无透镜片上断层显微技术结合多角度照明与像素超分辨率

摘要

无透镜光学断层成像是一个三维显微技术，在x、y和z方向上的空间分辨率分别达到<1 μm × <1 μm × <3 μm，成像体积可达15–100 mm³，特别适用于与芯片实验室平台的集成。

摘要

断层成像技术在医学领域已被广泛应用，因其能够提供不同尺度物体的三维（3D）结构信息。在微米和毫米尺度上，光学显微技术的应用日益增多，这得益于可见光的非电离特性，以及丰富的照明光源（如激光器和发光二极管）和探测元件（如大尺寸CCD和CMOS探测器阵列）的可用性。近年来发展的光学断层显微技术包括光学相干断层成像、光学衍射断层成像、光学投影断层成像以及光片显微镜技术^1-6。这些平台可对细胞、微生物以及模式动物（如C. elegans、斑马鱼和小鼠胚胎）进行断层成像。

现有的三维光学成像仪通常具有相对庞大且复杂的结构，限制了这些设备在先进实验室之外的普及，并阻碍了其与芯片实验室平台和微流控芯片的集成。为了提供一种替代性的断层显微技术，我们近期开发了无透镜光学断层成像（lensfree optical tomography, LOT），作为一种高通量、紧凑型且成本低廉的光学断层成像模式。⁷ LOT摒弃了透镜和庞大光学元件的使用，转而依赖多角度照明和数字计算，从而在大成像体积上实现对微小物体的深度分辨成像。LOT可在15–100 mm³的大成像体积内，对生物样本实现空间分辨率分别优于<1 μm（x方向）、<1 μm（y方向）和<3 μm（z方向）的成像，尤其适用于芯片实验室平台。

方案

1. 成像设置

LOT 可以组装成紧凑轻便的可现场携带式结构⁸，也可另选组装为具有分段成像能力的微流控光学显微镜⁹。然而，在本报告中，我们将描述用于静态样品断层成像的台式装置的基本成像配置。

1. 照明模块： 在LOT中，可以使用部分相干光源，例如发光二极管（LED）。为了实现实验的灵活性，我们采用配备氙灯的单色仪（Cornerstone T260，Newport Corp.）。将单色仪调节至在中心波长处输出光谱宽度约为1–10 nm的光 例如 450-650 nm。该部分相干光输出随后耦合至多模光纤（Thorlabs AFS105/125Y），以将部分相干光传输至系统。
   光纤安装在电动旋转台（Thorlabs PRM-1Z8，由Thorlabs TDC001控制器驱动）上，以调节照明角度。将带有光源的电动旋转台安装在二维线性X-Y平移台（Newport ILS50CC，由Newport MFA-PPD控制器驱动）上，用于在给定角度下实现光源在平面内的位移。
2. 检测： 无透镜光学断层成像是可扩展的技术，可根据应用需求选择探测器阵列，而无需显著改变图像采集步骤或数据处理流程。本报告中采用的CMOS传感器阵列具有500万像素，像素尺寸为2.2 μm（IDS Imaging，UI-1485LE-M）。该探测器用于记录大视场（例如 24 mm²全息图像的样品被直接放置在探测器活性区域的顶部。如果要实施双轴断层扫描设置 ⁷，探测器还应安装在水平（相对于光学平台）旋转台上例如 Thorlabs RP-01）以在垂直于光轴的平面内旋转样品（连同探测器一起）。 ⁷

2. 样品制备

尽管无透镜光学断层成像技术可用于成像多种物体，如细胞和微生物，但我们将通过对秀丽隐杆线虫（C. elegans）样本进行三维显微成像来阐述其基本原理。

1. 使用解剖刀或刮铲，从含有C. elegans培养物的培养皿中取一小块琼脂。每边几毫米的立方体琼脂块即可包含数百条线虫。
2. 将小块琼脂放入一个聚丙烯小管中，加入1 ml去离子水（DI水）。
3. 轻轻涡旋0.5-1分钟，静置10-15分钟，直至线虫从琼脂块中爬出并进入DI水中。
4. 为暂时固定线虫，加入1 ml 5-10 mM的左旋咪唑溶液（Sigma-Aldrich），静置10分钟。
5. 从管底吸取5-10 μl样品，夹在两张盖玻片之间。此样品含有大量暂时固定的线虫（例如 50-100条），可置于检测器上开始数据采集。

3. 数据采集

本文总结了典型LOT实验的图像采集步骤，该实验通过使用自行开发的LabView界面实现了自动化。

1. 将旋转台的初始角度调整至 -50°，其中 0° 对应光源的垂直位置。
2. 将 X-Y 平台的初始位置调整至 (0,0)，即 HOME 位置。
3. 调整探测器的曝光时间，以最大限度利用其动态范围，使图像尽可能明亮，同时不出现饱和像素。
4. 在不改变旋转台角度的情况下，采集 9 幅图像。对每幅图像，将 X-Y 平台移动至 3×3 方形网格中的一个新位置，使每幅图像相对于前一幅图像移动约四分之一个像素。在每个角度采集更多图像，例如 6×6 网格，可能根据物体类型和信噪比（SNR）提高分辨率。¹⁰
5. 将 X-Y 平台的初始位置重新调整至 (0,0)，即 HOME 位置。
6. 以 2° 为增量逐步增加旋转台的角度，直至达到 +50°。每次增量后，即 在每个新角度，重复步骤 3–5。角度增量可根据采集时间与成像分辨率之间的优化需求设置得更小或更大。
7. （若采用双轴断层扫描方案，则为可选步骤）将安装探测器的水平台旋转 90°，然后重复步骤 1–6。

4. 数据分析

按照第3节中的步骤1-6，获取一组共459张图像，其中包含51个不同照明角度下每个角度对应的9张亚像素位移图像。首先，对每组9张图像进行数字处理，使用像素超分辨率算法¹⁰，以获得每个照明角度对应的一张高分辨率（HR）投影全息图。需要注意的是，像素超分辨率指的是克服无透镜成像中像素尺寸对空间分辨率的限制，而非突破衍射极限。随后，对这些经过像素超分辨率处理的全息图进行数字重构^7-10，以获得51张投影图像。然后利用TomoJ（ImageJ的一个插件，ImageJ为开源图像分析软件）¹¹对这组51张投影图像进行反投影运算。该反投影操作输出样品的三维图像（断层图像）。尽管本文未实施，也可采用参考文献7中所述的双轴断层扫描方案。在此方案中，通过将光源沿相对于第一旋转轴正交的另一轴旋转，获得第二组断层图像，从而提供关于样品的更多空间信息，并提高轴向分辨率。

5. 代表性结果

无透镜光学断层成像的大视场（FOV）在此得以展示 图1由于样本直接放置在探测器阵列上方，因此可在24 mm的视场范围内记录物体的全息图像²，使用具有更大有效面积的新兴探测器阵列可进一步提高该性能。

尽管探测器阵列的像素尺寸限制了记录的全息图像的分辨率，但像素超分辨率技术可缓解这一问题。 图2 显示像素超分辨全息图及重建图像（即 提供亚微米级空间分辨率的投影图像，对应三种不同的照明角度。

投影图像可以利用断层图像重建技术进行组合（例如 滤波反投影）来计算断层图像（即 样本的三维图像 图3 显示了三条穿过蠕虫前端的xy平面切片图像，其中咽部管状结构仅在z=8 μm的切片中可见，这与该近似圆柱形结构（外径约5 μm）的预期相符。此外，xz平面的横截面图像（插图） 图3 上图清晰显示了线虫的边界及内部咽管结构（箭头所示），表明咽部的三维成像已成功实现。

图1 展示了使用无透镜光学断层扫描（LOT）装置在垂直照明下记录的全视场（24 mm²）全息图像。由于LOT具有较大的成像区域，可在单次数据采集过程中同时对大量线虫进行成像。

图 2 显示了秀丽隐杆线虫（C. elegans）在三个不同照明角度下的像素超分辨全息图（左图）和数字重建的投影图像（右图）（从大视野图像中裁剪而来）。每个投影图像包含来自不同观察角度的信息，从而可通过滤波反投影运算计算其三维结构。

图3展示了图2中C. elegans线虫的计算断层图像。（上排）显示了在 z=3 μm 处整个线虫的切片图像。插图为线虫前端的横截面图像。插图的比例尺为 50 μm。（下排）显示了穿过线虫前端的三个切片图像，展示了无透镜光学断层成像技术的光学切片能力。图中箭头指示了线虫咽管上相同位置的点。同时提供了一张显微镜图像（×40，0.65-NA）用于视觉对比。

讨论

需要强调的是，片上无透镜全息显微镜独特的几何结构是实现像素超分辨率和断层成像的关键因素。由于所记录的图像并非如非相干接触成像方法¹²中假设的投影图像，而是投影全息图，因此可以通过全息重建对透射光传播至探测器过程中的衍射效应进行数字校正。因此，样品与传感器之间距离的变化可以被有效补偿。此外，由于样品与传感器之间的距离通常约为 ~0.5–5 mm，而光源距离样品约 4–10 cm，因此实现亚像素位移并不需要大幅移动光源。结果表明，仅将光源移动 50–100 μm 即可在探测器平面上实现亚像素位移，从而避免在i)照明方向/视角以及ii)每个光源位置下的有效样品-传感器距离上产生不必要的变化。若不加以控制，这些变化可能导致像素超分辨率图像中出现显著的像差。因此，在给定角度下，每个光源位置记录的全息图实际上可被视为同一全息图像的亚像素位移版本。此外，无透镜光学断层成像几乎无需对准的设计使其能够非常简便地在不同角度记录投影全息图，只需旋转光源^7,9，或在不同角度使用多个光源（如LED）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
线性 X-Y 平台	Newport Corp.	MFA-PP	微型线性平台
电动旋转平台	Thorlabs	PRM1Z8	电动精密旋转支架
多模光纤	Thorlabs	AFS105/125Y	多模光纤
光源	Newport Corp.	6255	无臭氧氙灯
单色仪	Newport Corp.	74100	Cornerstone 260 1/4 m 单色仪
CMOS 传感器阵列	Aptina Inc.	MT9P031STC	500 万像素 CMOS 传感器
C. elegans 样品	Carolina Biosupply	173500	野生型 C. elegans
左旋咪唑	Sigma Aldrich	L9756-5G	盐酸四咪唑