组织工程用静电纺丝纤维的后期加工处理

摘要

静电纺丝支架可在制备后进行加工，以用于组织工程应用。本文介绍了制备复杂结构支架的方法（通过连续纺丝）、制备更厚支架的方法（通过多层叠加并采用热处理或蒸汽退火）、实现无菌性的方法（无菌制备或制备后灭菌），以及获得适宜生物力学性能的方法。

摘要

静电纺丝是一种常用于制备三维组织工程支架（通常为可生物降解）的通用方法。^{1, 2, 3} 许多组织 体内 在儿童生长过程中，皮肤、膀胱、盆底甚至硬腭等组织会经历不同程度的双轴拉伸。为这些应用制备支架时，需要开发具有适当生物力学性能（无论是否含有细胞）且适用于临床使用的无菌支架。本文的重点并非建立基本的静电纺丝参数（关于静电纺丝已有大量文献报道），而是探讨如何在纺丝支架制备完成后对其进行改性，以满足组织工程的需求——此处将考虑支架的厚度、力学性能和灭菌处理（临床应用所必需），并描述如何在支架上培养细胞并施加双轴应变，以使其适应特定应用。

静电纺丝 tends to produce 薄片；随着静电纺丝收集器表面覆盖上绝缘纤维，其导电性变差，导致纤维不再沉积于其上。因此，我们介绍了通过热或蒸汽退火来制备更厚结构的方法，这些方法可增强支架的强度，但未必提高其弹性。本文还描述了依次纺丝不同聚合物支架以构建复杂结构的方法。灭菌方法可能对支架的强度和弹性产生不利影响。我们比较了三种灭菌方法对聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）静电纺丝支架生物力学性能的影响。

本文描述了在支架上培养细胞的成像方法，以及评估细胞在支架上产生细胞外基质（ECM）蛋白的情况。体外在支架上培养细胞可增强支架的强度和弹性，但组织工程文献表明，细胞在静态培养条件下往往无法产生适当的细胞外基质。目前市面上可用于在动态培养条件下培养支架上细胞的商业系统较少，其中一个例子是Bose Electroforce 3100，该系统可通过机械夹具在充满培养基的腔室内对支架中的细胞施加特定的培养程序⁴。本文还介绍了一种低成本、可在二维方向上实现可控形变的细胞培养生物反应器方案。我们证明，在这些条件下可诱导细胞产生弹性蛋白。最后，本文描述了对经培养处理的支架（无论是否接种细胞）进行生物力学性能的评估方法。

方案

1. 随机与取向纤维的静电纺丝

静电纺丝利用电势将聚合物溶液牵引至接地的收集器，从而形成精细的纤维网络。收集器可以有多种形状，可以是静态的，但更常见的是可旋转的。在溶液到达收集器之前，溶剂已蒸发，射流固化形成纤维。

每种聚合物都需要特定的条件才能制备出特定类型的纤维。聚合物的浓度、溶剂种类、溶液喷头与接地收集器之间的距离、两者之间的电势差、旋转收集器的转速、流速、温度和湿度等因素均会影响静电纺丝过程。已有大量研究描述了静电纺丝参数的选择及其对所制备支架的影响（例如纤维直径、形貌和取向）^{5, 6, 7, 8}。本实验中，支架的制备是基于我们先前研究中确定的工艺条件进行的^{2, 9}。

以下方法适用于使用旋转收集器制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）、聚乳酸（PLA）、聚ε-己内酯（PCL）和聚羟基丁酸-共-羟基戊酸酯（PHBV）的电纺支架，如图1所示。整个过程中均使用二氯甲烷（DCM）作为溶剂。该方法可制得微米级纤维的PLGA、PLA和PCL支架，以及具有微米级珠状结构（“珍珠项链”形态）的纳米级纤维PHBV支架。

1. 将铝箔包裹在旋转芯轴收集器上，抛光/光亮面朝外。我们的芯轴宽20 cm，直径10 cm。
2. 配制聚合物溶液：将PLA、PCL和PHBV分别配制成10 wt%的DCM溶液，PLGA配制成20 wt%的DCM溶液。
3. 在注射泵上安装4个5 ml容量的注射器，每个注射器装载5 ml聚合物溶液，共20 ml。
4. 对于PLA、PCL和PHBV，每支注射器的流速设为40 μLmin^-1。
5. 对于PLGA，每支注射器的流速设为30 μLmin^-1。
6. 对于PLA、PCL和PLGA，针尖到芯轴的工作距离为17 cm。
7. 对于PHBV，针尖到芯轴的工作距离为10 cm。
8. 将注射器针头施加+17000 V电压（73030 P, Genvolt, Shropshire, UK），并在适当距离下将纤维电纺至覆有铝箔的芯轴上。
9. 制备随机取向纤维时，芯轴转速设为200 rpm。
10. 制备取向纤维时，芯轴转速设为1000 rpm。
11. 支架可保存在铝箔上，置于干燥环境中。建议在含有干燥剂的密封容器中于4 °C保存。根据我们的经验，支架在此条件下至少可稳定保存4个月（可能更久）（目前我们未见有关支架长期保存条件的已发表研究）。

2. 通过连续纺丝制备复杂支架

顺序电纺提供了一种结合不同材料特性的方法，从而制备出兼具两者优点的复合材料。PHBV 电纺形成平坦、致密且脆性的薄膜，而 PLA 或 PCL 电纺则产生低密度、具有弹性的薄膜。两种材料均支持细胞黏附。将这些材料依次进行电纺，可获得兼具致密性、细胞不可穿透性及弹性的膜结构。

1. 按照第1节所述设置静电纺丝装置，并采用PHBV的纺丝条件。
2. 如上所述进行PHBV的静电纺丝。
3. 不更换铝箔，使用第二种聚合物的参数和常规条件（例如，滚筒到针头距离17 cm，电压17000 V，转速200 rpm，适用于PLA）在其表面继续进行静电纺丝。该叠加过程可形成双层支架结构，从而制备出双层膜。

3. 通过将多层材料热处理结合制备多层支架

1. 可通过热退火实现支架的多层结构。具体操作是将4层PLGA叠放在一起，然后在60 °C下热退火3小时。
2. 支架也可通过蒸气退火进行处理。将4层PLGA叠放在一起，悬置于二氯甲烷（DCM，10 ml）液面上方2 cm处，室温下在密闭容器中处理1小时。

4. 静电纺支架的无菌制备及制备后灭菌

1. 在洁净室环境中的超净台无菌条件下进行静电纺丝，可实现支架的无菌制备。为此，可使用医用级无菌聚合物，或通过在二氯甲烷（DCM）中孵育灭菌的聚合物。聚合物溶解后，通过静电纺丝沉积到包裹在已灭菌芯模上的无菌箔上。随后对支架进行无菌操作。通过将支架样品在不含抗生素的适宜培养基中孵育适当时间，以验证其无菌性。
2. 对于乙醇消毒（此方法在实验中有用，但并非被认可可用于临床的灭菌方法），将支架短暂（15分钟）浸入70% v/v的乙醇水溶液中。出于实际实验目的，此步骤通常足以对支架进行消毒，使其随后可成功与培养细胞结合。
3. 对于过氧乙酸灭菌，将支架浸入含0.1% v/v过氧乙酸的磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在室温下孵育3小时，具体操作如Selim et al.⁹所述。
4. 对于γ射线灭菌，使用铯源对支架进行辐照，剂量为3 kGy，具体操作如Selim et al.⁹所述。

5. 支架的生物力学测试

1. 将支架切成 5 mm × 20 mm 的矩形，使用千分尺测量其厚度后，置于 Bose Electroforce 3100 仪器中。该设备可施加 0–22 N 的力，最大位移达 6 mm，并绘制载荷与位移的关系曲线，即应力/应变曲线。由此可计算杨氏模量和弹性。

6. 在支架上可视化细胞并评估细胞外基质的产生

细胞可用活体荧光染料进行染色，从而在细胞贴附、迁移和增殖过程中观察支架上的细胞。培养结束后，可通过4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）对细胞核染色，以确定细胞在支架上的存在情况。通过染色多种细胞外基质（ECM）蛋白（如本示例中的弹性蛋白），可评估细胞在支架上产生细胞外基质的能力。所使用的所有支架经测量厚度均至少为0.2 mm，并在接种前被切成1.5 cm × 1.5 cm的正方形。

在这些研究中，始终使用人真皮成纤维细胞，因为它们在软组织重建中发挥重要作用，而软组织重建正是我们实验室的主要研究方向。

细胞来源于接受乳房缩小术或腹壁成形术（患者已同意将其组织用于科研目的）的患者的皮肤样本。组织在研究用组织库许可证12179下进行收集并匿名使用。组织用含链霉素（0.1 mg/ml）、青霉素（100 IU/ml）和两性霉素B（0.5 μg/ml）的PBS洗涤。组织样本在含0.1% w/v胰蛋白酶和0.1%葡萄糖的PBS中孵育（12–18小时，4 °C）。将真皮层剥离，切碎后用10 ml胶原酶（0.5% w/v，溶于DMEM和10% FCS中）在37 °C孵育18小时。将所得细胞悬液离心（400 g，10分钟），获得细胞沉淀，可将其在DMEM培养基中培养和传代，DMEM中添加胎牛血清（FCS，10% v/v）、链霉素（0.1 mg/ml）、青霉素（100 IU/ml）和两性霉素B（0.5 μg/ml）。实验仅使用第4至第9代的成纤维细胞。

1. 当人真皮成纤维细胞在T75培养瓶（EasyFlask，Nunc，美国纽约）中达到融合状态时，加入胰蛋白酶/EDTA溶液（5 ml，含胰蛋白酶5 mg/ml，EDTA 2 mg/ml，溶于生理盐水），在37 °C孵育5分钟进行消化。将细胞悬液以150 g离心10分钟。细胞沉淀用5 ml DMEM培养基重悬（添加10% v/v胎牛血清、0.1 mg/ml链霉素、100 IU/ml青霉素和0.5 μg/ml两性霉素B），使用血细胞计数板计数，并调整细胞浓度后进行接种。通常每孔接种50,000个细胞。
2. 如需在接种至支架前对细胞进行预标记，可使用CellTracker红色或绿色荧光探针标记细胞。细胞用PBS洗涤3次，每次5 ml。加入10 ml无血清、适用于该细胞的培养基配制的10 mM CellTracker溶液，在37 °C孵育45分钟。孵育结束后，用PBS洗涤3次，每次5 ml，随后将细胞接种至支架上。之后可在Axon ImageExpress显微镜（Molecular Devices，美国森尼韦尔）下对支架表面进行成像，激发/发射波长分别为570 nm λex - 620 nm λem（CellTracker红色）和480 nm λex - 533 nm λem（CellTracker绿色）。为观察细胞向支架内部的渗透情况，可使用多光子共聚焦显微镜，该方法可在有或无细胞的情况下实现约200微米深度的成像穿透。
3. 培养后的样品用1 ml含3.7%甲醛的PBS溶液在37 °C固定20分钟，随后用PBS洗涤3次，每次1 ml。
4. 向每个样品中加入200 μL弹性蛋白一抗溶液（5% v/v PBS稀释，兔抗人α-弹性蛋白抗体，AbD Serotec，英国基德灵顿），在37 °C孵育30分钟。
5. 样品用PBS洗涤3次，每次1 ml，然后在含有DAPI（1 μg/ml）的PBS溶液中孵育30分钟，该溶液中含有二抗（0.5% v/v山羊抗兔IgG (FC):FITC）。
6. 随后，样品再用PBS洗涤3次，每次1 ml。
7. DAPI与二抗染色的样品在Axon ImageExpress荧光显微镜下成像，DAPI的激发/发射波长为365 nm λex - 460 nm λem，二抗为480 nm λex - 533 nm λem。DAPI可标记细胞核，从而清晰显示细胞在纤维结构中的分布情况。

7. 对支架上的细胞施加双轴动态培养

为了研究动态培养对成纤维细胞ECM产生的影响，我们开发了一种简单的概念验证型生物反应器来探索这一效应。

1. 组装球囊和流量调节装置，并准备好系统，以便在涂覆后能方便地放入适合细胞培养的无菌容器中。
2. 对包括球囊在内的装置进行高压灭菌（122 °C，220 mBar，持续1小时）。我们可通过反复充气和放气来确认球囊能够耐受高压灭菌，且其功能不受不利影响。
3. 在洁净室内，于超净工作台中拆开装置包装，准备进行静电纺丝。
4. 用磷酸盐缓冲液（PBS）将球囊充气至所需表面积（注意球囊仍需能够放入培养容器中），并将PBS在装置非无菌区域（三通阀的支管）连接至电气接地。
5. 使用常规纺丝条件，以10 cm的工作距离将所需聚合物静电纺丝沉积到球囊表面。让支架干燥1小时。“湿态”纤维具有足够的黏附性，可牢固附着在球囊表面而不会脱落。
6. 将球囊放入无菌容器中，并转移至适合细胞培养的超净工作台。
7. 将球囊从容器中取出，置于无菌表面（如培养皿）上，每隔20秒重复滴加一次细胞悬液（5 ml DMEM中含有1 × 10⁶个细胞），持续20分钟，以尽量使细胞在表面均匀分布。
8. 将球囊放入培养容器中，并加入适用于该细胞类型的预热培养基。
9. 将充气装置连接至注射泵（Kent Scientific, Genie Plus, Connecticut, US），根据需要对球囊进行充气和放气，以实现双轴拉伸。可使用计算机控制的注射泵以实现更复杂的拉伸程序。

8. 代表性结果

如果按照上述方法操作，以下图示为可预期的代表性结果。

静电纺丝可用于制备具有随机和有序结构的支架（图1），该方法可重复性好，且纤维均匀。多种类型的聚合物均可通过静电纺丝制备，其特性差异显著，如图2所示的PHBV、PLA或PCL。静电纺丝可生成轻质蓬松的支架，也可形成致密且细胞无法穿透的膜（见图3）。此处所示的所有支架均能促进细胞黏附与增殖。既往研究表明，细胞可迁移进入这些支架，深度至少达500–600 μm。⁹ 对于PLA，平均纤维直径为3 μm；对于PHBV，平均直径为0.3 μm，串珠结构直径范围为5–20 μm；对于PCL，平均直径为3 μm；对于PLGA，平均直径为11 μm。其他采用不同溶剂体系的研究报道，PHBV可被静电纺丝成无串珠或聚合物珠粒的纤维。^10,11

如果需要更厚的支架，可采用蒸汽和热退火方法将多层支架粘合在一起（见图4）。这些支架层不会发生分层，且很难观察到层间的结合界面。

我们展示了可以制备双层膜，使细胞A和细胞B分别在独立的膜上培养，且互不混合，如图5所示。在此，我们通过使用两种不同荧光细胞示踪染料标记的人类皮肤成纤维细胞来演示这一方法。这种双层膜在细胞培养中具有重要应用价值，例如在一侧培养形成硬组织（如骨或软骨）的细胞，而另一侧则培养形成软组织（通常生长较快）的细胞，可用于腭裂修复或牙周重建手术。^{12, 13}

关于灭菌对静电纺支架的影响，我们此前已报道过，灭菌方法会影响支架本身及其后续的细胞培养效果。⁹ 图6 展示了过氧乙酸、γ射线辐照和乙醇处理对PLGA支架纤维直径以及极限抗拉强度和杨氏模量的影响。

伽马辐照对纤维直径无显著影响，而过氧乙酸和乙醇均使其直径减少约50%。就极限抗拉强度而言，各种灭菌方法均改变了支架的极限抗拉强度和弹性。在这些支架上进行细胞培养进一步降低了极限抗拉应力，但提高了弹性。

最后，本文介绍了一种用于检测动态双向拉伸对在电纺支架上培养的细胞影响的方法。这一概念验证方法表明，细胞在动态拉伸条件下仍保持活性，并且在这些条件下产生更多的弹性蛋白。相比之下，当相同细胞在相同支架上处于静态培养时，则几乎不产生弹性蛋白（见图7）。

图1. 展示了静电纺丝装置的示意图，以及随机和取向纤维的纺丝过程，随后是多层纤维依次叠加的结构。通过将一组取向纤维静电纺丝沉积到铝箔上，然后将铝箔旋转90°，立即在第一层之上再沉积第二组取向纤维，即可制备出正交排列的纤维结构。

图2. 显示了随机电纺膜的形貌：(A) 聚乳酸（PLA）（比例尺为100 μm），(B) 聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸酯)（PHBV）（比例尺为100 μm），(C) 聚己内酯（PCL）（比例尺为100 μm）和(D) 聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）（比例尺为200 μm）。请注意，PLA、PCL和PLGA均为具有均匀微米级纤维结构的支架。PHBV则呈现“珍珠项链”状结构，由直径为5–20 μm的珠状颗粒通过纳米纤维连接而成。 点击此处查看高清大图。

图3. 多层支架的制备。首先使用PHBV电纺制备支架，然后使用装有PLA或PCL的注射器在其上继续电纺。这些材料被纺丝沉积在PHBV支架的上方。该图展示了这些多层支架的外观：(A) 单一PHBV层；(B) PHBV-PLA双层支架的横截面，显示致密的纳米纤维“珍珠项链”状PHBV层（左侧）和更为疏松的微米级纤维PLA层（右侧）；(C) 单一PLA层。 点击此处查看高清大图。

图4. 通过热退火和蒸气退火可制备更厚的支架。(A) 和 (B) 显示了经蒸气退火处理的聚乳酸（PLA）支架的截面图，其中初始纤维支架厚度约为 150 μm，通过使用二氯甲烷蒸气将其堆叠并融合，形成厚度可达 500 μm 的更厚支架。(C) 和 (D) 中可见，该支架由较厚纤维层与较薄纤维层交替组成，这些结构是通过将薄纤维层和厚纤维层共同进行热退火处理而形成的。该方法可用于制备具有复杂力学性能的支架。 点击此处查看高清大图。

图 5. 细胞在双层支架上的形态。所有情况下所用细胞均为人真皮成纤维细胞。(A) 固定并用 DAPI 染色的人真皮成纤维细胞，培养于电纺 PLA 上。(B) 在 PHBV 上经 DAPI 染色的细胞。(C) 成纤维细胞预先用活细胞染料 CellTracker green 进行染色，可见其在双层支架 PLA 侧的形态。(D) 双层支架的截面图，下层 PHBV 表面为红色染色的成纤维细胞，上层 PLA 表面为绿色染色的成纤维细胞。(E) 预先用 CellTracker red 染色后在 PHBV 表面培养的成纤维细胞。使用活体荧光染料为观察细胞在支架上的分布提供了一种便捷的方法，且可在细胞持续生长过程中进行检测。这些染料通常可连续使用至少 7 天。然而，随着细胞分裂，染料浓度会逐渐稀释。比例尺等于 0.1 mm。

图6. 使用 Bose Electroforce 张力仪设备获得电纺支架的生物力学性能（A）。（B）经γ射线辐照、乙醇、过氧乙酸灭菌或无菌制备的PLGA支架的应力-应变曲线。从该类图中可获得三项测量值：纤维断裂前可承受的最大抗拉应力（UTS）、最大抗拉应变以及杨氏模量。后者用于表征支架的弹性。（C）各灭菌方法对PLGA纤维直径（μm）的影响。每种灭菌方法均使其UTS下降。过氧乙酸和γ射线辐照均降低杨氏模量，使支架更具弹性；而乙醇处理则使支架变得尤为脆性。 点击此处查看高清大图。

图7. 本图展示了一种利用简单气球提供双轴拉伸生物反应器的方法，可用于对支架材料（以及在支架内生长的细胞）施加周期性双轴拉伸。 (A) 一个未充气的气球，其表面已沉积电纺纤维PHBV；此时气球部分区域被纤维覆盖。 (B) 一个完全被PHBV和PLA纤维包覆的气球。 (C) 将细胞悬液反复用移液器滴加到气球表面。 (D) 将气球置于装有无菌培养基的瓶中，气球连接至注射泵，并使用PBS（作为导电电解质）按照预设程序轻柔地充气和放气。 (E) 实验结束后，将支架上的细胞从气球上取下，并进行细胞活力分析，结果如(F)所示：活细胞通过代谢指示剂3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）染色呈现深蓝色。 (G) 显示在该气球上培养并接受双轴拉伸的细胞（蓝色）产生了弹性纤维（绿色，使用特异性抗弹性蛋白抗体染色），而在相同支架上(H)、静态条件下培养的对照组细胞几乎不产生弹性纤维。比例尺等于0.025 mm。

讨论

静电纺丝是一种用于制备组织工程支架的非常流行的技术。^{14, 15, 16} 尽管制备基本的静电纺丝支架用于实验相对简单，但该技术本身复杂且具有多面性，涉及众多变量。⁶ 许多研究描述了静电纺丝参数如何决定所制备支架的特性。本研究的重点在于制备后所面临的重大挑战：如何获得具有适当结构和力学性能的支架，并促进支架内的细胞分泌细胞外蛋白，以实现可用于人体植入的组织构建。

本文旨在介绍一系列方法，使读者能够针对多种用途设计和表征支架材料。我们描述了制备复杂且较厚支架的方法，以及对支架进行灭菌以用于实验和临床应用的技术。此外，我们还介绍了在支架上成像细胞的方法，以及通过施加双轴拉伸诱导细胞产生弹性纤维的技术。

支架的许多理想特性可以在生产后实现（例如对多层结构进行退火处理）并进行灭菌。然而，这些后续处理反过来会影响支架的力学性能。我们发现，各种灭菌方法在不同程度上均会改变支架的极限抗拉强度和杨氏模量。我们课题组近期的一项研究比较了γ射线辐照、过氧乙酸和乙醇作为聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）支架...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚乳酸-共-乙醇酸	Sigma Aldrich
聚乳酸	Sigma Aldrich	81273	特性粘度 ~2.0dl/g
聚ε-己内酯	Sigma Aldrich
聚羟基丁酸-共-羟基戊酸 12:1	Goodfellow	578-446-59	PHB88/PHV12
二氯甲烷	Sigma Aldrich 或 Fisher	270997 或 D/1850/17	>99.8%，含 50-150ppm 戊烯稳定剂
50 个彩色气球	Wilkinson’s Hardware Stores Ltd.	0105790
山羊抗兔 IgG (FC):FITC	AbDserotec	STAR121F
兔抗人 α-弹性蛋白	AbDserotec	4060-1060
螺口盖 GL45 PP 双口瓶，每包 2 个	SLS	1129750
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐	Sigma Aldrich	32670
CellTracker 绿色 CMFDA	Invitrogen	C7025
CellTracker 红色 CMTX	Invitrogen	C34552