本文详细描述了利用原位胰管插管技术，灌注纯化的胶原酶与中性蛋白酶混合物，以分离小鼠胰岛的方法。
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摘要
摘要
β细胞基因表达与功能的研究 体外 多年来，研究重点已从啮齿类动物致瘤细胞系转向分离的啮齿类动物胰岛研究。原代胰岛具有显著优势，能更真实地反映细胞内信号通路和分泌反应的生物学特性。尽管利用组织解离酶（TDE）制剂分离胰岛的方法已在许多实验室中得到良好建立1-4，任何特定品系啮齿类动物胰岛产量和质量的一致性差异限制了原代胰岛研究的广度与可行性。这些差异通常是由于胰岛分离过程中使用的粗制且部分纯化的TDEs所致；TDEs常表现出批间酶活性差异，往往需要调整所用酶的剂量。已有少数研究报告采用纯化的TDEs进行啮齿类动物细胞分离5, 6，但尽管纯化的TDEs在人胰岛分离中已常规使用并具有优势，该实践尚未广泛普及。我们与VitaCyte, LLC（Indianapolis, IN）合作，开发了一种改良的小鼠胰岛分离方案，该方案基于Gotoh所描述的方法7, 8，其中将TDEs直接灌注至小鼠胰管，随后通过Histopaque密度梯度进行粗组织组分分离9，以及纯化胰岛的分离。我们方案中的一个显著差异是使用了纯化的胶原酶（CI酶 MA）和中性蛋白酶（CI酶 BP）组合。通过使用一种胶原酶表征方法对其进行表征6 利用荧光标记的可溶性小牛皮纤维作为底物的荧光胶原降解活性（CDA）检测6该底物以天然胶原蛋白为反应基质，因此对组织基质中胶原蛋白降解的动力学具有更强的预测性。通过高灵敏度荧光动力学检测法对蛋白酶进行了表征。10利用这些改进后的检测方法以及更传统的生化分析手段，可使TDE的生产更加一致，从而提高不同批次间的产品性能一致性。本文所述方案针对C57BL/6小鼠进行了优化，以实现胰岛产量最大化和胰岛形态学特征最优化。在该方案开发过程中，评估了不同浓度的多种胶原酶与中性蛋白酶组合，最终确定胶原酶：中性蛋白酶比例为35:10，其酶学性能与Sigma XI型酶相当。由于已有文献报道不同品系大鼠和小鼠的平均胰岛产量存在显著差异，因此应进一步调整TDE的组分，以提高从不同物种和品系中分离所得胰岛的产量与质量。
方案
A. 所需材料：准备前请参见表1（试剂）
- HBSS(P/S)：100 ml 10X HBSS + 900 ml H2O + 1% 青霉素/链霉素（储存于冰箱中或置于冰上）。
- 20% BSA 储存液以水配制，分装后于 -20 °C 保存。
- HBSS(BSA)：200 ml 1X HBSS(P/S) + 3 ml 20% BSA（最终 BSA 浓度为 0.3%）。
- 胰岛培养基：RPMI + 10% FBS + 1% 谷氨酰胺 + 1% 青霉素/链霉素。
- Histopaque 1100：240 ml 1119 Histopaque + 200 ml 1077 Histopaque。
- 4-0 缝合线（McKesson）：剪成 2¾ 英寸长的小段，储存于 10 cm 培养皿中。
- 器械：将 Fine Science Tools 的镊子弯曲成 90°，并将三对镊子的锯齿状齿部打磨钝化。目的是使齿部变钝，而非完全去除。
- 用于注射胶原酶/蛋白酶混合物的套管：27G ½ 英寸针头、30G ½ 英寸针头、PE50 管剪成 12 英寸长的段。将两根针头均打磨至末端光滑圆润，无锐边。将 27G 针头插入一段 12 英寸长的 PE50 管一端。使用钳子压碎针头外壳，每次旋转外壳约 ¼ 圈，直至将 30G 针头从外壳中取出，并在解剖显微镜下将其插入 PE50 管的另一端。插入针头时注意避免管路扭曲。27G 针头端用于连接胶原酶注射器。
- 胶原酶（CIzyme MA）和中性蛋白酶（CIzyme BP）。按生产商说明书重悬 TDE。参考批号特异的分析证书计算酶活性浓度。将重悬后的胶原酶共 350,000 胶原降解活性（CDA）单位与重悬后的 BP 蛋白酶 100,000 中性蛋白酶单位转移至一个锥形管中，用 HBSS(P/S) 稀释至总体积 15 ml。
B. 分步操作方案
1. 用胶原酶/蛋白酶混合物膨胀胰腺
- 通过颈椎脱位处死小鼠，用 70% EtOH 浸润小鼠躯干，用解剖剪刀和镊子从肛门至横膈膜完全切开腹腔。
- 将小鼠放置在解剖显微镜的平台上。
- 拉出盲肠和升结肠，并将其置于体腔外左侧。后续步骤的概要见图 1。
- 将肝脏叶推至横膈膜下方；若腹腔已充分打开，肝脏叶应能保持在此位置。用弯头镊夹住十二指肠，找到通向肝脏的肝动脉、门静脉和胆管束。用另一把弯头镊从动脉、静脉和胆管束下方穿过，将一段 2¾ 英寸的 4-0 缝合线穿过动脉、静脉、胆管下方，打一个结并尽可能靠近肝脏处拉紧。
- 使用两把弯头镊，小心夹住十二指肠，找到连接在十二指肠乳头处的胆管。用镊子尖端快速刺穿乳头附近胆管下方的胰腺和结缔组织，迅速穿过器官形成一个孔，然后将两支镊子尖端穿过该孔，再穿过另一段 2¾ 英寸的 4-0 缝合线，打一个结并拉成一个小圈，但不要拉紧。
- 更换为 90° 镊子和超细 Vannas 剪刀。用 90° 镊子小心夹住并轻拉小肠，使胆管绷紧。用剪刀在乳头处水平剪开一次：将打开的剪刀尖刺入肠壁，然后一次性完成剪切动作。注意仅剪一次，避免将胆管从乳头处移位。
- 在仍用 90° 镊子夹住肠管的同时，将导管插入胆管，插入深度约为胆管长度的一半，然后轻轻拉紧导管周围的缝合线。
- 用 3 ml 注射器吸取 2.0 ml 胶原酶/蛋白酶混合液，以缓慢且恒定的速度注入导管中。
- 胰腺充胀完成后，从胆管中取出导管，使用弯头镊和弯头弹簧剪，从降结肠开始，边向上牵拉肠道边剪断结缔组织，将充胀的胰腺取出。继续将胰腺从肠道分离，直至到达胆管，再将胰腺从脾脏、胃以及腹腔内脏中分离。最后剪断缝合线完成取出过程。将胰腺放入含有 5 ml HBSS(P/S) 的 50 ml 离心管中，该管应置于冰上。
- 对每只动物重复上述操作，最多四只动物。为获得最佳效果，每次仅解离四个胰腺。通常情况下，当第一批四个胰腺在 37 °C 水浴中消化时，可同时对另外四个胰腺进行充胀处理。
2. 胰腺解离
- 将含有胰腺的 50 ml 离心管放入 37 °C 水浴中孵育 15 分钟。
- 轻轻摇动离心管并检查组织解离情况，确保组织已充分分散，然后握住管盖将管内液体旋转混匀 12 次。
- 加入不超过 30 ml 的 HBSS(BSA)（可根据离心平衡所需体积适当减少），在 290 × g 条件下离心 1 分钟。
- 小心吸除上清液，底部保留少量上清（2–3 ml），以免扰动细胞沉淀。
- 使用连接 14G 针头的 30 ml 注射器，加入不超过 10 ml 的 HBSS(BSA)，并将悬液上下吹打 2 次。
- 将细胞混合液通过塑料茶滤器过滤至 50 ml 离心管中，并用另外 10 ml HBSS(BSA) 冲洗滤器。
- 在 330 × g 条件下离心 2 分钟。
- 倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上静置 1 分钟以沥干残留液体。
- 每管中加入 10 ml 冷的 1100 histopaque 重悬细胞沉淀。
- 在 histopaque 上层小心叠加 10 ml HBSS(BSA)，在 900 × g 条件下离心 18 分钟。
- 使用大孔径 25 ml 移液管移除全部 20 ml 上清液，并将上清液通过倒置的 70 μm 滤膜过滤。
- 将滤膜正面向上置于培养皿上方，用 10 ml 胰岛培养基冲洗滤膜，使胰岛被转移至 10 cm 培养皿中。
- 将胰岛置于 37 °C、5% CO2 的组织培养箱中培养，直至实验前使用。通常在实验前需人工挑选并计数胰岛。
3. 代表性结果
胰岛产量、形态和质量是评估胰岛分离成功与否的一般参数。根据我们的经验，采用本方案从普通C57BL/6小鼠获得的胰岛产量约为150–250个（见表2），与使用优化后的Sigma XI型胶原酶所得数据相当。然而，产量可能因小鼠品系和小鼠年龄的不同而有所差异。我们所使用的小鼠大多处于8–16周龄之间。本方案已在多种小鼠品系上进行过测试，包括C57BL/6（每只小鼠180–250个胰岛）、CD1（每只小鼠200–300个胰岛）、129/B6（每只小鼠200–300个胰岛）、BLKS-db/db（每只小鼠120–200个胰岛）、NOD（10周龄，每只小鼠100–150个胰岛）以及NOD-SCID（每只小鼠100–150个胰岛）。典型的胰岛形态如图2所示，胰岛呈圆形至椭圆形，大小相对均匀（尽管不同品系间大小均匀性可能存在差异）。图3展示了我们对使用纯化TDEs与Sigma XI型胶原酶分离的C57BL/6小鼠胰岛进行的典型葡萄糖刺激胰岛素分泌分析结果。通常，高质量的胰岛制备物在25 mM葡萄糖刺激下的胰岛素分泌量应比2.5 mM葡萄糖条件下的分泌量高出6–20倍。此外，还可采用其他方法来评估分离胰岛的质量，包括灌流技术、Ca2+成像（使用Fura2）以及逆转录PCR等11。
图1. 胆管插管术的概要。
图2. C57BL/6胰岛在分离后24小时的典型形态。 图像采用倒置显微镜在40倍放大下获取。
图3. C57BL/6胰岛的葡萄糖刺激胰岛素分泌。 分离后24小时，将100个胰岛置于12孔板中，在含有2.5 mM葡萄糖的Krebs-Ringer HEPES缓冲液中、37 °C条件下孵育1小时。随后将胰岛转移至含2.5 mM葡萄糖的Krebs-Ringer HEPES缓冲液中继续孵育1小时，收集上清液，采用双位点免疫特异性酶联免疫吸附测定法（ELISA）（Crystal Chem）检测胰岛素含量。随后将相同的胰岛转移至含25 mM葡萄糖的Krebs-Ringer HEPES缓冲液中，孵育1小时后通过ELISA测定胰岛素在培养基中的释放量。
讨论
在本实验方案中，我们描述了小鼠胰腺的插管、胶原酶灌注及解离操作流程，旨在分离兰格汉斯胰岛。从技术上讲，一旦掌握该方法，可在动物安乐死后4分钟内开始胰腺的分离操作，并在1小时内完成单只动物胰岛的分离。该技术的高效性使我们通常能够在一次操作中同时处理多达12只小鼠，从而获得最多约3,000个胰岛。
与其他使用粗提胶原酶的方案不同，本方案采用高纯度的蛋白酶CIzyme Collagenase MA和CIzyme BP Protease。市售组织解离酶（TDE）制剂在批次间存在一致性差异，因此在广泛使用前需对每一批次进行单独测试和优化。这种批间差异促使我们考虑使用VitaCyte公司提供的高纯度TDE。这些高度纯化的TDE通过多种方法进行表征，包括使用高灵敏度荧光标记底物的检测方法。荧光CDA检测法对降解天然胶原蛋白具有不同动力学特性的多种分子形式的胶原酶更为敏感。传统的肽底物检测法对胶原酶活性的评估不够全面。采用多种方法对胶原酶进行表征，可确保不同批次间具有更稳定的酶活性。
根据我们内部测试所用的多种市售胶原酶制剂，发现纯化的酶组合能够产生可重复的批间结果。在此应用中使用高度纯化且经过严格表征的组织解离酶（TDEs）的主要优势在于，一旦确定了最佳酶组成，即可确保批间性能的一致性。这种一致性消除了通常对粗制或富集型胶原酶产品所必需的、耗时耗力的批次验证过程。纯化的TDEs还允许对酶组成进行进一步优化，以提高从不同小鼠品系中分离胰岛的得率和质量。针对不同小鼠品系胰岛分离的最佳酶组成方案也能够更有效地进行交流与报告。这反过来提高了资源利用效率，并增强了实验设计的灵活性。
使用本方案进行胰岛分离时，有许多关键步骤会影响最终结果。首先是灌注酶液时必须有效膨胀胰腺。开始注射时应轻柔施力，随着胰腺逐渐膨胀再逐步增加推注力度。在膨胀过程中移动肠道并提起胰腺有助于胶原酶充分灌注整个器官。另一个关键步骤是在37 °C孵育后振荡试管的力度（步骤2.2）。我们发现，若用力将胰腺撞击试管帽会导致胰岛破碎；但若此步骤完全不进行机械解离，则胰岛得率会显著下降。此外，在使用注射器进行解离的步骤中（步骤2.5），推动活塞上下移动时需施加中等力度，以确保组织充分解离，从而在后续过滤步骤（步骤2.6）中仅有极少量组织残留在茶漏滤器上。最后需谨慎操作的是完全吸取20 ml的Histopaque梯度分离后的胰岛。尽管胰岛通常位于Histopaque与HBSS的界面处，但我们发现仅吸取界面层会导致胰岛丢失；因此目前我们采用大口径25 ml移液管将全部20 ml液体吸出。我们增加了通过倒置70 μm滤膜的过滤步骤（步骤2.11），以消除反复离心洗涤去除Histopaque的需要。
披露
NDS、SAT 和 RGM 无任何利益冲突需要披露。作者 AGB 受雇于 VitaCyte。作者 RCM 在 VitaCyte 拥有所有权权益。
致谢
本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 R01 DK060581、R01 DK083583（均授予 RGM）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |
| RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 任何 | |
| Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |
| 4-0 缝线 100 码卷装 | McKesson | 451521 | |
| 14号钝端针头 | Fisher Scientific | 14-8216M | |
| 万纳斯超细剪刀 | Fisher Scientific | 501778 | |
| 弯头弹簧剪 | Fisher Scientific | 14127 | |
| 弯头镊子（2） | Fisher Scientific | 15914G | |
| 弯头镊子（适用于90） °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| 27G 1/2 英寸针头 | Fisher Scientific | 305109 | |
| 30G 1/2英寸针头 | Fisher Scientific | 305106 | |
| PE管 | Becton Dickinson | 427411 | |
| 胶原酶MA | VitaCyte, LLC | 001-2030 | |
| BP蛋白酶 | VitaCyte, LLC | 003-1000 | |
| 3 ml 注射器 | Fisher Scientific | 309585 | |
| 30 ml 注射器 | Fisher Scientific | 309650 | |
| 70 μm 滤膜 | Fisher Scientific | 352350 | |
| 10 cm2 培养皿 | Fisher Scientific | 351005 | |
| 塑料茶漏 | 任何厨房用品 | ||
| 表1. 试剂与仪器 | |||
| <表 cellpadding="0" cellspacing="0" 宽度="510" 边框="1"> | |||
| Sigma Type XI (l010M8618) | MA (100615) BP（110329） | MA（081104） BP（100823） | MA (091211) BP (101109) |
| 216 (±74) | 260 (±45) | 157 (±37) | 200 (±4) |
表2. 平均胰岛产量（±SD）使用不同批次的TDE*
*数据代表至少10只小鼠的平均胰岛产量。括号内为批号
参考文献
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