本文描述了一种合成操纵子的设计，该操纵子编码卷曲纤维的分泌装置及其结构单体。E. coli底盘细胞过量表达这些淀粉样蛋白和黏附性聚合物后，其黏附能力显著增强1。文中还介绍了简便的黏附性可视化与定量方法。
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本文内容
摘要
摘要
本文所述方法通过将最少数量的卷曲纤维基因置于强效且可被金属过量诱导的启动子控制下，重新设计大肠杆菌（E. coli）的黏附特性，并对细菌黏附能力的提升效果进行可视化与定量分析。该方法应用了合成生物学中抽象化与标准化的适当工程学原理，最终构建出生物砖（Biobrick）元件BBa_K540000（iGEM 2011年度最佳新工程化生物砖器件）。
第一步是设计合成操纵子，使其响应金属离子并促进纤维素的过量表达，从而增强野生型菌株的黏附能力。原始的纤维素操纵子经过了改造 计算机模拟 为了优化转录和翻译信号并逃逸纤维素的“天然”调控。该方法使我们能够成功验证当前对纤维素生成机制的理解。此外，通过将内源性复杂启动子（已鉴定出十余种转录调控因子）替换为简单的金属调控启动子，简化了纤维素的调控，从而使黏附过程更易于控制。
第二步包括通过实施简单方法对黏附能力进行定性和定量评估。这些方法适用于多种黏附性细菌，而不论其生物膜形成过程中涉及的生物结构如何。在24孔聚苯乙烯板中进行的黏附试验，可在结晶紫染色后快速初步观察细菌生物膜。该定性试验可通过量化黏附百分比进一步优化。此方法极为简便，且比此前所述仅使用结晶紫染色的方法更为准确1，具有良好的重复性和可重复性。通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察载玻片上GFP标记的细菌，可直接观察黏附现象，从而进一步验证24孔板试验所得结果。
引言
细菌对非生物载体的黏附在生物修复、生物催化或微生物燃料电池中起着重要作用。生物修复过程利用微生物降解有机物，或改变金属的分布（固定化、挥发）或形态。这些有益的微生物活动不仅存在于水生和陆地生态系统中，也出现在为处理工业和生活污水而开发的人工系统中。微生物活动的强度和质量取决于理化因素，同时也受微生物生活方式（自由漂浮或形成生物膜）的影响。生物膜的形成伴随着代谢变化，可通过多种机制增强对杀菌剂的抗性。因此，在大多数生物修复过程中，应促进生物膜的形成。此外，通过基因工程改造大肠杆菌（Escherichia coli）以调控其生物膜形成，已成功应用于将全细胞传感器固定在生物芯片上2-3。
微生物对高浓度金属的适应通过多种机制实现，例如吸附到胞外基质组分、激活外排泵或能够将金属富集到细胞内的特异性载体。通过基因工程增强这些细菌活性，可在实验室规模实现对金属污染的高效且低成本处理，尤其适用于如Raghu所述的微量高毒性金属。 等 2008 4细菌修复在此情况下是一种相较于使用离子交换树脂的传统化学工艺更具竞争力且成本更低的方法。作者描述了一种 大肠杆菌 通过敲除编码外排泵的基因，对底盘细胞进行基因工程改造以实现钴的吸收与滞留 rcnA，然后通过转化一种多拷贝质粒，该质粒可过表达一种优先摄取钴的转运蛋白. 这种菌株作为处理放射性废水的离子交换树脂的有效替代....
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方案
1. 纤维状菌毛操纵子的生物砖设计与合成
- 确定纤维素基因的遗传结构，并定位其内源性转录和翻译信号。这些信息收录于RegulonDB等专业数据库中a 或 EcoGeneb 并通过仔细阅读相关出版物完成。数据管理和 计算机模拟 使用Clone Manager软件进行预分析c.
- 选择相关的编码序列。一组五个合成curli所必需的基因（csgB 和 csgA 编码纤维单体）和输出（csgE csgF 和 csgG 编码卷曲素分泌复合体的基因被选中用于构建合成操纵子。从数据库中以FASTA格式提取所选序列。
随着 csgGFE 簇为反义链 E. coli 基因组，使用 Clone Manager 工具中的操作功能将该序列转换为其反向互补序列> 处理分子>翻转分子。粘贴 csgEFG 序列之后 csgBA 通过使用“Ligate”功能（Clone> 连接） - 添加合适的启动子。通过将五个选定的鞭毛素基因置于启动子P的调控之下rcn，预计在钴和镍存在的情况下，菌毛将过量产生。 rcn 基因座编码一种外排泵，负责镍和钴的解毒作用（rcnA）及其同源的金属调控蛋白（rcnRRcn....
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结果
in silico 对与转录和翻译信号优化相关的 E. coli K12 野生型 csg 序列进行注释，从而设计出如图3所示的单一合成卷曲纤维操纵子 Prcn-csg（完整序列见补充数据）。采用方案2和方案3来观察和量化与卷曲纤维产生相关的黏附能力。通过在24孔聚苯乙烯板上进行结晶紫染色（方案2），可快速观察到每个孔底部的生物膜形成情况，结果显示野生型菌株的黏附能力弱于工程菌株，表现为紫色染色强度的差异（图4A）。该定性结果通过定量测定得到进一步支持，定量数据显示工程菌株的黏附率高出1.5倍（图4B）。此外，定量方法的精确性使得能够在钴离子浓度递增条件下检测到黏附能力的显著增强。事实上，在钴离子浓度分别为0 μM、25 μM和50 μM的培养基中，黏附细胞的比例分别达到25%、30%和40%（图4B）。还可通过在载玻片上培养表达GFP标记的细菌并结合显微镜观察来比较黏附能力。落射荧光显微镜观察结果（黑色背景上的绿色细菌）显示，工程菌.......
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讨论
关键步骤
在这一合成生物学方法中，最关键的步骤是基因设计。合成基因的设计必须细致严谨，以确保系统能够高效生产。本研究将编码纤维单体的两个基因以及编码其分泌系统相关蛋白的三个基因，与一个强效且金属诱导型启动子组装在一起，构建出一个用于新应用的功能单元：核废液的生物净化。正如预先设计和预测的那样，该装置可显著增强curli的高产量表达，且随着培养基中钴浓度的增加，表达效果进一步增强。这一成功得益于所选启动子（PrcnA）中存在合适的转录信号，以及在每组curli基因（csgBA 和 csgEFG）前方添加的高效翻译信号（见图3）。此外，在使用多拷贝质粒时，必须注意参与启动子调控的调节因子的拷贝数。本实验中，所用启动子（PrcnA）的主要调节蛋白RcnR也由同一质粒提供多个拷贝（图3）。
局限性及可能的改进方案
为确保实验结果具有完全的可重复性，黏附实.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢里昂INSA-ENS iGEM团队的其他成员（Viviane Chansavang、Mathilde Dumond、Alexandre Duprey、Mélanie Geffroy、Clémence Gonthier、Margaux Jaulin、Aurélie Haag、Goki Ly、Thomas Poinsot、Béryl Royer-Bertrand、Julie Soula、Michael Vonzy、Pierre Yves Zundel、Soufiane Bouhmadi、Olivier Brette、Gaël Chambonnier、Laura Izard、Aurianne Kroiss、Philippe Lejeune、Agnès Rodrigue、Arnaud Rondelet、Sylvie Reverchon 和 Valérie Desjardin），感谢我们的赞助方提供的资金支持（bioMérieux、Assystem、EDF、Fondation INSA、ENS-Lyon 以及 INSA-Lyon 生物科学系），感谢 F. Wisniewski-Dyé 对本文稿的审阅，以及感谢 Sze C.C. 博士提供菌株。B. Drogue 获得了罗讷-阿尔卑斯大区提供的博士奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pIG2 | 含有一个3165 bp EcoRI/PstI片段的pUC57（pMB1 ori，2710 bp），该片段包含合成的Prcn-csgBAEFG操纵子；Ampr | ||
| pUC18 | 多拷贝质粒（pMB1 ori，2686 bp），Ampr | ||
| S23 | SSC1（= GFP标记的MG1655，C.C. Sze惠赠）/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0.1 M 储存液，室温保存 | |
| M63 | 29 | ||
| 24孔板 | Nunc | 55429 | 聚苯乙烯24孔板 |
参考文献
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437(2011).
- Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. Microbial sensor cell arrays. Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).
- Melamed, S.
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重印与许可
