手术过程中通常需要缝线来修复组织。然而，缝线的应用可能存在问题，因为它们具有侵入性，可能会损伤组织。本文报道了一种新型组织粘合剂的制备和应用方法。这种粘合剂薄膜可通过激光激活，无需使用缝线。
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摘要
摘要
光化学组织粘合（PTB）是一种无需缝合线的组织修复技术，通过在两个组织边缘之间施加玫瑰红B（RB）溶液实现1,2。随后用激光照射，该激光被RB选择性吸收。由此产生的光化学反应据信可在产热极少的情况下使组织中的胶原纤维交联3。本报告中，已将RB掺入壳聚糖薄膜中，制备出一种可激光激活的新型组织粘合剂。基于壳聚糖并含有约0.1 wt% RB的粘合薄膜被制备出来，并使用固态激光器（λ=532 nm，能量密度~110 J/cm2，光斑大小~0.5 cm）将其粘合至小牛肠组织和大鼠胫神经上。采用与个人计算机连接的单柱式拉力计测试粘合强度。RB-壳聚糖粘合剂与肠组织的粘合强度为15 ± 6 kPa（n=30），粘合牢固。若不使用激光照射粘合剂，则粘合强度降至2 ± 2 kPa（n=30）。胫神经的吻合也可在无需缝合线的情况下完成。本研究成功制备了一种新型壳聚糖粘合剂，可通过光化学方式与组织粘合，且无需使用缝合线。
方案
1. 壳聚糖粘合剂的制备
- 壳聚糖粉末可溶于乙酸溶液；配制乙酸储备液（2% v/v）时，将10 ml冰乙酸加入490 ml去离子水（DI-H2O）中。
- 配制藏红花红（RB）乙酸溶液储备液（0.01% w/v）时，称取5 mg RB置于用铝箔包裹的样品瓶中以避免光漂白。加入0.5 ml DI-H2O溶解粉末，然后加入49.5 ml乙酸储备溶液（见步骤1.1）。
- 配制壳聚糖溶液（1.7% w/v）时，称取0.85 g壳聚糖粉末（中等分子量，乙酰化度85%），加入50 ml含RB的乙酸溶液中。对照组通过将壳聚糖溶于不含RB的乙酸溶液中制备。
- 向壳聚糖混合物中加入磁力搅拌子，在室温下搅拌。为确保组分完全溶解，将含RB的壳聚糖乙酸溶液搅拌两周，不含RB的壳聚糖乙酸溶液搅拌5天（对照组）。壳聚糖溶解后，溶液pH值从约2.6升至约3.9。需注意，RB在酸性pH下溶解性较差，需提高溶液pH并延长搅拌时间以促进其溶解。
- 将溶液在3270 × g条件下离心1小时，并使用无菌10 ml注射器收集上清液。注意不要扰动杂质沉淀。此步骤可去除溶液中的宏观杂质和不溶物。
- 使用无菌注射器将（经离心的）壳聚糖溶液注入平整的有机玻璃板上。干燥后薄膜的厚度取决于所加溶液量与涂布面积的比例。确保溶液中无气泡，并在板上均匀铺展。为获得厚度约13 μm的薄膜，可在12 cm2的表面面积（尺寸约3×4 cm，图1A）上注入约1 ml溶液。
- 用铝箔等材料制成的筛网覆盖有机玻璃板，以防止溶液光漂白。确保有足够的空气流通，使溶液在筛网下干燥。
- 将溶液在室温（25 °C）和常压（1 atm）下静置干燥，直至形成的薄膜在水中不溶解且无明显溶胀。通常需要2周时间。
- 使用薄而平的刮刀小心剥离薄膜：这些薄膜可轻松从有机玻璃板上剥离而不受损。
- 使用千分尺测量薄膜的厚度。
- 用洁净锋利的剪刀将胶膜裁剪成矩形条状，并夹在无菌载玻片之间以保持其平整形态。用铝箔包裹载玻片以避光，室温保存。根据是否含有RB，分别标记为“玫瑰胶”或“壳聚糖胶”。
- 玫瑰胶薄膜可通过乙醇（90%）或γ射线辐照（0.1 KGy/h，持续24小时）进行灭菌4,5。
2. 黏附光学衰减
- 将玫瑰胶粘剂固定在石英比色皿内。
- 使用双光束分光光度计4，记录其在 400 - 800 nm 范围内的衰减光谱。
- 假设符合比尔定律，按以下公式计算胶粘剂的衰减长度：I = I0e-Ax，其中 I0 为入射光束强度，1/A 为衰减长度，x 为薄膜厚度。
- 对壳聚糖胶粘剂重复步骤 2.1 至 2.3，作为对照。
3. 体外 应用：肠道激光组织焊接
- 动物安乐死后立即采集小牛肠管，并于 -80 °C.
- 使用前，将组织浸入去离子水中进行解冻和水化2O 型 10 分钟。
- 使用#10刀片在手术显微镜（×10）下将组织切成（2 × 1 cm）的片段。用去离子水（DI-H₂O）保持组织片段湿润2O.
- 将切口残端紧密对合（端对端）。用棉签拭去表面多余的水分。
- 使用显微镊子将一条玫瑰色粘性胶带（10 × 6 mm）置于浆膜层切口上，确保其与肠组织完全贴合图2).
- 玫瑰胶粘剂的组织粘附性由半导体泵浦固体激光器激活，该激光器与一根多模光纤（纤芯直径 200 μm)4.
- 将激光功率设为 180 mW，使用所列参数，以约 5 mm 的光斑尺寸照射粘合剂约 6 分钟 表1点照射黏合剂，确保每个点照射约5秒后再将光束移至相邻点。此步骤可确保激光束多次扫描黏合剂的整个表面区域。
- 为评估组织粘合强度，使用机械夹具将样品固定在已校准的单立柱拉力计（Instron，MA，USA）上。以22 mm/min的速度移动夹具，直至两段组织完全分离。4.
- 在组织上放置玫瑰色粘合剂，具体操作如步骤3.5所述。不要对样本进行辐照，而是按照步骤3.8所述测量组织粘合强度。该样本作为对照。
4. 体内 应用：胫神经吻合
- 使用异氟烷/O2混合气体（诱导期4%，之后2%）麻醉Wistar大鼠5。皮下注射布托啡诺（0.03 mg/kg）以提供术中镇痛作用，并缓解可能的疼痛或不适。
- 以下手术操作应在手术显微镜下（×10）进行。在右大腿背外侧做一条长约3 cm的斜行皮肤切口，通过臀肌的肌纤维分离法暴露胫神经2。
- 使用直显微剪刀部分游离并修剪胫神经表面的外膜组织，并用无菌纱布或棉签吸除多余水分。
- 用显微剪刀切断胫神经。
- 使用显微镊将一条无菌壳聚糖条（尺寸为5 × 4 mm）置于胫神经下方。
- 使用显微镊将神经断端在玫瑰状粘合条上对齐并端对端对接。
- 该粘合条完全贴附于神经周围形成一个套环结构，有助于在激光照射过程中旋转神经。
- 按照步骤3.6）和3.7）所述方法，用激光激活玫瑰状粘合条。
- 修剪掉手术神经套环上多余的玫瑰状粘合材料。
- 用五针3-0缝线逐层缝合肌肉和皮肤5。
- 应遵循标准的术后恢复程序，包括每日检查切口是否裂开或出现脓性分泌物，并根据需要给予镇痛药物。
5. 代表性结果
所获得的薄膜呈亮玫瑰色，质地薄且表面光滑（图1）。这些薄膜还具有柔韧性，可卷成小直径的管状结构，而不会产生撕裂或其他明显损伤（图1B）。玫瑰红染料（RB）粘合剂在530 nm和562 nm处有两个吸收峰；因此，绿光激光被该粘合剂强烈吸收，在532 nm处的相应衰减长度约为12 μm（图3）。相比之下，不含RB的壳聚糖薄膜对激光的衰减较弱（1/A ~162 μm），这可能是由于光散射所致。从光谱图可以看出，RB在薄膜中未发生显著聚集。
玫瑰胶在激光照射后能牢固地黏附于肠道（图2），其断裂时的典型最大负载为 0.9 ± 0.4 N（n=30）。黏附强度估算为最大负载除以黏附表面积，即 15 ± 6 kPa（n=30）。未照射激光的玫瑰胶对组织的黏附显著减弱（2 ± 2 kPa，n=30，非配对 t 检验 p<106）。在应用玫瑰胶并结合绿激光实现黏附后，胫神经的体内吻合成功完成。术后一周，手术部位神经保持连续，修复强度达 17 ± 9 kPa（n=10）。
图 1. A) 将 RB-壳聚糖溶液浇铸在一块平整的有机玻璃板上（板厚约 5 mm）。板下方放置坐标纸，以辅助干铸步骤。浇铸两周后获得不溶于水的薄膜。B) 玫瑰胶黏剂具有柔韧性，可卷成小圆柱状。
图 2. 激光照射后，玫瑰粘合剂与小牛肠组织结合。在组织粘合过程中，RB 粘合剂表面接受了均匀照射；但本图中仅显示了部分选定区域，以说明激光对粘合剂的光漂白效应。
图3. 玫瑰色黏合剂的吸收光谱（以任意单位表示）在530 nm和562 nm处显示出两个吸收峰。因此，在激光照射过程中，绿色激光（λ = 532 nm）会被该黏合剂强烈吸收。而不含玫瑰红B（RB）的壳聚糖黏合剂对激光束的吸收较弱。
| n | 面积 (mm2) | 功率 (W) | 时间 (s) | 能量密度 (J/cm2) | 强度 (W/cm2) | 最大载荷/面积 (kPa) | |
| 粘合剂+激光 | 30 | 60 ± 10 | 0.18 ± 0.03 | 365 ± 5 | ~110 | ~0.9 | 15 ± 1 |
| 粘合剂 | 30 | 60 ± 10 | NA | NA | NA | NA | 2 ± 2 |
表1. 说明。n，样本数量；Area，玫瑰状粘合剂的表面积（均值 ± 最大误差）；Power，激光功率（均值 ± 最大误差）；Time，辐照时间（均值 ± 最大误差）；Fluence，平均激光能量密度；I，估算的辐照强度；Max Load/Area，修复组织断裂时的最大载荷除以粘合剂表面积（均值 ± 标准误差）。
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讨论
玫瑰粘合剂的制备基于一种简单的干铸工艺，尽管在酸性pH条件下RB的溶解需要对壳聚糖溶液进行长时间搅拌。必须让溶液完全干燥，直至形成不溶于水的薄膜。当干燥薄膜中的水分含量约为10%时，即可形成不溶性薄膜6。在标准温压条件（约25 °C和约1 atm）下干铸后，通常需要2周时间才能获得不溶性薄膜。组织粘合的机制尚不明确，但已观察到RB会从粘合剂中扩散至邻近组织，从而使激光能够在组织界面高效地对其进行光激活。可以推测，RB在光照下产生活性氧的能力，可能通过组织胶原蛋白和壳聚糖的氨基促进二者之间的交联7,8。最近一项关于玫瑰粘合剂的研究还显示，在组织-粘合剂粘合过程中达到的最高温度约为32 °C，这支持了该过程为光化学反应的假设4。目前多个研究团队正在探索其他无缝合组织修复技术。例如，Pini et al 已成功将激光组织焊接（LTW）应用于眼科手术9。然而，通常情况下，LTW可能导致附带的热损伤，因为在激光照射期间组织温度可升至65–75 °C。临床上也使用氰基丙烯酸酯类胶水代替缝合线闭合皮肤伤口；但因其具有毒性，通常不用于内脏器官的修复...
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致谢
本工作由西悉尼大学研究基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 玫瑰红 | Sigma-Aldrich | 632-69-9 | |
| 壳聚糖（中等分子量） | Sigma-Aldrich | 10318AJ | |
| 冰醋酸 | Sigma-Aldrich | 08050051 | 2% v/v 溶于去离子水中 |
| 磁力搅拌器 | Heidolph | MR Hei-Mix S | |
| 离心机 | Beckman Coulter Inc. | Allegra X-12R | |
| 分光光度计 | Varian Inc., Agilent | Cary 4000 UV-Visible | |
| 激光器 | CNI Laser | MGL-532 | |
| 千分尺 | Mitutoyo | Series 227 | |
| 手术显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | OPMI |
参考文献
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