组织工程用静电纺丝纤维的后期加工处理

摘要

静电纺丝支架可在制备后进行加工，以用于组织工程应用。本文介绍了制备复杂结构支架的方法（通过连续纺丝）、制备更厚支架的方法（通过多层叠加并采用热处理或蒸汽退火）、实现无菌性的方法（无菌制备或制备后灭菌），以及获得适宜生物力学性能的方法。

摘要

静电纺丝是一种常用于制备三维组织工程支架（通常为可生物降解）的通用方法。^{1, 2, 3} 许多组织 体内 在儿童生长过程中，皮肤、膀胱、盆底甚至硬腭等组织会经历不同程度的双轴拉伸。为这些应用制备支架时，需要开发具有适当生物力学性能（无论是否含有细胞）且适用于临床使用的无菌支架。本文的重点并非建立基本的静电纺丝参数（关于静电纺丝已有大量文献报道），而是探讨如何在纺丝支架制备完成后对其进行改性，以满足组织工程的需求——此处将考虑支架的厚度、力学性能和灭菌处理（临床应用所必需），并描述如何在支架上培养细胞并施加双轴应变，以使其适应特定应用。

静电纺丝 tends to produce 薄片；随着静电纺丝收集器表面覆盖上绝缘纤维，其导电性变差，导致纤维不再沉积于其上。因此，我们介绍了通过热或蒸汽退火来制备更厚结构的方法，这些方法可增强支架的强度，但未必提高其弹性。本文还描述了依次纺丝不同聚合物支架以构建复杂结构的方法。灭菌方法可能对支架的强度和弹性产生不利影响。我们比较了三种灭菌方法对聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）静电纺丝支架生物力学性能的影响。

本文描述了在支架上培养细胞的成像方法，以及评估细胞在支架上产生细胞外基质（ECM）蛋白的情况。体外在支架上培养细胞可增强支架的强度和弹性，但组织工程文献表明，细胞在静态培养条件下往往无法产生适当的细胞外基质。目前市面上可用于在动态培养条件下培养支架上细胞的商业系统较少，其中一个例子是Bose Electroforce 3100，该系统可通过机械夹具在充满培养基的腔室内对支架中的细胞施加特定的培养程序⁴。本文还介绍了一种低成本、可在二维方向上实现可控形变的细胞培养生物反应器方案。我们证明，在这些条件下可诱导细胞产生弹性蛋白。最后，本文描述了对经培养处理的支架（无论是否接种细胞）进行生物力学性能的评估方法。

方案

1. 随机与取向纤维的静电纺丝

静电纺丝利用电势将聚合物溶液牵引至接地的收集器，从而形成精细的纤维网络。收集器可以有多种形状，可以是静态的，但更常见的是可旋转的。在溶液到达收集器之前，溶剂已蒸发，射流固化形成纤维。

每种聚合物都需要特定的条件才能制备出特定类型的纤维。聚合物的浓度、溶剂种类、溶液喷头与接地收集器之间的距离、两者之间的电势差、旋转收集器的转速、流速、温度和湿度等因素均会影响静电纺丝过程。已有大量研究描述了静电纺丝参数的选择及其对所制备支架的影响（例如纤维直径、形貌和取向）^{5, 6, 7, 8}。本实验中，支架的制备是基于我们先前研究中确定的工艺条件进行的^{2, 9}。

以下方法适用于使用旋转收集器制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）、聚乳酸（PLA）、聚ε-己内酯（PCL）和聚羟基丁酸-共-羟基戊酸酯（PHBV）的电纺支架，如图1所示。整个过程中均使用二氯甲烷（DCM）作为溶剂。该方法可制得微米级纤维的PLGA、PLA和PCL支架，以及具有微米级珠状结构（“珍珠项链”形态）的纳米级纤维PHBV支架。

1. 将铝箔包裹在旋转芯轴收集器上，抛光/光亮面朝外。我们的芯轴宽20 cm，直径10 cm。
2. 配制聚合物溶液：将PLA、PCL和PHB....

讨论

静电纺丝是一种用于制备组织工程支架的非常流行的技术。^{14, 15, 16} 尽管制备基本的静电纺丝支架用于实验相对简单，但该技术本身复杂且具有多面性，涉及众多变量。⁶ 许多研究描述了静电纺丝参数如何决定所制备支架的特性。本研究的重点在于制备后所面临的重大挑战：如何获得具有适当结构和力学性能的支架，并促进支架内的细胞分泌细胞外蛋白，以实现可用于人体植入的组织构建。

本文旨在介绍一系列方法，使读者能够针对多种用途设计和表征支架材料。我们描述了制备复杂且较厚支架的方法，以及对支架进行灭菌以用于实验和临床应用的技术。此外，我们还介绍了在支架上成像细胞的方法，以及通过施加双轴拉伸诱导细胞产生弹性纤维的技术。

支架的许多理想特性可以在生产后实现（例如对多层结构进行退火处理）并进行灭菌。然而，这些后续处理反过来会影响支架的力学性能。我们发现，各种灭菌方法在不同程度上均会改变支架的极限抗拉强度和杨氏模量。我们课题组近期的一项研究比较了γ射线辐照、过氧乙酸和乙醇作为聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）支架.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚乳酸-共-乙醇酸	Sigma Aldrich
聚乳酸	Sigma Aldrich	81273	特性粘度 ~2.0dl/g
聚ε-己内酯	Sigma Aldrich
聚羟基丁酸-共-羟基戊酸 12:1	Goodfellow	578-446-59	PHB88/PHV12
二氯甲烷	Sigma Aldrich 或 Fisher	270997 或 D/1850/17	>99.8%，含 50-150ppm 戊烯稳定剂
50 个彩色气球	Wilkinson’s Hardware Stores Ltd.	0105790
山羊抗兔 IgG (FC):FITC	AbDserotec	STAR121F
兔抗人 α-弹性蛋白	AbDserotec	4060-1060
螺口盖 GL45 PP 双口瓶，每包 2 个	SLS	1129750
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐	Sigma Aldrich	32670
CellTracker 绿色 CMFDA	Invitrogen	C7025
CellTracker 红色 CMTX	Invitrogen	C34552