我们介绍一种易于建立的、用于大鼠原位肝移植的经典双袖套技术的改良方法。
本文内容
摘要
摘要
肝脏移植领域的临床进展在很大程度上得益于动物模型的支持1,2。自1979年Kamada et al.3首次发表大鼠原位肝移植模型以来，尽管已有多种替代技术被提出4，该模型仍一直是金标准。然而，由于其学习曲线陡峭，该模型的广泛应用受到限制5。
在本视频论文中，我们展示了一种对 Kamada 双套管技术进行的简单且易于建立的改良方法。肝上腔静脉吻合采用连续缝合法手工完成，而门静脉和肝下腔静脉吻合则使用快速连接套管系统6完成。快速连接套管试剂盒的制备过程在另一篇视频论文中展示。
方案
1. 供体手术
- 使用异氟烷通过锥形面罩对体重为200±20克的雄性大鼠进行麻醉（诱导浓度3%，术中维持2%，气流速度1升/分钟，FiO₂为70%）。
- 行大范围正中及横行剖腹切口，并电凝双侧上腹部血管。
- 切断镰状韧带，分离左膈静脉与肝上腔静脉，最后在两根7-0丝线结扎线之间切断膈静脉。
- 切断左侧三角韧带和胃肝韧带。
- 在7-0结扎线之间分离肝食管韧带及其动脉（电凝为可接受的替代方法）。
- 游离肝下腔静脉至左肾静脉水平，将右肾静脉与其周围组织分离，并在其近端和远端分别使用10-0和7-0结扎线结扎后切断。
- 在7-0结扎线之间切断右肾上腺静脉，并在轻柔牵引下切断肝脏后方的韧带以游离肝脏。
- 游离胃脾静脉，并在其近端和远端分别使用10-0和7-0结扎线结扎后切断。
- 在7-0结扎线之间切断肝固有动脉。
- 游离胰十二指肠静脉，并在其近端和远端分别使用10-0和7-0结扎线结扎后切断。
- 于距肝门1厘米处行小切口，将一根22G、3.5毫米的支架插入胆总管，并用7-0结扎线固定支架位置。
- 通过阴茎背静脉注射10单位肝素，溶于1毫升生理盐水中。
- 用21G针头穿刺门静脉（尽可能远离肝门），并用20毫升冷乳酸林格液（或其他保存液）轻柔灌注肝脏。同时在肾静脉下方切断下腔静脉以保证充分流出。肝脏冷灌注时间应持续1至2分钟。
- 在胰十二指肠静脉远端切断门静脉。
- 在支架周围结扎线的远端切断胆总管。
- 完成肝下腔静脉的切断。
- 紧贴膈肌切断肝上腔静脉并取出肝脏。
- 将肝脏置于盛有冷乳酸林格液的容器中，并将容器放置于冰垫上。
2. 移植物制备
- 将门静脉插入其套管中，然后将血管边缘外翻以暴露内膜。用7-0缝线固定套管上外翻的血管段。
- 对肝下腔静脉进行相同的操作。
- 在肝下腔静脉近端放置一个微型夹（4-6 mm长度），此操作可避免门静脉再灌注后发生血液流失。
- 翻转肝脏，并从外向内在肝上腔静脉相对的两侧边缘各插入两根8-0聚丙烯缝线。
- 将移植物浸入乳酸林格液中，置于0-4 °C冰箱中保存。
3. 受体操作
- 使用异氟烷通过锥形面罩对体重为200±20克的雄性大鼠进行麻醉（诱导浓度3%，术中维持2%，气流速度1升/分钟，FiO₂ 70%），并将大鼠置于保温垫上。需注意，受体与供体的体重应相匹配（±40克）。
- 在开腹前，皮下注射10 ml生理盐水，并肌肉注射0.03 g哌拉西林/他唑巴坦。
- 行腹白线剑突至耻骨联合的正中开腹术。
- 使用自锁止血钳翻转剑突，以更好地暴露肝脏。
- 切断前方韧带，并在两根7-0结扎线之间离断左侧膈静脉。
- 在7-0结扎线之间离断肝食管韧带及动脉（电凝为可接受的替代方法）。此步骤未在视频中展示（与供体手术相同）。
- 游离下腔静脉至右肾静脉水平。
- 在7-0结扎线之间离断右侧肾上腺静脉，并在轻柔牵引下切断后方韧带，使肝脏从其后部韧带中松解（此步骤未在视频中展示（与供体手术相同））。
- 在胆总管分叉下方放置一根7-0结扎线，在其下方1毫米处再置一根结扎线，并在两者之间剪断。
- 在肝门处游离肝动脉，并在7-0结扎线之间将其离断。
- 轻柔分离左、右门静脉分支。注意避免损伤肝总动脉或胃脾静脉。
- 将腔静脉环置于下腔静脉上，位置位于右肾静脉头侧。然后通过放置四根9-0缝线将血管壁固定于环上。
- 对门静脉环和门静脉重复相同操作。
- 通过阴茎背静脉注射10 IU肝素，用1 ml生理盐水稀释后注入。
- 将麻醉浓度调至0.25%，FiO₂调至100%。
- 在右肾静脉上方夹闭下腔静脉，随后在胃脾静脉上方夹闭门静脉。最后夹闭肝上段下腔静脉，确保夹闭部分包含至少2 mm的膈肌组织。
- 靠近实质处剪断肝上段下腔静脉。
- 剪断左、右门静脉分支，并切开其间隔。
- 靠近实质处剪断下腔静脉，注意避免切到先前放置的任何缝线。取出肝脏并将移植物放入腹腔内。
- 在移植物与受体的肝上段下腔静脉之间行端对端吻合。先从左至右连续缝合后壁，再从右至左缝合前壁。前壁缝线应保持松弛直至最后，以便在收紧两端前充分冲洗管腔内部。
- 将吻合器的尾侧支插入腔静脉环手柄；然后将移植物的门静脉插入吻合器头侧支的切口中，使门静脉套管准确嵌入槽位。
- 在用生理盐水冲洗受体门静脉的同时关闭吻合器，使套管顺利插入血管。用一根7-0环形结扎线将受体门静脉固定在其套管周围。
- 移除吻合器。依次开放肝上段下腔静脉和门静脉的血管夹：此时门静脉血流已恢复。
- 使用超细剪刀剪断9-0结扎线，移除门静脉环。
- 将吻合器的尾侧支插入腔静脉环手柄；然后将移植物的下腔静脉插入吻合器头侧支的切口中，使腔静脉套管准确嵌入槽位。
- 在用生理盐水冲洗受体下腔静脉的同时关闭吻合器，使套管顺利插入血管。用一根7-0环形结扎线将受体下腔静脉固定在其套管周围。
- 移除吻合器。依次开放移植物与受体的下腔静脉微夹：此时静脉血流已恢复。
- 对受体胆总管做部分切开，轻柔向头侧牵引，将先前插入移植物胆管内的支架自由端插入。用一根7-0环形结扎线固定支架。
- 逐层缝合关闭动物体腔，使用5-0缝线。苏醒后可自由饮水和进食。
- 根据当地机构的规范给予有效镇痛治疗，建议最短持续时间为24小时。
需要注意的是：根据实验设计的需要，可进行端对端的肝动脉吻合（在大鼠肝移植术后长期存活中，该动脉并非必需）。
4. 代表性结果
我们的团队在经过大约10次训练手术后，成功掌握了所述技术。在短期训练后，连续36例Lewis至Lewis及黑褐色大鼠至Lewis的移植手术实现了100%的长期（>21天）存活率（目前已有大量同系肝移植受体存活超过12个月）。同系移植术后第1天的肝功能检测显示，天冬氨酸转氨酶（AST）中位数为84 U/l（51.7 - 92.7），丙氨酸转氨酶（ALT）中位数为172.5 U/l（127.5 - 240.2）。无肝期平均为14 ± 2分钟，其中最长步骤为肝上腔静脉吻合（连续缝合）时间，平均为9 ± 2分钟。
快速连接系统可将内径为1.55 mm的套管用于门静脉，将内径为2.40 mm的套管用于下腔静脉（受体体重为200 ±20 g）。相比之下，采用Kamada技术进行移植时，套管内径分别不能超过1.40 mm和2.16 mm（匹配品系和体重的大鼠）。如图7所示，快速连接环的设计可使受体血管保持在最佳拉伸状态，最大限度减少套管和血管长度的浪费，从而获得更接近生理状态的血流动力学结果。
图 1. 环形尺寸测量。
图 2. 微型夹具尺寸。
图 3. 快速连接器套件。
图 4. 快速连接器已装填。
图 5. 快速连接器闭合状态。
图6. SHVC夹具。
图7. 传统套管法与快速连接器辅助套管吻合术的血流动力学比较。
图8. 供体与受体皮肤的准备及切口操作。
讨论
目前的大鼠肝移植模型易于建立。根据我们的经验，把握几个关键点有助于将死亡风险降至最低（≤20%）。术后早期死亡（再灌注后3小时内发生）大多由肠梗死引起，其原因为门静脉阻断时间过长。因此建议无肝期应控制在15分钟的理想范围内（20分钟以内仍可接受）。中心性空气栓塞也可能导致猝死，故在吻合前必须彻底冲洗所有静脉。
术后第1至第3天之间的死亡通常由肝功能衰竭或下腔静脉血栓形成引起。因此，在供体器官切除前应避免对移植物进行任何剧烈的灌注冲洗（我们以约60秒时间灌注20 ml），并确保适当的低温保存（完全浸入0–4 °C的乳酸林格液中）。通过尽量减少对血管内膜的操作并保持其完整性，可降低血栓形成的风险。我们不建议术后使用抗凝治疗。
术后第4天至第9天之间的死亡通常与细菌性胆管炎相关7。根据我们的经验，术前给予单次剂量的哌拉西林/他唑巴坦（0.03 g）足以最大限度降低胆总管感染的风险。
10天后死亡事件较为罕见。然而，由于缺乏动脉血流，可能会出现一些胆管问题，如胆汁淤积8。根据研究者的需要，可考虑进行动脉化处理9。值得注意的是，冷缺血时间长达24小时仍可被视为可接受10。
快速连接系统最初设计用于进行带有三个套管吻合的肝移植手术（无肝期极短）。然而，三套管技术需要对肝上腔静脉（SHVC）套管使用非常小的卡尺，由于存在肝脏流出道问题的风险，该技术尚未被广泛接受11-14。因此，我们仅在需要热缺血时间短于十分钟的情况下，倾向于采用快速连接系统辅助的三套管技术。但在大多数研究中，植入阶段长达15-18分钟仍可接受，此时可采用两套管技术，实现更生理性的肝上腔静脉引流。如本视频论文所示，我们常规仅在植入手术的第二阶段使用快速连接系统。尽管放置快速连接手柄需要额外的手术时间，但该步骤风险极低，并且由于套管插入更为简便，可显著缩短关键的无肝期。快速连接系统的其他优势还包括移植物与受体血管的更好对位，以及使用更宽的套管，相比以往描述的技术（包括Kamada et al. 所述技术）具有更优的血流动力学效果6（图7）。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
CT 获得了瑞士国家科学基金会（SCORE 项目编号 3232230-126233）的支持。本研究得到了 Artères 基金会、欧洲安斯泰来基金会和 Boninchi 基金会的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 工具 / 试剂 | 公司 | 目录号 | 评论 |
| 门静脉套管 | altecweb.com 或 smiths-medical.com | Coil 01-96-1729 800/100/420 | 内径：1.55 mm 壁厚：0.30 mm 长度：3.5 mm |
| 肝下腔静脉套管 | altecweb.com 或 smiths-medical.com | Coil 01-96-1733 800/100/540 | 内径：2.40 mm 壁厚：0.30 mm 长度：3.5 mm |
| 胆总管支架 | 普通22G静脉留置针 | ||
| 7-0 丝线结扎 | georgetiemann.com | 160-1226-7/0 | |
| 10-0 prolene | ethicon.com | ||
| 9-0 prolene | ethicon.com | ||
| 8-0 prolene | ethicon.com | ||
| 直头显微镊子 | s-and-t.net | FRC-15RM-8 | |
| 弯头显微镊子 | s-and-t.net | FRS-15-RM-8 | |
| 解剖针持 | s-and-t.net | B-15-8.2 | |
| 吻合针持 | rumex.net | 8-021T | |
| 微型钳 | finescience.com | 18055-03 | 6 × 1 mm |
| 微型钳夹施加器 | finescience.com | 18057-14 | |
| 肝上腔静脉夹 | pharmap.ch | 13.349.14 | |
| 快速连接环 | dltchiropody.co.uk | 步骤 10 | 改良的手术刀片 |
| 快速连接器吻合装置 | pharmap.ch | UD-04-275 | 改良Kocher法’s 钳 |
参考文献
- Starzl, T. E., Marchioro, T. L., Porter, K. A. Experimental and clinical observation after homotransplantation of the whole liver. Revue internationale d'hepatologie. 15, 1447(1965).
- Starzl, T. E. Evolution of liver transplantation. Hepatology. 2, 614S-636S (1982).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47(1979).
- Kashfi, A. A review of various techniques of orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation proceedings. 37, 185-188 (2005).
- Hori, T. Comprehensive and innovative techniques for liver transplantation in rats: A surgical guide. World Journal of Gastroenterology: WJG. 16, 3120(2010).
- Oldani, G. A novel technique for rat liver transplantation using Quick Linker system: a preliminary result. Journal of Surgical Research. 149, 303-309 (2008).
- Nosaka, T., Bowers, J. L., Cay, O., Clouse, M. E. Biliary complications after orthotopic liver transplantation in rats. Surg. Today. 29, 963-965 (1999).
- Li, G. L. High incidence of biliary complications in rat liver transplantation: can we avoid it. World J. Gastroenterol. 17, 3140-3144 (2011).
- Peng, Y., Gong, J. P., Yan, L. N., Li, S. B., Li, X. H. Improved two-cuff technique for orthotopic liver transplantation in rat. Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. 3, 33-37 (2004).
- Urata, K. Decreased survival in rat liver transplantation with extended cold preservation: role of portal vein clamping time. Hepatology. 28, 366-373 (1998).
重印与许可
标签
