微环境微阵列（MEArrays）的制备与应用

摘要

本文描述了一种组合功能性筛选方法，用于深入了解微环境分子组成对细胞功能的影响。该方法利用现有的基于微阵列的技术，构建支持细胞黏附和功能分析的、具有明确组合特征的微环境阵列。

摘要

细胞与其周围微环境之间的相互作用对细胞行为具有功能性影响。在单细胞水平上，不同的微环境可诱导细胞产生分化、迁移和增殖等表型；在组织水平上，微环境则参与形态发生和肿瘤发生等复杂过程¹。影响组织内细胞的不仅包括微环境中的细胞和分子成分，还包括组织的弹性²和几何结构³。微环境被定义为细胞-细胞、细胞-细胞外基质（ECM）以及细胞-可溶性因子相互作用的总和，并包含物理特性，因此具有高度复杂性。组织中细胞的表型部分源于其基因组内容，部分源于与微环境的组合性相互作用。当前的主要挑战之一是将特定的微环境组分组合与独特的细胞行为关联起来。

本文介绍了用于基于细胞的功能性筛选与组合微环境相互作用的微环境微阵列（MEArray）平台⁴。该方法可同时调控分子组成和弹性模量，并结合了广泛可用的微阵列和微图形化技术。每个微阵列仅需约10,000个细胞，便于对成体祖细胞等稀有细胞类型进行功能研究。该技术的一个局限性在于无法在MEArray上完全重现整个组织微环境。然而，通过比较同一种细胞对多种相关微环境（例如表征特定组织的细胞外基质蛋白成对组合）的响应，将有助于揭示微环境组分如何诱导组织特异性的功能表型。

MEArrays 可使用多种重组生长因子、细胞因子和纯化的细胞外基质（ECM）蛋白及其组合进行打印。该平台的应用仅受限于特定试剂的可获得性。MEArrays 适用于时间序列分析，但更常用于检测可通过荧光探针测量的细胞功能的终点分析。例如，常检测的指标包括 DNA 合成、细胞凋亡、分化状态的获得或特定基因产物的生成。简而言之，MEArray 实验的基本流程包括：制备包被有打印基质的载玻片，以及制备用于打印的蛋白质主板；随后使用微阵列机器人打印阵列，使细胞贴附并进行培养生长，待达到实验终点后进行化学固定；最后通过荧光或比色法检测，并利用传统显微镜或微阵列扫描仪成像，以揭示相关的分子和细胞表型（图1）。

方案

1. 打印基底的制备

选择使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）包被还是聚丙烯酰胺（PA）包被的载玻片，取决于实验设计中的关键参数。通过调整PDMS的基料与固化剂比例，以及PA的丙烯酰胺与双丙烯酰胺比例，可以调节这两种聚合物的弹性模量，以模拟不同组织的刚度。PDMS可模拟刚度较高的组织（范围为1–10 MPa，例如软骨、角膜和动脉壁），而PA可模拟较软的组织（范围为100 Pa–100 kPa，例如乳腺、脑、肝脏和前列腺）⁵。PDMS成本较低，易于制备，且打印特征的几何形状将与打印针头的形状完全一致，因此可通过使用不同尖端几何形状的针头精确控制特征的大小和形状。PDMS比PA更具疏水性，这在细胞操作和免疫染色步骤中可能带来一些挑战，并可能与某些细胞系不兼容。由于PA是一种水凝胶，具有天然的抗非特异性吸附表面，细胞仅会在存在支持细胞黏附蛋白的位点处附着。PA凝胶上打印特征的几何形状不能精确复制针头的几何形状；通常由于扩散作用，无论使用何种针头几何形状，特征都会变成圆形。PA凝胶上特征的最佳尺寸可通过实验确定打印接触时间和针头直径等参数来实现。

聚二甲基硅氧烷（PDMS）

1. 在一次性塑料杯中，按10:1的比例将Sylgard 184硅胶弹性体基液与固化剂混合，用木制或塑料压舌板充分搅拌，然后在室温下置于真空干燥器中脱气30分钟。
2. 将标准显微....

讨论

本文介绍的 MEArray 方法能够实现对细胞与组合微环境相互作用的功能性分析⁴。MEArray 分析结合了基础微图形化技术、细胞生物学以及微阵列点样机器人和分析设备的使用，这些设备在许多多用户共享平台中均可获得。MEArray 筛选适用于大多数贴壁细胞类型，但在某些情况下可能需要调整无血清培养基配方，添加 BSA 或 <1% 血清以改善细胞贴附。该方法的局限性在于可用于分析特定细胞功能的试剂是否可及；基于荧光的检测与大多数基于阵列的成像系统兼容，但比色检测同样可获得良好效果。该方法尚有其他变体，均支持一个普遍观点：复杂的微环境可通过功能性解析，揭示单个微环境分子及其组合在多种细胞功能中所起的作用^8,9。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25 mm × 75 mm 玻片	VWR	48311-600
玻璃盖玻片（1号），24 mm × 50 mm	VWR	48393-241
染色皿（或 Coplan 罐）	VWR	25461-003
培养皿（15 cm）	BD Falcon	351058
NaOH (1.0 N)	Sigma-Aldrich	S2567
APES（>98% (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷	Sigma-Aldrich	A3648
戊二醛	Sigma-Aldrich	G7651	50% 水溶液
APS（过硫酸铵）>98% 过硫酸铵	Sigma-Aldrich	A3678	用 ddH₂O 配制 10% 工作液2O
TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）	Sigma-Aldrich	T9281
丙烯酰胺（40%）	Sigma-Aldrich	A4058
双丙烯酰胺（2% w/v）	Fisher BioReagents	BP1404-250
0.45 μ4毫米尼龙针筒式滤器	Nalgene	176-0045
FITC	Sigma-Aldrich	F4274
PDMS（聚二甲基硅氧烷）	道康宁	3097358-1004	Sylgard 184 弹性体试剂盒（通过 Ellsworth Adhesives）
2孔板	NUNC	177380
Pluronic F108	BASF	30089186
水族箱密封胶	道康宁	DAP 00688
Fluormount-G	Southern Biotech<强>	0100-01
一次性塑料杯
压舌板
腈类手套
塑料显微镜载玻片盒
旋涂仪	WS-400B-6NPP/LITE	Laurell Technologies Corporation
烘箱
数字加热板
384孔板			适用于微阵列机器人的品牌
微阵列打印机器人
倒置相差及荧光显微镜
轴突微阵列扫描仪	Molecular Devices		存在多种构型