）方法时难以实现从树脂上的定量释放。考虑到这些因素，进一步优化该方法是完全可能的，目前我们课题组正在进行相关工作，以改进本文所介绍的方法。
披露
本文的制作和免费访问由美国国防威胁降低局赞助。
致谢
作者谨此感谢 Zachary Z. Brown 博士和 Jennifer Alleva 在该固相合成技术初期开发中的贡献，以及 Matthew F.L. Parker 提供的有益讨论。本工作由美国国防威胁降低局（DOD-DTRA）（项目编号 HDTRA1-09-1-0009）和由 Cephalon, Inc. 资助的 Horst Witzel 奖学金项目支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HMBA-Am 树脂 | Novabiochem, EMD Millipore | 855018 | |
| MSNT | Novabiochem, EMD Millipore | 851011 | |
| NMI | Sigma-Aldrich | 336092 | 有毒，腐蚀性 |
| DCM | Sigma-Aldrich | D65100 | 致癌性 |
| 无水 DCM | Acros Organics | 34846 | 致癌性 |
| 33% 溴化氢乙酸溶液 | Sigma-Aldrich | 248630 | 有毒，腐蚀性，开启时产生烟雾 |
| DIPEA | Sigma-Aldrich | 387649 | 易燃，有毒，腐蚀性 |
| DMF | Fisher Scientific | AC27960 | 易燃，有毒 |
| 无水 DMF | Acros Organics | 34843 | 易燃，有毒 |
| HOAt | GenScript | C01568 | |
| DIC | Acros Organics | BP590 | 易燃，有毒，腐蚀性 |
| TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | 有毒，腐蚀性 |
| TIPS | Acros Organics | 21492 | 易燃，有毒 |
| 哌啶 | Sigma-Aldrich | 104094 | 易燃，有毒，腐蚀性 |
| HATU | GenScript | C01566 | 有毒 |
| NMP | Acros Organics | 36438 | 有毒 |
| DMAP | Novabiochem, EMD Millipore | 851055 | 有毒 |
| 甲基红 | Sigma-Aldrich | 250198 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 401757 | 易燃，有毒，可形成过氧化物 |
| 吡咯烷 | Sigma-Aldrich | P73803 | 易燃，有毒，腐蚀性 |
| 二甲基亚砜 | Fisher Scientific | D1281 | |
| SPPS 反应容器 | Grace | 211108 | |
| LCMS | Agilent Technologies | 1200 系列 | |
| 半制备型液相色谱 | Hewlett-Packard | 1100 系列 | |
| 冷冻干燥机 | Labconco Corp. | 7934027 | |
| 旋转蒸发仪 | Buchi | R-210 系列 | |
| 氩气 | Airgas | AR PP300CT |
参考文献
- Atherton, E., Sheppard, R. C. Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1989).
- Brown, Z. Z., Alleva, J., Schafmeister, C. E. Solid-Phase Synthesis of Functionalized Bis-Peptides. Biopolymers. 96, 578-585 (2010).
- Schafmeister, C. E., Brown, Z. Z., Gupta, S. Shape-Programmable Macromolecules. Acc. Chem. Res. 41, 1387-1398 (2008).
- Brown, Z. Z., Schafmeister, C. E. Synthesis of Hexa- and Pentasubstituted Diketopiperazines from Sterically Hindered Amino Acids. Org. Let. 12, 1436-1439 (2010).
- Nielson, J., Lyngso, L. O. Combinatorial Solid-Phase Synthesis of Balanol Analogues. Tet. Lett. 37, 8439-8442 (1996).
- Blankemeyer-Menge, B., Nimtz, M., Frank, R. An Efficient Method for Anchoring Fmoc-Amino Acids to Hydroxyl-Functionalized Solid Supports. Tet. Lett. 31, 1701-1704 (1990).
- Komba, S., Sasaki, S., Machida, S. A New Colorimetric Test for Detection of Hydroxyl Groups in Solid-Phase Synthesis. Tet. Lett. 48, 2075-2078 (2007).
- Demner, O., Dijkgraaf, I., Schottelius, M., Wester, H. J., Kessler, H. Introduction of Functional Groups into Peptides via N-Alkylation. Org. Lett. 10, 2015-2018 (2008).
- Plas, S. E. V. ander, Van Hoeck, E., Lynen, F., Sandra, P., Madder, A. Toward a New SPE Material for EDCs: Fully Automated Synthesis of a Library of Tripodal Receptors Followed by Fast Screening by Affinity LC. Eur. J. Org. Chem. 11, 1796-1805 (2009).
- Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides. Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).
- Chan, W. C., White, P. D. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2000).
- Vojkovsky, T. Detection of Secondary Amines on Solid-Phase. Peptide Research. 71, 236-237 (1995).
重印与许可
标签
