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方法文章

从Legionella感染的吞噬细胞中纯化病原体液泡

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DOI：

10.3791/4118

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2012年6月19日

 ,  , 
1Max von Pettenkofer-Institut, Ludwig-Maximilians-Universität

本文内容

摘要

本文介绍了一种从变形虫和巨噬细胞中分离和纯化完整含有Legionella的液泡（LCVs）的方法。该两步法包括：首先利用针对细菌性LCV标志物的抗体通过免疫磁性分离富集LCVs，随后通过密度梯度离心进一步纯化。

摘要

机会性病原体Legionella pneumophila是一种抗阿米巴的细菌，也可在肺泡巨噬细胞中增殖，从而引起严重的肺炎——“军团病”1。在原生动物和哺乳动物的吞噬细胞中，L. pneumophila采用一种保守的机制形成特定的、允许复制的区室，即“含Legionella的液泡”（LCV）。LCV的形成依赖于细菌的Icm/Dot IV型分泌系统（T4SS），该系统可将多达275种“效应蛋白”转运至宿主细胞内。这些效应蛋白可调控宿主蛋白和脂质，并与分泌性、内体性和线粒体细胞器相互作用2-4。

LCV的形成是一个复杂、稳健且具有冗余性的过程，难以通过还原论的方式加以理解。需要采用整合性方法来全面认识LCV的形成机制，包括对病原体-宿主因子相互作用及其时空动态进行全局分析。作为实现这一目标的第一步，首先对完整的LCV进行纯化，随后通过蛋白质组学和脂质组学进行分析。

通过液相色谱或二维凝胶电泳联合质谱技术进行的蛋白质组学分析，已用于研究含病原体液泡的组成与形成。这些研究中分离的液泡来源于社会性土壤阿米巴原虫Dictyostelium discoideum或哺乳动物吞噬细胞，其中含有Leishmania5、Listeria6、Mycobacterium7、Rhodococcus8、Salmonella9或Legionella spp.10。然而，这些研究所采用的纯化方案耗时且繁琐，例如需要电子显微镜来分析液泡的形态、完整性和纯度。此外，这些方案并未利用病原体液泡的特异性特征进行富集。

本文所述方法通过使用表达荧光LCV标记物的D. discoideum，并靶向细菌效应蛋白SidC，克服了上述局限。SidC可通过结合磷脂酰肌醇4-磷酸（PtdIns(4)P）特异性锚定于LCV膜上3,11。首先利用针对SidC的亲和纯化的一抗及偶联磁珠的二抗，通过免疫磁珠分离富集LCV；随后再通过经典的Histodenz密度梯度离心进行进一步纯化12,13（图1）。

对分离的 D. discoideum LCV 进行的蛋白质组学研究揭示了超过 560 种宿主细胞蛋白，包括与吞噬性囊泡、线粒体、内质网和高尔基体相关的蛋白，以及若干此前未被发现参与 LCV 形成的 GTP 酶13。通过本文所述方案富集和纯化的 LCV 可进一步用于显微镜分析（免疫荧光、电子显微镜）、生化方法（Western 印迹）以及蛋白质组学或脂质组学研究。

方案

1. LCV 分离的准备工作

  1. 在 LCV 分离前四天，将表达 DsRed-Express 的 Legionella pneumophila13,14 从甘油保存菌种接种至含 5 μg/mL 氯霉素（Cam）的 CYE 琼脂平板上进行划线培养。将细菌在 37 °C 条件下培养。
  2. 在感染前一天，将表达 GFP-钙联蛋白的 D. discoideum 或 RAW264.7 小鼠巨噬细胞以 1 × 107 接种于 75 cm2 组织培养瓶中。D. discoideum 使用含 20 μg/mL G418 的 10 mL HL5 培养基，并在 23 °C 条件下培养变形虫。RAW264.7 巨噬细胞使用含 10% 胎牛血清（热灭活）和 1% 谷氨酰胺的 10 mL RPMI 1640 培养基，在 37 °C 及 5% CO2 条件下培养。每次感染和样本至少使用三个 75 cm2 培养瓶（最少 6 × 107 个细胞）。
  3. 用 CYE 平板上的 L. pneumophila 接种过夜培养物。取一支 15 mL 试管，加入 3 mL AYE 培养基和 5 μg/mL Cam，再加入 100 μL 细菌悬液，使 OD600nm 达到 0.1。将过夜培养物置于 37 °C 摇床中振荡培养 21–22 小时。

2. LCV 分离

  1. 更换 D. discoideum 细胞的培养基以去除抗生素，避免其对后续感染造成干扰。
  2. 测定过夜培养物的 OD 值。细菌在 OD600nm ≥3 时达到最高感染活性，相当于 2 × 109 个细菌/mL。
  3. 通过将约 500 μl 的 L. pneumophila 过夜培养物加入到 10 ml HL5 培养基（D. discoideum）或 10 ml RPMI 1640 培养基（巨噬细胞）中的细胞进行感染，对应的感染复数（MOI）为 50。随后通过在 500 × g 条件下离心 10 分钟使细菌沉降到细胞表面，实现感染同步化。离心后，将 D. discoideum 细胞在 25 °C 培养，RAW264.7 巨噬细胞在 37 °C 和 5% CO2 条件下培养。感染时间 1 小时包含离心步骤。
  4. 感染后移除培养基，并用冰冷的 SorC 缓冲液（用于 D. discoideum）或冰冷的 PBS（用于 RAW264.7 巨噬细胞）洗涤细胞一次，以去除胞外细菌。每瓶中加入 3 mL HS 缓冲液（含蛋白酶抑制剂，Roche），用细胞刮刀收集细胞，并将相应样品汇集至 15 mL 离心管中。
  5. 使用 3 mL 塑料鲁尔锁接头注射器和不锈钢球珠匀浆器进行样品匀浆。确保操作在冰上进行。开始前，先用蒸馏水清洗球珠匀浆器，避免任何去污剂污染，再用冰预冷的 HS 缓冲液冲洗以排除气泡。使用 8 μm 间隙的球珠。
  6. 将前 3 mL 样品吸入注射器并安装至匀浆器上，来回推动样品通过匀浆器九次。之后更换注射器，防止未匀浆材料污染。将匀浆后的样品收集并汇集至 15 mL 离心管中，取 150 μl 样品用于显微镜分析。在处理下一个样品前，拆卸并清洗球珠匀浆器。
  7. 用 2% CS 或 FCS 在 4 °C 条件下于摇床或旋转仪（10–20 rpm）上封闭匀浆液 30 分钟。
  8. 封闭后，加入针对 SidC（稀释比例 1:3000）或其他仅结合 LCV 膜的细菌标志物的亲和纯化一抗。加样前涡旋混匀抗体溶液。在 4 °C 条件下于摇床或旋转仪（10–20 rpm）上孵育 1 小时。
  9. 同时准备 Histodenz 梯度液。每条梯度使用一个 15 mL 离心管，对应一个样品的三个 75 cm2 培养瓶。首先向管中加入 5.75 mL 35% Histodenz 溶液，然后小心地在其上方加入 5.75 mL 10% Histodenz 溶液。之后将离心管水平放置 1 小时。
  10. 匀浆液经封闭剂和一抗孵育后，在 4 °C 条件下以 600 × g 离心 15 分钟，沉淀样品。弃去上清液，将沉淀重悬于 1.5 mL HS 缓冲液中。将样品转移至新的 15 mL 离心管，并取 40 μl 样品留待后续显微镜分析。
  11. 在 4 °C 条件下于摇床上，用 MACS 羊抗兔 IgG 磁珠（稀释比例 1:25）孵育沉淀 30 分钟。同时，将柱子置于 MACS 磁力架上，并用 0.5 mL HS 缓冲液平衡柱子。
  12. 随后将样品加至柱子中。收集 150 μl 穿流液用于后续显微镜分析。用 0.5 mL HS 缓冲液洗涤柱子三次。
  13. 将柱子从磁力架上取下，立即用 0.5 mL HS 缓冲液强力吹打洗脱 LCV。取 20 μl 样品用于显微镜分析。通过免疫磁珠分离纯化步骤，预计每 1 × 107 个感染的 D. discoideum 细胞可获得约 1 × 106 个完整 LCV，洗脱液中 LCV 富集程度约为穿流液的七倍13。
  14. 将 Histodenz 梯度管恢复至垂直位置，并小心地将洗脱液加至顶部。在 4 °C 条件下以 3350 × g 离心 1 小时。
  15. 离心后，使用长玻璃巴氏吸管从离心管底部开始，每次取 1.5 mL 分级收集，共收集八个组分，均从管底取样。在连续的 Histodenz 梯度中无明显可见分层。LCV 的最高产量通常出现在第 4 组分，约为每 1 × 107 个感染的变形虫 2 × 105 个完整 LCV13。少量 LCV 也存在于第 3 和第 5 组分中。因此，每 6 × 107 个感染的 D. discoideum 细胞可获得约 1 × 106 个纯化的完整 LCV13。LCV 的回收可在室温（RT）下进行，且 LCV 在数小时内保持稳定。

3. 收集样品的显微镜分析

  1. 用多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片准备一块24孔平底组织培养板。
  2. 将LCV纯化过程中采集的每个样品以及每份密度梯度组分各150 μl加入24孔板中。每孔加入0.5 mL HS缓冲液以稀释高浓度的Histodenz。随后，将培养板在4 °C下以600 × g离心10分钟。小心吸去上清液，并用4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定样品20分钟。固定后用SorC缓冲液洗涤D. discoideum样品两次，用PBS洗涤RAW264.7巨噬细胞样品两次。
    1. 将表达GFP-calnexin的D. discoideum在LCV分离不同阶段采集的样品，直接用Vectashield等封片剂封固于载玻片上。
    2. 将RAW264.7巨噬细胞在LCV分离不同阶段采集的样品用封闭液（含1% BSA的PBS）在室温下封闭10分钟。使用抗SidC一抗对LCV进行染色，并在湿盒中室温孵育1小时（亲和纯化的兔抗SidC抗体；按1:1000比例溶于封闭液中）。随后用PBS洗涤样品三次。再加入二抗（如Cy5标记的抗兔抗体；按1:200比例溶于封闭液中），在避光湿盒中室温孵育30分钟。最后用PBS洗涤样品三次，并用Vectashield等封片剂封固于载玻片上。
  4. 使用配备适当滤光片的荧光显微镜，分析从表达GFP-calnexin的D. discoideum或RAW264.7巨噬细胞中分离得到的LCV的形态、完整性和数量。

4. 代表性结果

通过免疫亲和分离和密度梯度离心法纯化LCV的质量和产量可通过荧光显微镜进行监测（图1）。图中展示了从D. discoideum或巨噬细胞中分离LCV过程中所收集样品的概览（图2）。L. pneumophila感染的吞噬细胞匀浆液显示出完整的LCV，但也含有大量细胞碎片和胞外细菌。样品离心沉淀后，显微图像与匀浆液相似，有时密度略高。由于完整的LCV应结合在层析柱上，流穿部分主要包含胞外细菌和细胞碎片。从层析柱洗脱后，洗脱液中含有大量完整的LCV。在我们实验条件下，LCV的纯化效果在D. discoideum中优于巨噬细胞。在D. discoideum中，病原体液泡形态更趋圆形，且分离得到的LCV产量比巨噬细胞高出10倍以上（图3）。在完整的巨噬细胞中，用不同抗体染色的LCV形态则显得更为不规则。

显示嗜肺军团菌与Calnexin-GFP相互作用及离心梯度的静态平衡示意图
图1. LCV分离的示意图。A) 利用针对细菌效应蛋白SidC的亲和纯化抗体，通过免疫磁珠分离法分离LCV，该蛋白特异性定位于LCV膜上。使用偶联了次级MACS微珠的抗体和磁铁，从细胞碎片中分离LCV。B) 免疫磁珠分离后，通过Histodenz密度梯度离心进一步纯化LCV。LCV在第4组分中富集。

D. discoideum 和巨噬细胞在蛋白质纯化组分中的显微镜图像：匀浆液、沉淀、流穿液和洗脱液。
图 2. LCV 纯化过程中收集的样品。图中显示了来自 D. discoideum 或巨噬细胞的匀浆液、沉淀、流穿液和洗脱液样品。D. discoideum 表达 GFP-calnexin 信号（绿色，上图）或经抗 SidC 抗体染色的巨噬细胞（青色，下图）中，含有表达 DsRed-Express（红色）的 L. pneumophila。标尺：10 μm。

D. discoideum 和巨噬细胞的显微镜图像，显示用于细胞分析的荧光标记。
图 3. 从 D. discoideum 或巨噬细胞中纯化的 LCV。样品显示的是经 Histodenz 密度梯度离心后第 4 组分，其中 L. pneumophila 表达 DsRed-Express（红色），(A) 来自表达 GFP-calnexin 信号（绿色）的 D. discoideum，或 (B) 来自经抗 SidC 抗体染色（青色）的巨噬细胞。标尺：10 μm。

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讨论

与先前发表的方法相比，本方案基于两个步骤：首先通过免疫磁性分离法分离LCVs，然后通过密度梯度离心进一步纯化LCVs。当使用荧光标记的细菌与表达GFP的细胞或抗体染色时，可通过荧光显微镜方便地追踪LCV的分离过程。此处描述的方案是一种简单直接的方法，能够高效富集高纯度的LCVs。重要的是，在裂解缓冲液中添加蛋白酶抑制剂对RAW264.7巨噬细胞是必需的，但对D. discoideum 则为可选项13。

原则上，只要存在一种特异性且能够选择性定位的标记物用于分离步骤，该方案便可适用于其他病原体或宿主细胞。理想情况下，这种特异标记物应来源于细菌，可被转运至液泡膜并选择性地定位于此。若以宿主细胞标记物为靶点，则可能导致病原体液泡与其他宿主细胞区室共同被非特异性地纯化，从而产生不良结果。

一旦鉴定出病原体液泡的特异性标记物，就需要制备相应的多克隆或单克隆抗体。针对每一种一抗，均需优化其浓度和封闭试剂，因为除胎牛血清（FCS）以外的封闭试剂可能更为合适（例如牛血清白蛋白（BS...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本实验室的研究工作得到了马克斯·冯·佩滕科弗研究所、慕尼黑路德维希-马克西米利安大学、德国研究基金会（DFG，HI 1511/3-1）以及德国联邦教育与研究部（BMBF）“医学感染基因组学”计划（0315834C）的支持。

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