我们描述了一种用于定量、实时测量细胞核裂解液中DNA糖基化酶和AP内切核酸酶活性的方法。该检测方法可获得适用于动力学分析的DNA修复活性速率，并可适用于组织和肿瘤裂解液或纯化蛋白中DNA修复活性的定量分析。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍一种利用碱基切除修复（BER）分子信标，在细胞核裂解液中对DNA糖基化酶和AP内切酶活性进行定量、实时测量的方法。该方法的底物（信标）由一条脱氧寡核苷酸构成，其中包含一个单一碱基损伤，寡核苷酸5'端连接6-羧基荧光素（6-FAM）基团，3'端连接Dabcyl基团。BER分子信标全长43个碱基，其序列设计可促进形成茎环结构，其中环部含13个核苷酸，茎部含15个碱基对1,2。当该信标折叠成此构象时，6-FAM基团通过荧光共振能量转移（Förster Resonance Energy Transfer, FRET）被Dabcyl有效淬灭，不产生荧光3,4。碱基损伤的位置设计使得在损伤碱基被切除并发生链断裂后，残留的含6-FAM的5碱基寡核苷酸从茎结构中释放。该片段脱离淬灭剂（Dabcyl）后，荧光信号增强，其强度与DNA修复水平成正比。通过连续采集荧光值，可实现对BER活性的实时评估。利用常规的定量实时PCR仪器，可同时分析多个样品。此类含单一碱基损伤的BER分子信标设计适用于动力学分析、BER活性定量及抑制剂验证，并可适用于组织和肿瘤细胞裂解液或纯化蛋白中DNA修复活性的定量检测。使用这些分子信标检测肿瘤裂解液或组织抽吸物中的BER活性，可能适用于功能生物标志物的测定。此外，利用该定量检测方法对纯化蛋白的BER活性进行分析，可为BER抑制剂的发现与验证提供一种快速、高通量的技术手段。
方案
1. 分子信标的设�计
1.1 设计并订购您的分子信标
设计分子信标时必须考虑以下因素：
- 我们使用43聚体DNA寡核苷酸获得了良好的结果。GC含量应为 >32%。排除5'端的G碱基。
- 在5'端进行6-FAM（6-羧基荧光素）标记，在3'端进行Dabcyl修饰。
- 损伤的位置应位于从 5' 端起的第 6 个碱基处。
- 茎环或发夹双链的长度应至少为15 bp。
- 推荐的环长为13个碱基。
- 信标的总体结构如图所示 图1.
- 一旦确定序列和损伤类型，即可向大多数寡核苷酸公司订购寡核苷酸。我们从IDT订购寡核苷酸，并要求其以HPLC纯化，提供形式为粉末或干燥状态。
1.2 退火你的分子信标
- 将冻干的DNA寡核苷酸溶解于寡核苷酸稀释缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0；0.1 mM EDTA）中，配制成浓度为40 μM的浓缩分子信标储备液。
- 使用BER反应缓冲液（见下文）将40 μM的分子信标储备液稀释，制备200 nM的分子信标工作液。取200 nM分子信标工作液加入无菌黑色1.5 mL离心管中。
- 将含有200 nM分子信标工作液的离心管置于盛有沸水的大烧杯中，孵育3分钟。
- 3分钟后，将烧杯从热源移开，在水中继续孵育分子信标过夜，以促进退火。在烧杯上方和下方均覆盖隔热材料，以减缓冷却过程。
- 将分子信标分装至无菌黑色1.5 mL离心管中，每管100 μL。
- 于-30 °C保存。
1.3 分子信标的质量评估
- 进行熔解曲线分析，以确认碱基切除修复（BER）分子信标在加热前不产生荧光，确定最佳熔解温度，并验证每个信标在加热时均能发出荧光。
- 按照 表1 所示，向快速光学96孔板（Applied Biosystems，货号# 4346906）的每孔中加入指定体积的200 nM分子信标工作液和BER反应缓冲液，每个信标加6个孔。
- 使用StepOnePlus（Applied Biosystems）系统或类似设备的实时PCR仪，在熔解曲线分析过程中监测FAM染料的激发情况。
- 将实时PCR仪（StepOnePlus系统）程序设置为在熔解曲线分析中以小幅递增的温度监测FAM染料的激发。StepOnePlus系统的程序设定为检测FAM荧光，并以0.5 °C为间隔从25 °C升至95 °C。典型的熔解曲线如 图2 所示。
- 在低于50 °C的温度下应几乎无或仅有极低的背景荧光。应观察到荧光信号均匀且急剧上升，表明信标纯度高、质量好。Tm值在60 °C至80 °C之间较为理想，且在不同稀释度下应保持一致。
- 根据该分析确定Tmax，即荧光强度达到最大值[Fl(max)]时的温度。在Tm或Tmax时的荧光值与信标输入量（浓度）之间的比例关系应呈线性。在Tmax时的荧光值Fl(max)应至少为37 °C时背景值的5倍以上。
2. 细胞核裂解液的制备
2.1 碱基切除修复反应缓冲液5的配制
- 加入 表2 中列出的所有组分，并用 ddH2O 将缓冲液体积定容至 900 mL。
- 使用 8.0 N 氢氧化钾（Potassium hydroxide）（Sigma，货号#17-8）将 pH 调整至 7.8。
- 用 ddH2O 将缓冲液体积定容至 1000 mL。
- 使用 0.22 μM 滤器（Nalgene 1 L 滤器，货号# 167-0020）过滤缓冲液。
- 在使用 BER 反应缓冲液前立即加入二硫苏糖醇（Dithiothreitol, DTT）。
2.2 细胞培养与细胞分离
- 建议将细胞培养至90-100%汇合度。从4-6个培养皿（150 mm）中分离细胞，以获得足够量的核裂解液用于全套分析（总计约5 × 107个细胞）。
- 建议制备3个独立培养的细胞样本，以获得3个独立的细胞沉淀，从而为每项分析提供生物学重复。
- 可使用NucBuster核提取试剂盒（EMD Bioscience Calbiochem Cat#71183-3）快速制备核裂解液，但任何核分离方案均可适用（见下文第2.3节）。
2.3 细胞核裂解液的制备
- 开始前，先将冻干的蛋白酶抑制剂混合物（Protease Inhibitor Cocktail，Calbiochem，货号#539131，Set 1）用100 μl无菌水重悬，配制成100倍浓缩液。请立即使用，或分装后于-20 °C冷冻长期保存。根据需要，每提取107个细胞使用1 μl该100倍浓缩液。
- 提取过程中的所有步骤均需在冰上或4 °C条件下进行，以确保蛋白质稳定性。
- 标记15 mL Falcon离心管，并置于冰上。
- 移除细胞培养基，用7.5 mL预冷的PBS洗涤细胞两次。
- 向每块培养皿中加入5 mL预冷的PBS，使用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下，转移至预冷的15 mL Falcon离心管中。
- 在低速（500×g，4 °C）下离心5分钟。弃去上清液，并通过比较估算细胞沉淀体积。（单个1.5 mL离心管最多可处理250 μl的细胞沉淀体积）
- 再以500×g离心1分钟，用移液器吸除残留的PBS。根据细胞沉淀体积，用NucBuster Extraction Reagent 1重悬细胞沉淀：每50 μl细胞沉淀体积加入150 μl NucBuster Extraction Reagent 1。（或者，可将细胞沉淀在干冰或液氮中快速冷冻，并于-80 °C保存，待后续实验时使用）
- 重悬后，将裂解液转移至预冷的1.5 mL离心管中。
- 高速涡旋振荡15秒，冰上孵育5分钟，再次高速涡旋振荡15秒。
- 在4 °C条件下以13,000×g离心5分钟。
- 上清液为细胞质组分。将其移出并保存于-80 °C，或弃去。
- 根据每50 μl细胞沉淀体积，用以下混合液重悬沉淀：1 μl已重悬的100倍蛋白酶抑制剂混合物、1 μl 100 mM DTT，以及75 μl NucBuster Extraction Reagent 2。
- 高速涡旋振荡15秒，冰上孵育5分钟，再次高速涡旋振荡15秒。
- 在4 °C条件下以13,000×g离心5分钟。上清液含有核蛋白。收集上清液，并进行下一步操作。
2.4 透析、蛋白质定量与分装
- 透析过程中的所有步骤均应使用预冷的溶液、材料和设备进行，以确保提取物的质量。
- 按照表3详细说明配制透析缓冲液（每个样品需要1 L）。重要提示：缓冲液应保持低温（4 °C）。建议至少提前一天配制。若未添加DTT，过滤后的透析缓冲液可在4 °C长期保存。
- 预先将烧杯（每个样品需2个1 L烧杯）、透析缓冲液、透析槽、微量离心管、注射器和针头冷却。
- 使用前立即向每升透析缓冲液中加入1 mL 1 M DTT。
- 将步骤2.3中制备的裂解液在0.5 L预冷的透析缓冲液中于4 °C轻轻搅拌透析90分钟，使用PIERCE Slide-A-Lyzer透析盒（0.5–3 mL透析盒，截留分子量7,000）。
- 将透析盒转移至另一个含有0.5 L预冷透析缓冲液的烧杯中，继续在4 °C轻轻搅拌透析90分钟。
- 使用注射器（Fisher，货号# 309659）从透析盒中收集透析后的核蛋白溶液。注入蛋白时应使用与之前不同的垫圈。请注意，由于蛋白浓度较高，提取物可能出现结晶。在取出透析后的核蛋白溶液时，应尽量包含那些呈浑浊状的晶体。
- 将样品分装至微量离心管中，每管20 μl。在干冰上快速冷冻后，于-80°C保存直至使用。
- 使用标准方案测定透析后蛋白的浓度。预期核裂解液浓度的示例如表4所示。
- 最后应对裂解液进行质量控制评估。裂解液的评估方法取决于具体实验。如前所述，我们通常通过免疫印迹法检测多种碱基切除修复（BER）蛋白的表达水平1,2。
- 透析步骤的目的是使不同细胞系的反应体系保持一致，便于比较。若省略透析步骤，可能会影响酶反应速率和动力学分析，因为在不同细胞系和制备过程中，由于所需稀释程度不同，盐溶液和反应条件将不再相同。然而，我们观察到，当裂解液蛋白浓度高于5 μg/μl且加入足够反应缓冲液时，可省略透析步骤（数据未显示）。对于无需在不同细胞裂解液之间进行比较的抑制剂研究，可能无需透析。但我们仍建议按上述说明进行透析。
3. 分子信标检测
3.1 仪器设备要求
- 定量实时 PCR 仪器，例如 StepOnePlus qRT-PCR 或同类设备，或可实时检测和测量 FAM 荧光的 96 孔板荧光计。注意：本实验方案适用于任何能够读取分子信标荧光值并实时记录的仪器。然而，该仪器应允许用户访问原始荧光值以进行数据分析。
- 可与所用的光学 qRT-PCR 管或板兼容的离心机。
- Microsoft Excel，用于分析采集的数据。
3.2 缓冲液与试剂
- 光学定量反转录PCR管或板及其相应的盖子。
- BER反应缓冲液（见上文及表2）。
- 按步骤2.3和2.4制备的透析核蛋白提取物，用含DTT的BER反应缓冲液稀释至2 μg/μL蛋白浓度。
- 用BER反应缓冲液将分子信标稀释至200 μM，配制成分子信标工作液（见上文）。
3.3 实验设置（表 5）
- qRT-PCR 仪器通常不作为荧光计使用，因此必须更改运行方法。
- 设置第一阶段程序，将反应温度设为 37 °C，循环时间（测量时间点）为 20 秒，循环次数至少为 180 次（或更多，具体取决于修复实验的设计）。确保在循环过程中收集数据，因此仪器将每 20 秒收集一次数据，持续 1 小时。
- 创建第二阶段程序，将温度升至该分子信标特定的 Tmax（即在步骤 1.3（分子信标质量评估）中确定的最大荧光强度对应的温度）。循环时间仍为 20 秒，共 15 个循环。此阶段将在分子信标可达到的最大荧光强度下，每 20 秒收集一次数据，持续 5 分钟。在 Tmax 下各循环期间测得的荧光值将用于归一化各孔中的荧光值（步骤 4.2a）。若使用多种不同的分子信标，需确保同时设置相应步骤，以获得这些信标在各自 Tmax 下的重复性相近的数据。
- 将反应体积设为 25 μL。
- 使用 Applied Biosystems 的软件在 qRT-PCR 仪器上设置板型设计。我们仅关注原始荧光值，因此选择“标准曲线”作为实验类型。
- 完成板布局设计。示例如 表 5 所示。作为标准曲线所选的孔中切勿添加任何物质。
3.4 进行检测
- 重要提示：使用预冷的材料和溶液。在运行和检测前保持低温。
- 向将要使用的 BER 反应缓冲液中加入适量的 DTT。
- 使用含 DTT 的 BER 反应缓冲液将蛋白溶液稀释至浓度为 2 μg/μL。
- 在初步实验中，我们建议每孔使用 10 μg 透析后的核裂解液（5 μL/孔）和 1 pmol 底物，即分子信标，终浓度为 40 nM（5 μL/孔）。我们使用 10 μg 细胞裂解液 consistently 获得了高质量且可重复的结果，尽管不同细胞裂解液或信标底物可能需要更高或更低的蛋白浓度。
- 每孔的反应体系组分为：15 μL BER 反应缓冲液、5 μL 信标和 5 μL 核裂解液。每种信标/裂解液组合需设三个重复孔。
- 每种信标均需设置多个阴性对照，包括不含信标的样品，例如仅含 25 μL BER 反应缓冲液的样品，以及含 20 μL BER 反应缓冲液加 5 μL 裂解液的样品、含 20 μL BER 反应缓冲液加 5 μL 信标但不含裂解液的样品。
- 每种核裂解液也需设置多个对照样品。其中包括一个阴性对照 [15 μL BER 反应缓冲液、5 μL 对照信标（无损伤位点）和 5 μL 样品裂解液]。我们还建议设置实验阳性对照，例如加入含四氢呋喃（THF）的信标，该信标可模拟含有无碱基位点的寡核苷酸并易于被切割 [15 μL BER 反应缓冲液、5 μL THF 信标和 5 μL 样品裂解液]。当然，具体的阳性对照应根据整体实验设计而定。
- 示例请参见下方的表 5中的板布局。
- 将反应液加入光学管或板时，应将其置于冰上或冷却架上，以尽量减少信号检测前反应的启动。
- 首先将 BER 反应缓冲液加入所有孔中。
- 然后根据板布局将信标加入相应孔中，并始终最后加入裂解液，以尽量减少信号检测前反应的启动。
- 密封管或板，混匀后用离心机短暂离心，使溶液沉降至管底或板底。
- 将板插入 qRT-PCR 仪并开始检测。
- 完成后导出原始数据，最好以 Excel 格式保存。对于 StepOnePlus 系统，仅需多组分数据，该数据包含按染料颜色和孔位排序的多次读数中的所有荧光值。
4. 分子信标检测分析
我们使用 Microsoft Excel 软件进行这些分析和计算。建议建立模板和宏，以便根据标准 96 孔板格式获得的数据进行快速、便捷的分析和图形展示。
4.1 去除背景
- 使用多组分数据中的原始荧光值，首先按孔/样品对数据进行整理。对于 StepOnePlus 系统，可通过“按列导出”数据实现，从而生成一个 Excel 文件，其中每一行显示不同循环次数下各孔的单独多次读数，各孔数据分别位于不同列中。
- 针对每一种分子信标，从使用该分子信标的所有孔在各循环中的荧光值中减去阴性对照中检测到的背景荧光值（20 μL BER 反应缓冲液和 5 μL 信标）。此步骤可消除与裂解液无关的背景荧光变化，避免其对后续分析造成干扰。
4.2 Fl(Tmax) 归一化
为解决不同孔中移液和荧光检测的变异性，我们将数据归一化至最大荧光值（该值与信标输入量相关）。
- 计算单个孔在 Tmax 时各循环的平均荧光值：Fl(Tmax)（步骤 3.3aii）。
- 计算 Fl(循环 x)/Fl(Tmax) 的比值，并乘以 100。在假设 Fl(Tmax) 对应于完全切刻时最大可能荧光值的前提下，这些归一化数据代表游离 FAM 的百分比（即 % BER 切刻探针）。
- 将三个重复样本的数据合并，对每个循环（直至第 180 个循环）的三个孔的（% 游离 FAM）数据取平均值，并计算每个数据点的误差。
- 通过将每个循环乘以 20 秒来计算时间。
- 由于孔间荧光检测的差异可能较为显著，我们建议在分子信标储备液中加入荧光染料（如 ROX），作为标准品以重新调整各孔的荧光值。在此情况下，每个孔均需使用 ROX 染料作为内标（被动参比）。ROX 的激发和发射光谱（激发波长 588 nm，发射波长 608 nm）与本实验中使用的 6-FAM 染料（激发波长 495 nm，发射波长 520 nm）不同。ROX 染料可用于类似常规 RT-PCR 程序的归一化步骤，以校正可能由实验假象引起的孔间差异，这些假象可能来源于移液误差，或孔间荧光检测效率的差异。
4.3 作图
- 在散点图中将归一化的荧光数据（%游离FAM）对时间（秒）作图，并标出相应的误差。
- 我们建议至少使用代表生物学重复的三种不同核裂解液样本分析修复动力学。为评估变异程度，应显示根据各独立实验平均值计算得到的实验间误差。
- 两种肿瘤细胞裂解液的代表性分析：LN428是一种甲基嘌呤DNA糖苷酶（MPG）水平不可检测的胶质瘤细胞系，而LN428/MPG是经基因工程改造后MPG表达升高的同源细胞系；这两种细胞系的AP内切核酸酶1（APE1）水平相当1,2。使用BER THF分子信标（图3）和BER Hx分子信标（图4）分别检测APE1活性和MPG活性，其中THF = 四氢呋喃（APE1的底物），Hx = 次黄嘌呤（MPG的底物）。注意：在图3（THF底物）中，LN428/MPG裂解液的结果显示出比LN428裂解液更低的最大绝对荧光值。这是由于信标输入量较低所致，该值通过Tmax值确定（见3.3a）。当使用此较低值进行数据归一化时，会导致作图结果发生显著变化。这很好地说明了数据归一化的重要性。若仅绘制绝对荧光值，可能会误认为LN428与LN428/MPG细胞之间的修复速率存在差异。然而，当数据经过归一化以校正孔间变异后，可看出APE1介导的修复速率差异极小。
5. 代表性结果
我们描述了一种利用碱基切除修复（BER）分子信标（图1），在细胞核裂解液中对DNA糖基化酶和AP内切酶活性进行定量、实时检测的方法。退火完成后，建议进行熔解曲线分析（表1），以评估所制备分子信标的质量（图2）。随后可制备核裂解液，所用缓冲液组分见表2。将裂解液置于0.5 L预冷的透析缓冲液中，在4 °C下轻轻搅拌透析90分钟，透析装置采用PIERCE Slide-A-Lyzer透析盒，透析缓冲液组分见表3。使用注射器从透析盒中收集透析后的核蛋白溶液。注入蛋白时应使用与之前不同的密封垫圈。采用标准方法测定透析后蛋白的浓度。预期的核裂解液蛋白浓度示例见表4。按照上述说明（步骤3.4）进行反应，实验板布局见表5。以两种肿瘤细胞裂解液为例：LN428，一种甲基嘌呤DNA糖基化酶（MPG）表达水平不可检测的胶质瘤细胞系；LN428/MPG，同一细胞系经基因工程改造后MPG表达升高；两种细胞系中AP内切酶1（APE1）的表达水平相当1,2。分别使用BER THF分子信标（图3）和BER Hx分子信标（图4）检测其APE1和MPG活性，其中THF代表四氢呋喃（APE1的底物），Hx代表次黄嘌呤（MPG的底物）。最后，使用一种可报告尿嘧啶糖基化酶活性的BER dU/A分子信标，我们发现信号输出或信号强度在蛋白加样量为10 μg时达到最大，而在0.62 μg时降至无法检测的水平（图5）。
图1. BER分子信标的总体结构。 图中展示了本研究所用BER分子信标的序列及其整体设计，分别为单链状态、退火后以及再次熔解后的构象。序列中加粗斜体部分为茎区（15个碱基），带下划线部分为环区（13个碱基）。FAM = 5'端荧光染料6-羧基荧光素［位于5'端；最大吸收波长（Abmax）= 495 nm，最大发射波长（Emmax）= 520 nm，消光系数（260 nm）：20,960；在最大吸收波长处的消光系数：75,000］；Dabcyl = 3'端淬灭基团Dabcyl［位于3'端；最大吸收波长（Abmax）= 453 nm；淬灭范围 = 425–520 nm］。X = 损伤位点（根据研究问题不同而变化），Y = 与损伤相对的碱基（根据研究问题不同而变化）。
图2. 熔解曲线。 显示了BER分子信标对照 (A)、含有四氢呋喃（THF）部分的BER分子信标 (B) 或含有次黄嘌呤（Hx）部分的BER分子信标 (C) 的代表性熔解曲线。寡核苷酸浓度范围为0 nM（深蓝色）、8 nM（红色）、16 nM（绿色）、32 nM（紫色）、64 nM（蓝色）至128 nM（橙色）。如步骤1.3所述，将退火后的寡核苷酸以0.5 °C为间隔从25 °C加热至95 °C，StepOnePlus系统被设定为在每个0.5 °C间隔测量FAM荧光。
图 3. 使用 BER THF 分子信标的代表性数据。 在对照细胞系（LN428）和 MPG 过表达细胞系（LN428/MPG）的核裂解液中，检测了针对无碱基位点类似物四氢呋喃（THF）水解的 AP 内切酶活性。每种裂解液分别使用 BER 分子信标对照（LN428，绿色；LN428/MPG，紫色）或 BER THF 分子信标（LN428，蓝色；LN428/MPG，红色）进行分析。结果以 (A) 平均荧光响应单位和 (B) 如上文第 4 节所述归一化至信标输入量的相同数据表示（THF = 四氢呋喃）。
图 4. 使用 BER Hx 分子信标检测的代表性数据 在对照细胞系（LN428）和 MPG 过表达细胞系（LN428/MPG）的核裂解液中，测定了特异性切除 MPG 底物次黄嘌呤（Hx）的 DNA 糖基化酶活性。每种裂解液分别使用 BER 分子信标对照（LN428，绿色；LN428/MPG，紫色）或 BER Hx 分子信标（LN428，蓝色；LN428/MPG，红色）进行分析。结果以 (A) 平均荧光响应单位和 (B) 如上文第 4 节所述进行归一化处理的相同数据表示（Hx = 次黄嘌呤）。
图 5. 使用 BER dU/A 分子信标在不同蛋白质水平下的代表性数据。 在 T98G 细胞的核裂解液中检测了特异性去除尿嘧啶（dU/A）的 DNA 糖基化酶（UNG）活性。如图所示，使用 BER 分子信标对照或 BER dU/A 分子信标对 T98G 裂解液在 10、5、2.5、1.25 或 0.62 μg 蛋白质水平下进行分析。结果为如上文第 4 节所述的归一化数据。
| 分子信标浓度 (nM) | 0 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 |
| 分子信标工作液 (200nM) 添加体积 (μL) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 |
| BER反应缓冲液 (不含DTT) (μL) | 25 | 24 | 23 | 21 | 17 | 9 |
表1. 熔解曲线实验的布局。
| 总体积 1 L | 所需储存液体积 | 储存液浓度 | 终浓度 |
| HEPES-KOH | 25 mL | 1M pH7.8 | 25 mM |
| KCl | 75 mL | 2 M | 150 mM |
| EDTA | 1 mL | 0.5M pH8.0 | 0.5 mM |
| 甘油 | 10 mL | N/A | 1% |
| DTT（使用前添加） | 0.5 mL | 1 M | 0.5 mM |
| H2O | 888.5 mL | N/A | N/A |
表2. BER反应缓冲液。
| 总体积 1 L | 所需储存液体积 | 储存液浓度 | 终浓度 |
| HEPES-KOH | 50 mL | 1M pH7.5 | 50 mM |
| KCl | 50 mL | 2 M | 100 mM |
| EDTA | 1 mL | 0.5M pH8.0 | 0.5 mM |
| 甘油 | 200 mL | N/A | 20% |
| DTT（使用前添加） | 1 mL | 1 M | 1 mM |
| H2O | 698 mL | N/A | N/A |
表3. 透析缓冲液。
| 细胞系 | 蛋白浓度 (μg/μL) |
| LN428 | 5.34 |
| LN428/MPG | 4.79 |
表4. 蛋白质测定结果。
| 阴性对照 25μL BER缓冲液 | （背景对照）20μL BER缓冲液 5μL Con Beacon 无裂解物 | （三复孔检测） 15μL BER缓冲液 5μL Con Beacon 5μL LN428裂解物 | （三复孔检测） 15μL BER缓冲液 5μL Con Beacon 5μL LN428/MPG裂解物 |
| 阴性对照 25μL BER缓冲液 | （背景对照）20μL BER缓冲液 5μL THF Beacon 无裂解物 | （三复孔检测）15μL BER缓冲液 5μL THF Beacon 5μL LN428裂解物 | （三复孔检测）15μL BER缓冲液 5μL THF Beacon 5μL LN428/MPG裂解物 |
| 阴性对照 20μL BER缓冲液 5μL裂解物 | （背景对照）20μL BER缓冲液 5μL Hx Beacon 无裂解物 | （三复孔检测） 15μL BER缓冲液 5μL Hx Beacon 5μL LN428裂解物 | （三复孔检测）15μL BER缓冲液 5μL Hx Beacon 5μL LN428/MPG裂解物 |
| 阴性对照 20μL BER缓冲液 5μL裂解物 |
表5. 分子信标检测体系的建立。
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讨论
已有超过600篇文献引用“分子信标”这一术语，用于检测和定量多种分子及酶活性，包括解旋酶活性6、DNA聚合酶活性7,8、DNA连接酶活性9、端粒酶活性10、DNA光解酶活性11以及DNA/RNA杂交体12等。除了将分子信标用于上述DNA修复活性的检测外，我们及其他研究者已证明这些探针在分析碱基切除修复（BER）活性方面的有效性1,2,13-15。
本文所述的实时碱基切除修复（BER）活性检测方法包含一个单一修饰碱基，可对不同损伤或损伤对侧碱基的改变进行BER速率的定量评估。该方法的应用范围可从分子机制研究扩展至抑制剂筛选。我们通过比较MPG表达细胞与非表达细胞的裂解液以及对照分子信标的无活性状态，验证了BER的特异性。该检测方法具有高灵敏度，能够检测BER蛋白MPG2或XRCC11表达缺陷，并足以检测DNA修复动力学参数的微小变化以及DNA修复抑制剂的效果[论文在准备中]。在主动修复过程...
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披露
RWS 是Trevigen, Inc.的科学顾问。其余作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究获得了匹兹堡基金会和美国国立卫生研究院（NIH）[GM087798；CA148629；ES019498] 向 RWS 提供的资助。美国国立卫生研究院的癌症中心支持拨款 [P30 CA047904] 为 UPCI 慢病毒设施向 RWS 提供了支持。匹兹堡大学药理学与化学生物学系向 DS 提供了资助。ESTRO 向 CV 提供了支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化钾 | Fisher | P217-500 | 分子级 |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| 甘油 | Fisher | BP229-1 | 分子级 |
| DTT | Fisher | BP172-5 | |
| HEPES-溶液 | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-盐 | Sigma | H4034-500G | |
| 氢氧化钾 | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM 滤膜 | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer 透析产品 | Pierce | 66373 | 分子量截留值 7000 |
| 注射器 | Fisher | 309659 | |
| 针头 | Fisher | 305196 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Fisher | 05-408-129 | 黑色 |
| 15 mL Falcon 管 | Fisher | 352097 | |
| NucBuster 蛋白提取试剂盒 | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| 分子信标 | IDT | ||
| BioRad 蛋白检测试剂染料浓缩液 | BioRad | Cat# 500-0006 |
参考文献
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