新生内膜增生是动静脉化静脉狭窄的主要原因。我们提出一种新方案，采用套管技术将Sprague Dawley大鼠的右侧颈外静脉移植至颈总动脉。在实施安乐死的时间点，动物的存活率为100%。
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摘要
摘要
新生内膜增生是动静脉化静脉狭窄的主要原因之一，而静脉狭窄在冠状动脉旁路移植术、外周动脉旁路移植术以及动静脉瘘中具有重要意义。1-5 采用套管技术将静脉移植物植入颈总动脉的实验方法已被应用于多个研究项目中，以探讨新生内膜增生的病因及其治疗策略。6-8 套管可防止血管吻合口重塑，并在移植物内诱导产生湍流，从而促进新生内膜增生的发生。
使用上腔静脉移植物是一种已建立的用于静脉动脉化实验的小动物模型。9-11 本实验方案参考了Zou et al. 首次描述的颈静脉移植物移植技术9，以及其他研究者提出的方法。12-14 然而，这些已发表的小动物实验方案较为复杂。
为了简化操作流程并最大限度减少所需实验动物的数量，本文提供了一套通过视频培训的详细手术操作方案。该视频可帮助初学者外科医生同时掌握套管技术和静脉移植术。在此，将21只雌性Sprague Dawley大鼠的右侧颈外静脉以套管技术移植至颈总动脉，大鼠被均分为三组，分别于术后第21天、第42天和第84天处死。值得注意的是，由于采用的是自体移植，无需供体动物。在处死时间点，动物的存活率为100%。此外，前10只手术动物的移植物通畅率为60%，其余11只动物的通畅率为82%。处死时的血流速率为8±3 ml/min。总之，该手术方案显著简化、优化并标准化了这一复杂操作，为初学者提供了简单、分步的指导，并解释了可能遇到的困难，从而帮助其快速掌握技术，避免不必要的实验动物牺牲。
方案
1. 实验动物
- 获得当地伦理委员会批准将要开展的所有实验，批准过程需符合动物保护FELASA指南。
- 使用可从任何商业育种商处购买的雌性Sprague-Dawley大鼠（例如 Charles River Wiga GmbH，德国苏尔茨费尔德）。共使用21只动物，分为三组，每组7只，分别在术后3周、6周和12周处死。购买时动物应为12周龄，体重250–300 g。
- 将动物饲养在环境温度受控的房间内，保持室温为 21 °C，60% 相对湿度，12小时光照-黑暗循环，自由摄食和饮水。
2. 麻醉与手术准备
- 使用与麻醉机相连的有机玻璃箱诱导全身麻醉，设置氧气流速为1 L/min，并使用含5%异氟烷麻醉气体的蒸发器。
- 动物深部感觉反射消失后，立即通过异氟烷挥发罐以1.5%浓度维持麻醉。
- 将大鼠仰卧位固定于恒温加热板上。
- 使用脱毛膏去除每只动物从下颌角至其下方2 cm范围内的毛发，以准备手术区域 胸骨柄.
- 通过关注手术区域、动物体表准备区域以及外科医生的前方区域，准备无菌手术环境：
- 用消毒剂清洁实验台面。
- 通过多次使用外科擦洗液准备切口部位（例如 氯己定和70%异丙醇）。先使用氯己定，再使用酒精，最后使用擦洗液。
- 穿戴一次性手术服和外科手套，或者使用经外科消毒剂清洗过的检查手套。
- 手术过程中使用无菌显微外科器械。
- 使用手术显微镜（Wild Heerbrugg M650，Gais，瑞士），放大倍数为10-20倍。
3. 解剖学
图1展示了大鼠颈部的解剖结构：
1a) 位置 在横断右侧胸锁乳突肌之前。
1b) 位置 在横断右侧胸锁乳突肌后。
4. 套管制备
从塑料管（Portex，内径 0.75 mm，外径 0.94 mm，Smiths Medical，英国）上手工裁剪出长度为 3 mm 的套管。这些套管由套管主体和套管手柄组成，其中套管主体包含塑料管的完整体积，而套管手柄则由套管体积的一半构成。套管主体和套管手柄的长度应相等。套管手柄在外科手术过程中用于操作套管，至关重要。将套管套入血管后，需同时在套管手柄和血管上放置一个微型Bulldog夹，以防止出血、固定套管位置并确保稳定性。
5. 套管技术
- 将套管滑至血管上。
- 随后立即翻转血管，将其拉至套管主体的外部，并用7-0丝线结扎固定。通过此方式，套管的内腔被内皮覆盖。之后，将静脉移植物套在套管主体上，并用新的7-0丝线结扎固定。为防止血栓形成，必须将静脉移植物的结扎线紧靠套管边缘打结，以避免血液接触固定动脉的结扎线。由于血流方向的原因，这对远端吻合至关重要。然而，根据作者的观点，出于相同原因，近端吻合则无需如此严格。
6. 手术步骤
6.1 右侧颈外静脉的制备
- 在颈部正中做一条长约2.5 cm的切口 胸骨柄.
- 完全分离右侧颈外静脉一段长约1 cm的血管段，去除周围组织
- 用7-0丝线结扎静脉属支。
6.2 右侧颈总动脉的制备
- 分离胸锁乳突肌并在其中段横断。
- 仔细分离右侧颈总动脉，注意避免压迫动脉或周围组织 迷走神经 神经。从颈动脉分叉处向下游离至头臂干。
- 随后，在中间位置用7-0丝线结扎两次，再进行横断。
- 滑入由主体和手柄组成的尼龙套管（图2a) 套在颈总动脉远端，需注意确保套管手柄位于血管后方（图2b).
- 用微型Bulldog钳夹闭远端颈总动脉的套管端，钳夹位置应精确位于套管手柄处，以确保稳定性（图 2c).
- 随后，在结扎线后方直接切断动脉，使形成的动脉残端长度与套管主体长度相等。
- 用肝素-生理盐水溶液（20 IU 肝素/ml 0.9% NaCl）冲洗动脉管腔。将结扎环置于适当位置备用。
- 将动脉残端向上提起，像套袖一样套在套管主体上。
- 随后，拉紧结扎环并牢固打结。
- 为防止动脉从其套管中滑脱，可采用一个小技巧：用右手同时夹住动脉壁和缝线，左手使用镊子图 2d）打结（图 2e).
- 对近端动脉残端重复相同的步骤（图 2f).
6.3 静脉移植物定位
- 切除一段长约 1 cm 的夹闭状态下的颈外静脉
- 由于两个套管动脉之间的距离对于静脉移植过远，可使用 3-0 Vicryl 缝线环绕每个微型 Bulldog 夹，以此估算该操作所需的合适距离。
- 将两根缝线交叉。
- 随后向相反方向牵拉缝线，以准确定位套管动脉残端（图 2g）
- 用肝素生理盐水溶液冲洗静脉段。
- 将先前翻转过的静脉段一端套入远端颈动脉的套管上，并用 7-0 丝线结扎固定于正确位置。
- 需特别注意，静脉周径必须被完全且均匀地包绕。
- 再次用肝素生理盐水溶液冲洗静脉段，并将静脉段另一端套入近端颈动脉残端上。
- 完成结扎（图 2h）；
- 依次移除微型 Bulldog 夹，先移除远端颈动脉残端上的夹子，再移除近端的夹子，从而恢复通畅的血流并实现静脉移植物的动脉化（图 2i）。 若在移植物及颈总动脉内观察到血流和搏动（通过肉眼评估），则视为手术成功。
6.4. 伤口闭合
皮下连续缝合使用4-0薇乔线，皮肤连续缝合使用3-0薇乔线。
7. 恢复与术后管理
- 将动物置于红外加热灯下的平坦纸垫上，使其从麻醉中恢复。所有动物恢复正常前，不得将其送回动物饲养区。
- 术后给予布托啡诺（Temgesic），剂量为 0.03–0.05 mg/kg 体重，皮下注射，每 8–12 小时一次，持续 2 天。布托啡诺可在异氟烷诱导前给予。
- 术后监测动物的一般状况以及疾病或感染的迹象。
8. 血流测量
通过使用研究用Transonic血流测量系统（型号：TS420，Transonic Systems Europe B.V.，荷兰马斯特里赫特）配合血管周围血流探头（3 mm，MA3PSB）进行血流测量，证实了术后移植物的通畅性。该系统基于多普勒原理。
9. 代表性结果
严格遵循上述操作步骤，手术的平均持续时间约为65分钟。动物术后整体健康状况良好，并在整个实验过程中按预期增重：手术开始时动物体重为312±20.39 g；术后3周处死时间点体重为325.2±28.7 g，6周时为333±39.9 g，12周时为362.22±29 g。
手术部位未观察到感染，也未出现溃疡。手术伤口在预期时间内完全愈合。神经学检查未显示脑梗死或运动功能障碍的迹象。这一点尤为重要，因为动物的手术涉及颈动脉，且两条外颈静脉中的一条被切除并用作自体移植。未观察到对术后镇痛治疗的过敏反应。
在整个实验过程中，所有动物均保持警觉且具有社交行为。它们在获取食物和饮水方面的习惯在整个实验期间均未发生改变。
所有实验动物在处死时间点的存活率均为100%。前10只手术动物的移植物通畅率为60%，随后11只动物的移植物通畅率为82%。总体移植物通畅率为71%。在处死时间点测量了动脉化静脉移植物中的血流量，结果为8±3 ml/min，三个处死时间点之间的血流量差异无统计学意义。
图1. 大鼠颈部解剖。1a） 位置 在横断右侧胸锁乳突肌之前。1b) 位置 在横断右侧胸锁乳突肌后。
图 2. 术中显微图像：a）套管，由套管主体和套管手柄组成；b）将套管套入颈总动脉远端断端；c）夹闭带有套管的颈总动脉远端残端；d）将颈总动脉远端残端外翻覆盖于套管上；e）用结扎线固定外翻的颈总动脉残端；f）两侧带套管的颈总动脉远端和近端残端均完成外翻后的 situs；g）采用交叉法对接两个带套管的颈总动脉残端；h）静脉移植吻合完成后的 situs；i）静脉移植物再灌注完成后的 situs。
图 3. 静脉移植段再灌注后 situs 的示意图。 点击此处查看大图。
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讨论
在颈总动脉中植入外颈静脉移植物是一种复杂的显微外科技术。本视频可帮助初学者外科医生以最短时间掌握该技术，同时减少实验动物的浪费。
吸入麻醉是该手术的最佳选择，因为它可避免麻醉过深，易于控制，并能为外科医生提供充足的手术时间。此外，与小鼠相比，大鼠作为实验动物具有合适的体型，使此类复杂外科技术的操作更为简便。
采用套管技术的优点在于能够吻合不同管腔直径的血管。必须结扎套管外翻血管的完整周径，以防止再灌注后出血。该模型非常适合模拟高血流速度和低剪切应力的血流动力学状态，并用于研究影响新生内膜增生的机制。套管可防止血管吻合处重塑，并在移植物内诱导湍流，从而促进新生内膜增生的发生。
为防止血栓形成，必须将静脉移植物结扎线2放置在合适的位置，以避免血液与固定动脉的结扎线1发生接触（图3）9。按照推荐方式结扎静脉移植物可将血栓事件的发生率限制在12%-13%，血管闭塞的比例则更低15。正如手术视频中所示，精...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由德国亚琛工业大学医学院的研究促进项目"START"资助（项目名称："Die Arterialisation venöser Gefäße"，项目编号：START 690753）。我们衷心感谢Mary-Joan Blümich女士在文本编辑方面提供的出色帮助。Maria Kokozidou博士由Fresenius 2011_A61项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 黑色编织丝线 7-0 | Ethicon 产品 | 892100 | |
| Vicryl 3-0 | Ethicon 产品 | J285G | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon 产品 | J284G | |
| Portex 非无菌尼龙管 0.75 mm，0.94 mm 细径聚乙烯（聚乙烯）管 | Portex 英国 | 800/200/175/100 | |
| 异氟烷 5% | 任意通用品牌 | ||
| 肝素 | 任意通用品牌 | ||
| 0.9% 生理盐水 | 任意通用品牌 | ||
| 布托啡诺 | 任意通用品牌 |
参考文献
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