本文描述了一种组合功能性筛选方法，用于深入了解微环境分子组成对细胞功能的影响。该方法利用现有的基于微阵列的技术，构建支持细胞黏附和功能分析的、具有明确组合特征的微环境阵列。
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本文内容
摘要
摘要
细胞与其周围微环境之间的相互作用对细胞行为具有功能性影响。在单细胞水平上，不同的微环境可诱导细胞产生分化、迁移和增殖等表型；在组织水平上，微环境则参与形态发生和肿瘤发生等复杂过程1。影响组织内细胞的不仅包括微环境中的细胞和分子成分，还包括组织的弹性2和几何结构3。微环境被定义为细胞-细胞、细胞-细胞外基质（ECM）以及细胞-可溶性因子相互作用的总和，并包含物理特性，因此具有高度复杂性。组织中细胞的表型部分源于其基因组内容，部分源于与微环境的组合性相互作用。当前的主要挑战之一是将特定的微环境组分组合与独特的细胞行为关联起来。
本文介绍了用于基于细胞的功能性筛选与组合微环境相互作用的微环境微阵列（MEArray）平台4。该方法可同时调控分子组成和弹性模量，并结合了广泛可用的微阵列和微图形化技术。每个微阵列仅需约10,000个细胞，便于对成体祖细胞等稀有细胞类型进行功能研究。该技术的一个局限性在于无法在MEArray上完全重现整个组织微环境。然而，通过比较同一种细胞对多种相关微环境（例如表征特定组织的细胞外基质蛋白成对组合）的响应，将有助于揭示微环境组分如何诱导组织特异性的功能表型。
MEArrays 可使用多种重组生长因子、细胞因子和纯化的细胞外基质（ECM）蛋白及其组合进行打印。该平台的应用仅受限于特定试剂的可获得性。MEArrays 适用于时间序列分析，但更常用于检测可通过荧光探针测量的细胞功能的终点分析。例如，常检测的指标包括 DNA 合成、细胞凋亡、分化状态的获得或特定基因产物的生成。简而言之，MEArray 实验的基本流程包括：制备包被有打印基质的载玻片，以及制备用于打印的蛋白质主板；随后使用微阵列机器人打印阵列，使细胞贴附并进行培养生长，待达到实验终点后进行化学固定；最后通过荧光或比色法检测，并利用传统显微镜或微阵列扫描仪成像，以揭示相关的分子和细胞表型（图1）。
方案
1. 打印基底的制备
选择使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）包被还是聚丙烯酰胺（PA）包被的载玻片，取决于实验设计中的关键参数。通过调整PDMS的基料与固化剂比例，以及PA的丙烯酰胺与双丙烯酰胺比例，可以调节这两种聚合物的弹性模量，以模拟不同组织的刚度。PDMS可模拟刚度较高的组织（范围为1–10 MPa，例如软骨、角膜和动脉壁），而PA可模拟较软的组织（范围为100 Pa–100 kPa，例如乳腺、脑、肝脏和前列腺）5。PDMS成本较低，易于制备，且打印特征的几何形状将与打印针头的形状完全一致，因此可通过使用不同尖端几何形状的针头精确控制特征的大小和形状。PDMS比PA更具疏水性，这在细胞操作和免疫染色步骤中可能带来一些挑战，并可能与某些细胞系不兼容。由于PA是一种水凝胶，具有天然的抗非特异性吸附表面，细胞仅会在存在支持细胞黏附蛋白的位点处附着。PA凝胶上打印特征的几何形状不能精确复制针头的几何形状；通常由于扩散作用，无论使用何种针头几何形状，特征都会变成圆形。PA凝胶上特征的最佳尺寸可通过实验确定打印接触时间和针头直径等参数来实现。
聚二甲基硅氧烷（PDMS）
- 在一次性塑料杯中，按10:1的比例将Sylgard 184硅胶弹性体基液与固化剂混合，用木制或塑料压舌板充分搅拌，然后在室温下置于真空干燥器中脱气30分钟。
- 将标准显微镜载玻片居中放置于旋涂仪的真空吸盘上，随后在载玻片表面中心滴加0.5 ml混合好的弹性体溶液，以6,000 rpm转速旋涂60秒。
- 将涂有PDMS的载玻片置于70 °C烘箱或数字加热板上（需防尘）加热固化4小时至过夜。
- 固化后的载玻片可立即使用，或密封于塑料自封袋内的载玻片盒中，存放于抽屉内保存数月。PDMS易吸附灰尘，必须避免暴露于空气流动环境中。
- 注意：使用PDMS弹性体试剂盒时，必须佩戴丁腈或其他非乳胶手套。接触乳胶手套会抑制PDMS的聚合反应。
聚丙烯酰胺（PA）
- NaOH 蚀刻：将载玻片置于加热块上 80 °C. 每张载玻片上加入1 ml 0.1N NaOH，确保完全覆盖整个载玻片表面。让NaOH自然蒸发（载玻片表面应形成一层白色薄膜）。由于PA凝胶只能牢固附着在经NaOH蚀刻的表面，若载玻片表面未被NaOH完全覆盖，则在干燥步骤中PA凝胶会脱落。如果载玻片表面覆盖不完全，需重复加入1 ml 0.1N NaOH。处理后的载玻片可在室温（RT）下保存数天。注意：除NaOH蚀刻外，也可采用臭氧或等离子体清洁载玻片。
- 3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APES）包被：在通风橱中，将载玻片放入15 ml培养皿中，并加入 300 μl 在每张经 NaOH 蚀刻的载玻片上使用 APES。让 APES 与 NaOH 处理的载玻片反应 5 分钟。超过此时间将导致未反应的 APES 试剂难以洗去。用去离子水彻底清洗载玻片两面，重复两到三次。如果清洗不彻底，在步骤 1.8 中，APES 会被戊二醛氧化，在载玻片上形成棕色沉淀。
- 戊二醛氧化：吸除载玻片表面所有溶液。每个15 cm培养皿中加入25 ml含0.5%戊二醛的PBS溶液，在避光处反应30分钟。30分钟后，吸除全部戊二醛溶液，并使用无尘实验室擦拭纸（例如 使用Kimwipes小心地将载玻片擦干。载玻片可在室温下保存最多一天。
- 凝胶制备：配制含有丙烯酰胺、双丙烯酰胺和ddH₂O的聚丙烯酰胺（PA）混合液后2根据下表，脱气 30 分钟，然后将 PA 混合物置于冰上以减缓聚合。在制胶前加入 APS 和 TEMED，充分混匀。用移液器将 PA 混合物滴加到载玻片表面，盖上 24 mm × 50 mm、1 号盖玻片。避免按压盖玻片与载玻片，防止气泡产生。用于凝胶 >40,000 Pa 使用 100 μl，其他凝胶请使用 350 μl.
| 目标模量 (Pa) | 丙烯酰胺% | 双丙烯酰胺% | 40% 储液丙烯酰胺用量 (ml) | 2% 储液双丙烯酰胺用量 (ml) | 去离子水 (ml) | 过硫酸铵 (μl) | TEMED (μl) |
| 480±160 | 3 | 0.06 | 0.75 | 0.3 | 8.95 | 100 | 10 |
| 4470±1190 | 5 | 0.15 | 1.25 | 0.75 | 8 | 100 | 10 |
| 40,400±2390 | 8 | 0.48 | 2 | 2.4 | 5.6 | 100 | 10 |
改编自6,7。
- 让PA凝胶聚合2小时，然后在去离子水中取下盖玻片。
- 将PA凝胶载玻片置于盛有水的大型Coplan染色缸中，过夜清洗（约8小时），以去除未反应的丙烯酰胺。
- 将载玻片在37 °C烘箱中干燥2–4小时，或直至PA凝胶完全硬化。
- PA凝胶载玻片可密封保存于载玻片盒中，在4 °C下保存一个月。
2. 蛋白质主板制备
- 所有蛋白质应按照供应商推荐的缓冲液配制成10倍浓度的储存液，并分装后于-80 °C保存。大多数细胞外基质（ECM）蛋白质可溶于去离子水，但可能需要逐滴加入乙酸调节pH值。大多数生长因子、细胞因子和重组受体胞外域通常在含BSA的PBS中配制，但具体条件因生产商而异。储存前应使用0.45 μm、4 mm尼龙注射式滤器（Nalgene）过滤蛋白质分装液。
- 根据所需的蛋白质组合和稀释比例设计主阵列板。贴壁细胞通常依赖至少一种相容的细胞外基质介导细胞黏附，但有时也可通过针对细胞表面表位的抗体实现黏附。建议在至少一个孔中加入游离的FITC染料或荧光标记蛋白，以便后续易于定位芯片方向。
- 使用打印缓冲液（含100 mM Tris-乙酸盐/20%甘油/0.05% Triton-100X，pH 5.2）稀释蛋白质组合，制备主阵列板。通常每个384孔板的每孔体积不超过10 μl。
- 将每块主阵列板中各孔的内容物记录在制表符分隔的数据文件中，并为每块主阵列板分配唯一的识别编号。通常采用六位日期后接设计者姓名首字母的方式即可满足需求（格式为MMDDYY首字母）。由于孔内体积较小，可高效利用蛋白质分装液制备大量重复板。建议将主阵列板储存在-80 °C，且每块主阵列板的冻融次数不应超过两次。
3. MEArray 打印
- MEArrays 可使用大多数常规的微阵列点样机器人进行打印。使用硅胶或不锈钢针头的毛细管针打印机效果良好，但蛋白质黏度可能带来问题。毛细管打印机是此应用的理想微阵列点样设备，因其能很好地处理黏稠的蛋白质溶液。
- 为在阵列内获得良好的统计功效，建议每种微环境设置 10 到 12 个重复点样。此类设计可使用简单的 T 检验统计方法，在同一阵列内比较不同微环境之间的活性差异。可采用 Dunnett 检验将对照微环境的活性与其他微环境进行比较。当在开展 MEArray 实验前已将某种功能表型与对照微环境相关联时，该设计效果最佳。
- 湿度应维持在约 50%。湿度控制至关重要，因为低湿度可能导致针头或主板孔内溶液干燥，从而降低在点样基质上的沉积效率。可通过用非渗透性塑料薄膜覆盖点样机器人，并结合使用加湿器和除湿器以维持 50% 的湿度，从而有效控制湿度。冷却的点样板可能有助于保存某些蛋白质，但必须小心避免载玻片表面产生冷凝水。
- 每张打印的阵列应使用耐冷冻载玻片标签进行标记，标签上编码的序列号由主板标识符后接三位数字组成（MMDDYYinitial-nnn）。每当阵列被使用或分发时，其相关实验处理的详细信息应记录在数据库中。追踪主板的打印日期及冻融循环次数，有助于确定维持可重复性的最佳条件。
- 打印完成的 MEArrays 应密封于载玻片盒中，并在 -20 °C 下保存，保存时间不得超过一个月。此后可重复性将明显下降。
4. 在 MEArray 上培养哺乳动物细胞以进行功能分析
- 安装培养室：为了限制培养基体积和所需细胞数量，可在 MEArray 周围安装塑料培养室以限定区域。对于许多阵列，可使用来自双室载玻片（Nunc）的一个单室，其面积为 4.2 cm2。从原装双室载玻片中取下培养室，并用剃刀片将其沿中线切成两半。使用 3 ml 注射器将少量水族用硅胶（DAP）均匀涂在培养室边缘，然后将其压合在 MEArray 表面。注意避免将硅胶直接涂布在阵列的功能区域上。
- 封闭与清洗：MEArray 必须充分冲洗以去除未反应的单体，这些残留单体可能对细胞具有毒性。若使用 PDMS 涂层载玻片，则需首先在打印特征之间的区域施加抗污涂层以阻止非特异性细胞黏附；将阵列置于含 1% Pluronic F108（BASF）的水溶液或含 2% BSA 的水溶液中，在真空条件下孵育 15 分钟。PA 凝胶载玻片无需封闭步骤。所有情况下均需用细胞培养基清洗阵列三次，每次 5 分钟（培养基的选择取决于所用细胞类型，但无论使用何种培养基或细胞，均建议添加抗生素）。PA 凝胶还需额外在培养基中孵育 30 分钟以重新水化凝胶。
- 细胞贴附：四个至五个阵列可放置于一个 15 cm 无菌培养皿内。用培养皿盖覆盖以保持无菌状态。将细胞悬液加入 MEArray 中，使最终细胞浓度为每毫升 10,000 至 1,000,000 个细胞，并加入最终培养基体积的一半。细胞在不同打印微环境中的贴附速率各异。通过倒置显微镜以 15 至 20 分钟为间隔观察，检查贴附是否均匀。轻轻前后晃动 MEArray，可区分呈图案化贴附的细胞与未贴附的悬浮细胞。
- 去除未结合细胞：在 PA 涂层 MEArray 上，可直接吸除未结合细胞，并更换为适当体积的新鲜培养基。而在 PDMS 涂层 MEArray 上，不能完全移除培养基，否则细胞会迅速脱水死亡。因此，在 PDMS 涂层 MEArray 上必须通过反复更换一半体积培养基的方式逐步去除未结合细胞，直至显微镜下确认无残留游离细胞。当使用含血清培养基而非无血清定义培养基，以及使用 BSA 而非 Pluronic F108 封闭未打印区域时，PDMS 的脱湿效应较不明显。
- 细胞可在置于 15 cm 培养皿内的 MEArray 上进行多天培养，并按常规更换培养基。PDMS 载玻片上的换液操作必须通过多次更换一半体积培养基完成。
- 常规固定剂如多聚甲醛和甲醇/丙酮均适用于 MEArray 系统。在 PA 涂层 MEArray 上染色时，固定剂的添加与清洗步骤与传统染色流程相同。但在 PDMS 涂层 MEArray 上染色时，即使在固定过程中也必须保持表面湿润。先吸除一半培养基，替换为固定剂，重复此过程数次，直至孔内大部分液体为固定剂。固定完成后，以相同方式逐步用适合后续分析步骤的封闭缓冲液替换固定剂。
- 免疫荧光染色常用于分析细胞功能。染色流程可能有所不同，但在 PDMS MEArray 上操作时，每次清洗和吸液步骤均需如上所述进行，逐步更换溶液，并始终防止表面脱湿。脱湿会导致染色伪影。
- 可用剃刀片辅助移除培养室。染色后的 MEArray 可使用 Fluoromount-G（Southern Biotech）封片剂加盖盖玻片。检测可通过大多数多色荧光微阵列扫描仪或配备电动拼图成像模式的共聚焦显微镜完成。
5. 代表性结果
使用装有方形硅针头的毛细管针微阵列打印机器人，在印刷的PDMS包被MEArray上进行图案化蛋白沉积的示例如图2所示。通过使用抗体进行免疫荧光检测，可验证所打印的多种蛋白质的沉积情况（图2A）。主孔板中蛋白溶液的稀释梯度可反映其在打印基质表面的沉积量（荧光强度）（图2B）。细胞应以明显的图案化方式附着于打印的特征区域（图2C）。
一个MEArray实验示例显示，在人多能性乳腺上皮祖细胞系（D920细胞）中，两种微环境蛋白的逆向稀释以蛋白浓度依赖的方式诱导出特异性的角蛋白表达谱型，如图3所示。气泡图有助于判断在稀释系列的重复特征点上，特定表型是否被施加于细胞。例如，若微环境中的某一特定分子引起明显的表型变化，当该具有指导作用的组分被充分稀释至中性细胞外基质背景中时，该表型应发生改变或消失。采用Axon 4200a（Molecular Devices）微阵列扫描仪对角蛋白8和角蛋白14中间丝蛋白进行免疫荧光检测。每个MEArray上打印了十二个重复的稀释系列，并以气泡图形式绘制角蛋白8与角蛋白14平均荧光强度的log2比值，以真实反映信号的变异性和可重复性。图中显示的是细胞贴壁后洗去未结合细胞时（图3A）以及培养24小时后（图3B）的MEArray数据。在此相对小规模的分析中，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）确定每个时间点信号相对于均值的方差，并采用分组双尾T检验判断I型胶原和重组人P-钙黏蛋白的不同稀释浓度是否引起角蛋白表达的变化。细胞刚贴壁后，各特征点上的细胞信号无显著变异；然而，在暴露于不同微环境24小时后，细胞间的角蛋白表达出现显著差异。T检验证实，高浓度I型胶原诱导更高的角蛋白8表达，而高浓度P-钙黏蛋白在24小时后诱导出强烈的角蛋白14信号。该结果与先前报道一致，即含有P-钙黏蛋白的微环境可促使双能性乳腺祖细胞呈现表达K14的肌上皮表型4。
在 40,000 Pa 的 PA 凝胶上打印的完整扫描 MEArray 示例见图 4。
图 1. MEArray 实验流程图。首先，使用 PDMS 或 PA 制备打印基底。其次，制备主板并在数据库中进行注释。第三步，打印 MEArray 并用序列号进行编码。第四步，安装培养腔，对表面进行封闭和/或冲洗，然后让细胞贴壁，并洗去未结合的细胞。第五步，根据实验设计，在一定时间的孵育后，可对细胞进行染色或生物检测处理。最后，使用合适的扫描仪和软件获取并分析 MEArray 的图像。
图2. 在细胞贴附前，可通过免疫染色验证打印蛋白的沉积情况及其相对丰度。A) 使用识别IV型胶原蛋白和层粘连蛋白-111的抗体，验证其在MEArray打印特征结构中的存在。B) 利用NIH ImageJ软件中的平均像素强度分析功能，可对从200 μg/ml蛋白溶液开始的一系列稀释样本中两种蛋白的相对丰度进行定性评估。C) D920细胞贴附于经打印PDMS包被的MEArray方形特征结构上的相差显微图像。
图3. 利用MEArray分析多能祖细胞系中角蛋白表达随时间和微环境变化的示例。每个气泡代表附着于MEArray某一特征区域的10–15个细胞中角蛋白8与角蛋白14蛋白水平的比值，表达水平通过免疫荧光探针测定。A）显示细胞刚附着后的角蛋白比值，B）显示平行接种的芯片上培养24小时后的角蛋白比值。两种蛋白的最大浓度为 200 μg/ml 并稀释至原体积的两倍。气泡的直径代表 log 的数值大小2 角蛋白8与角蛋白14平均强度比值，橙色和白色颜色编码表示相应数值 >0 和 <0。图中显示单因素方差分析的 F 值、t 检验的 P 值，以及用括号和箭头标示的被比较的群体。
图4. 使用激光扫描共聚焦显微镜以平铺采集模式获取的MEA阵列扫描示例。在固定前，HCC1569细胞被允许掺入DNA类似物EdU，持续4小时。图中显示了DAPI（蓝色）和EdU（红色）。
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讨论
本文介绍的 MEArray 方法能够实现对细胞与组合微环境相互作用的功能性分析4。MEArray 分析结合了基础微图形化技术、细胞生物学以及微阵列点样机器人和分析设备的使用，这些设备在许多多用户共享平台中均可获得。MEArray 筛选适用于大多数贴壁细胞类型，但在某些情况下可能需要调整无血清培养基配方，添加 BSA 或 <1% 血清以改善细胞贴附。该方法的局限性在于可用于分析特定细胞功能的试剂是否可及；基于荧光的检测与大多数基于阵列的成像系统兼容，但比色检测同样可获得良好效果。该方法尚有其他变体，均支持一个普遍观点：复杂的微环境可通过功能性解析，揭示单个微环境分子及其组合在多种细胞功能中所起的作用8,9。
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致谢
ML 获得了美国国家衰老研究所（NIA）（资助号：R00AG033176 和 R01AG040081）以及美国能源部实验室自主研究与发展项目（合同号：DE-AC02-05CH11231）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 25 mm × 75 mm 玻片 | VWR | 48311-600 | |
| 玻璃盖玻片（1号），24 mm × 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| 染色皿（或 Coplan 罐） | VWR | 25461-003 | |
| 培养皿（15 cm） | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0 N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES（>98% (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| 戊二醛 | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% 水溶液 |
| APS（过硫酸铵）>98% 过硫酸铵 | Sigma-Aldrich | A3678 | 用 ddH₂O 配制 10% 工作液2O |
| TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺） | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| 丙烯酰胺（40%） | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| 双丙烯酰胺（2% w/v） | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μ4毫米尼龙针筒式滤器 | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS（聚二甲基硅氧烷） | 道康宁 | 3097358-1004 | Sylgard 184 弹性体试剂盒（通过 Ellsworth Adhesives） |
| 2孔板 | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| 水族箱密封胶 | 道康宁 | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech<强> | 0100-01 | |
| 一次性塑料杯 | |||
| 压舌板 | |||
| 腈类手套 | |||
| 塑料显微镜载玻片盒 | |||
| 旋涂仪 | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| 烘箱 | |||
| 数字加热板 | |||
| 384孔板 | 适用于微阵列机器人的品牌 | ||
| 微阵列打印机器人 | |||
| 倒置相差及荧光显微镜 | |||
| 轴突微阵列扫描仪 | Molecular Devices | 存在多种构型 |
参考文献
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- LaBarge, M. A. Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).
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