本文介绍了一种从变形虫和巨噬细胞中分离和纯化完整含有Legionella的液泡（LCVs）的方法。该两步法包括：首先利用针对细菌性LCV标志物的抗体通过免疫磁性分离富集LCVs，随后通过密度梯度离心进一步纯化。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
机会性病原体Legionella pneumophila是一种抗阿米巴的细菌，也可在肺泡巨噬细胞中增殖，从而引起严重的肺炎——“军团病”1。在原生动物和哺乳动物的吞噬细胞中，L. pneumophila采用一种保守的机制形成特定的、允许复制的区室，即“含Legionella的液泡”（LCV）。LCV的形成依赖于细菌的Icm/Dot IV型分泌系统（T4SS），该系统可将多达275种“效应蛋白”转运至宿主细胞内。这些效应蛋白可调控宿主蛋白和脂质，并与分泌性、内体性和线粒体细胞器相互作用2-4。
LCV的形成是一个复杂、稳健且具有冗余性的过程，难以通过还原论的方式加以理解。需要采用整合性方法来全面认识LCV的形成机制，包括对病原体-宿主因子相互作用及其时空动态进行全局分析。作为实现这一目标的第一步，首先对完整的LCV进行纯化，随后通过蛋白质组学和脂质组学进行分析。
通过液相色谱或二维凝胶电泳联合质谱技术进行的蛋白质组学分析，已用于研究含病原体液泡的组成与形成。这些研究中分离的液泡来源于社会性土壤阿米巴原虫Dictyostelium discoideum或哺乳动物吞噬细胞，其中含有Leishmania5、Listeria6、Mycobacterium7、Rhodococcus8、Salmonella9或Legionella spp.10。然而，这些研究所采用的纯化方案耗时且繁琐，例如需要电子显微镜来分析液泡的形态、完整性和纯度。此外，这些方案并未利用病原体液泡的特异性特征进行富集。
本文所述方法通过使用表达荧光LCV标记物的D. discoideum，并靶向细菌效应蛋白SidC，克服了上述局限。SidC可通过结合磷脂酰肌醇4-磷酸（PtdIns(4)P）特异性锚定于LCV膜上3,11。首先利用针对SidC的亲和纯化的一抗及偶联磁珠的二抗，通过免疫磁珠分离富集LCV；随后再通过经典的Histodenz密度梯度离心进行进一步纯化12,13（图1）。
对分离的 D. discoideum LCV 进行的蛋白质组学研究揭示了超过 560 种宿主细胞蛋白，包括与吞噬性囊泡、线粒体、内质网和高尔基体相关的蛋白，以及若干此前未被发现参与 LCV 形成的 GTP 酶13。通过本文所述方案富集和纯化的 LCV 可进一步用于显微镜分析（免疫荧光、电子显微镜）、生化方法（Western 印迹）以及蛋白质组学或脂质组学研究。
方案
1. LCV 分离的准备工作
- 在 LCV 分离前四天，将表达 DsRed-Express 的 Legionella pneumophila13,14 从甘油保存菌种接种至含 5 μg/mL 氯霉素（Cam）的 CYE 琼脂平板上进行划线培养。将细菌在 37 °C 条件下培养。
- 在感染前一天，将表达 GFP-钙联蛋白的 D. discoideum 或 RAW264.7 小鼠巨噬细胞以 1 × 107 接种于 75 cm2 组织培养瓶中。D. discoideum 使用含 20 μg/mL G418 的 10 mL HL5 培养基，并在 23 °C 条件下培养变形虫。RAW264.7 巨噬细胞使用含 10% 胎牛血清（热灭活）和 1% 谷氨酰胺的 10 mL RPMI 1640 培养基，在 37 °C 及 5% CO2 条件下培养。每次感染和样本至少使用三个 75 cm2 培养瓶（最少 6 × 107 个细胞）。
- 用 CYE 平板上的 L. pneumophila 接种过夜培养物。取一支 15 mL 试管，加入 3 mL AYE 培养基和 5 μg/mL Cam，再加入 100 μL 细菌悬液，使 OD600nm 达到 0.1。将过夜培养物置于 37....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
与先前发表的方法相比，本方案基于两个步骤：首先通过免疫磁性分离法分离LCVs，然后通过密度梯度离心进一步纯化LCVs。当使用荧光标记的细菌与表达GFP的细胞或抗体染色时，可通过荧光显微镜方便地追踪LCV的分离过程。此处描述的方案是一种简单直接的方法，能够高效富集高纯度的LCVs。重要的是，在裂解缓冲液中添加蛋白酶抑制剂对RAW264.7巨噬细胞是必需的，但对D. discoideum 则为可选项13。
原则上，只要存在一种特异性且能够选择性定位的标记物用于分离步骤，该方案便可适用于其他病原体或宿主细胞。理想情况下，这种特异标记物应来源于细菌，可被转运至液泡膜并选择性地定位于此。若以宿主细胞标记物为靶点，则可能导致病原体液泡与其他宿主细胞区室共同被非特异性地纯化，从而产生不良结果。
一旦鉴定出病原体液泡的特异性标记物，就需要制备相应的多克隆或单克隆抗体。针对每一种一抗，均需优化其浓度和封闭试剂，因为除胎牛血清（FCS）以外的封闭试剂可能更为合适（例如牛血清白蛋白（BS.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本实验室的研究工作得到了马克斯·冯·佩滕科弗研究所、慕尼黑路德维希-马克西米利安大学、德国研究基金会（DFG，HI 1511/3-1）以及德国联邦教育与研究部（BMBF）“医学感染基因组学”计划（0315834C）的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
参考文献
- Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence. Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).
- Zhu, W. Comprehensive identification of protein substrates of the Do....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
