病原液泡的分离纯化军团感染吞噬细胞

Summary

本文介绍了一个完整的隔离和净化的方法军团从变形虫和巨噬细胞含有空泡（LCVs）。两步的协议，包括轻型商用车通过使用对细菌的轻型商用车标记和密度梯度离心进一步纯化抗体的免疫磁性分离富集。

Abstract

条件致病菌嗜肺军团菌是一种抗阿米巴的细菌，这也是在肺泡巨噬细胞，从而导致重症肺炎"退伍军人病^"1复制。在原生动物和哺乳动物吞噬，L。肺采用了保守的机制，以形成特定的许可，复制，车厢，"含军团菌的空泡"（轻型商用车）。轻型商用车的形成需要ICM / DOT细菌IV型分泌系统（T4SS）"275效应"的蛋白质，其中的translocates进入宿主细胞。效应操纵宿主蛋白以及血脂和分泌，内体和线粒体的细胞器^2-4沟通。

的LCVs形成一个复杂的，强大的和冗余的过程，这是很难把握，在还原的方式。一个综合性的做法需要全面了解轻型商用车的形成，包括一个全球性的路径分析ogen宿主因子的相互作用及其时空动态。为实现这一目标的第一步，完整LCVs纯化和蛋白质组学和脂类组学分析。

已被调查的蛋白质组学分析，使用液相色谱或2-D电泳质谱仪耦合的组成和形成的含病原体的空泡。 ^9， 沙门氏菌 ， 球菌 ^8，7 分枝杆菌 ， 李斯特菌 ⁶ 利什曼 ⁵ 军团菌分离的社会土壤变形虫粘菌或哺乳动物吞噬细胞空泡窝藏^10。然而，在这些研究中采用的协议是净化费时和繁琐，因为他们需要如电子显微镜分析轻型商用车的形态，完整性和纯度。此外，这些协议不利用EN病原体液泡的具体特点富集。

这里介绍的方法克服了这些限制，由用人四discoideum生产轻型商用车荧光标记和针对细菌效应蛋白SIDC，选择性地结合到磷酸肌醇4 -磷酸（PtdIns（4）P）的^3,11轻型商用车膜锚。第一步由SIDC和二级抗体，加上磁珠古典Histodenz密度梯度离心^12,13（ 图1），其次是第二步，对主要抗体亲和纯化的免疫磁性分离富集LCVs 。

一个蛋白质孤立LCVs的研究从 D discoideum发现560多宿主细胞包括吞噬囊泡，线粒体，ER和高尔基，以及一些GTP酶，它没有被牵连^13日之前在轻型商用车形成相关蛋白的蛋白质，。丰富和纯化LCVs协议概述，这里还可以进一步分析显微镜（免疫荧光法，电子显微镜），生化方法（免疫印迹）和蛋白质或lipidomic办法。

Protocol

1。轻型商用车分离的筹备工作

1. 连续出嗜肺军团菌生产甘油股票CYE平板DsRed的，快^13,14轻型商用车隔离之前的5微克/毫升氯霉素（CAM）四天。细菌在37°C。
2. 种子出1×10 ⁷ D。 discoideum生产GFP-calnexin或75厘米²组织培养的RAW264.7巨噬细胞瓶前一天的感染。使用10毫升20微克/毫升为四 G418的HL5中等discoideum和孵化的变形虫在23°C对于RAW264.7巨噬细胞用10毫升辅以10％FCS（热灭活）和1％谷氨酰胺的RPMI 1640培养基，生长的细胞在37°C和5％的CO _2。使用至少有三个75厘米^2％感染和样本瓶（至少6×10 ⁷细胞）。
3. 接种过夜培养与研究肺从CYE板。以埃中等3毫升15毫升试管凸轮5微克/毫升。 100的产量为0.1 OD _600nm的细菌悬浮液接种。在37°C孵育架空旋转轮上过夜培养21-22小时。

2。轻型商用车的分离

1. 改变四中等discoideum细胞清除以下感染的抗生素，这会干扰。
2. 测量外径过夜培养。细菌已达....

Discussion

在此前公布的方法相比，该协议是基于两个步骤，首先通过免疫磁性分离的LCVs，和第二，通过密度梯度离心LCVs净化。轻型商用车的隔离，可以很容易地后，荧光显微镜，要么荧光标记的细菌和细胞产生的细胞或抗体染色时使用。这里描述的协议是一个简单的，直接的方法，该方法在高纯度浓缩铀的LCVs结果。重要的是，在同质化缓冲区的蛋白酶抑制剂是必需的RAW264.7巨噬细胞，但D. discoideum ¹³可选。

在协议的原则，可以采取其他病原体或宿主细胞，只要一个具体的，有选择性的定位标记是存在的，这是需要分离步骤。理想的情况下，细菌来源的明显标志是，运送到液泡膜，ND选择性本地化。针对宿主细胞标记可能导致意外的病原体与宿主细胞车厢液泡共同净化。

，一旦病原体液泡的鲜明标志是确定的，一个合适的多克隆或单克隆抗体，还有待提高。对于每一个主要抗体的浓度和阻断剂应优化，为阻止FCS的其他试剂可能是更合适的（如牛血清白蛋白，去脂化奶，其他市售阻断试剂）。