本文描述了一种合成操纵子的设计，该操纵子编码卷曲纤维的分泌装置及其结构单体。E. coli底盘细胞过量表达这些淀粉样蛋白和黏附性聚合物后，其黏附能力显著增强1。文中还介绍了简便的黏附性可视化与定量方法。
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本文内容
摘要
摘要
本文所述方法通过将最少数量的卷曲纤维基因置于强效且可被金属过量诱导的启动子控制下，重新设计大肠杆菌（E. coli）的黏附特性，并对细菌黏附能力的提升效果进行可视化与定量分析。该方法应用了合成生物学中抽象化与标准化的适当工程学原理，最终构建出生物砖（Biobrick）元件BBa_K540000（iGEM 2011年度最佳新工程化生物砖器件）。
第一步是设计合成操纵子，使其响应金属离子并促进纤维素的过量表达，从而增强野生型菌株的黏附能力。原始的纤维素操纵子经过了改造 计算机模拟 为了优化转录和翻译信号并逃逸纤维素的“天然”调控。该方法使我们能够成功验证当前对纤维素生成机制的理解。此外，通过将内源性复杂启动子（已鉴定出十余种转录调控因子）替换为简单的金属调控启动子，简化了纤维素的调控，从而使黏附过程更易于控制。
第二步包括通过实施简单方法对黏附能力进行定性和定量评估。这些方法适用于多种黏附性细菌，而不论其生物膜形成过程中涉及的生物结构如何。在24孔聚苯乙烯板中进行的黏附试验，可在结晶紫染色后快速初步观察细菌生物膜。该定性试验可通过量化黏附百分比进一步优化。此方法极为简便，且比此前所述仅使用结晶紫染色的方法更为准确1，具有良好的重复性和可重复性。通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察载玻片上GFP标记的细菌，可直接观察黏附现象，从而进一步验证24孔板试验所得结果。
引言
细菌对非生物载体的黏附在生物修复、生物催化或微生物燃料电池中起着重要作用。生物修复过程利用微生物降解有机物，或改变金属的分布（固定化、挥发）或形态。这些有益的微生物活动不仅存在于水生和陆地生态系统中，也出现在为处理工业和生活污水而开发的人工系统中。微生物活动的强度和质量取决于理化因素，同时也受微生物生活方式（自由漂浮或形成生物膜）的影响。生物膜的形成伴随着代谢变化，可通过多种机制增强对杀菌剂的抗性。因此，在大多数生物修复过程中，应促进生物膜的形成。此外，通过基因工程改造大肠杆菌（Escherichia coli）以调控其生物膜形成，已成功应用于将全细胞传感器固定在生物芯片上2-3。
微生物对高浓度金属的适应通过多种机制实现，例如吸附到胞外基质组分、激活外排泵或能够将金属富集到细胞内的特异性载体。通过基因工程增强这些细菌活性，可在实验室规模实现对金属污染的高效且低成本处理，尤其适用于如Raghu所述的微量高毒性金属。 等 2008 4细菌修复在此情况下是一种相较于使用离子交换树脂的传统化学工艺更具竞争力且成本更低的方法。作者描述了一种 大肠杆菌 通过敲除编码外排泵的基因，对底盘细胞进行基因工程改造以实现钴的吸收与滞留 rcnA，然后通过转化一种多拷贝质粒，该质粒可过表达一种优先摄取钴的转运蛋白. 这种菌株作为处理放射性废水的离子交换树脂的有效替代方案具有潜力，但该工艺结束时受污染细菌的回收仍是尚未解决的关键问题 4因此，我们工作的目标是构建一种能够黏附于玻璃或塑料等非生物载体的定制化菌株。
在已鉴定的革兰氏阴性菌的全部黏附素和黏附菌毛中，我们选择设计一个能够表达卷曲纤维的系统。卷曲纤维是直径为2-5 nm、高度聚集的淀粉样纤维，从细菌表面突出 E. coli 和 沙门氏菌 非晶态且不溶性的基质表面 5-7纤维菌毛还参与非生物表面的定植以及生物膜的形成 8最近研究表明，卷曲菌毛可结合汞离子 9淀粉样蛋白确实已知对金属离子（如Cu）具有高亲和力。2+，Zn2+ 和 Fe3+ 10这一特性可能进一步提高对金属污染废水的净化效果。 csg 簇负责产生纤维素样纤维，由两个转录方向相反的操作子组成（图1）。该 csgB, csgA 和 csgC 基因构成编码菌毛两个亚基CsgA和CsgB的正向操纵子。CsgC似乎参与菌毛生物合成系统中的氧化还原反应，并影响CsgG孔道的行为。 11然而，大多数产纤毛菌中缺乏 csgC，表明其对应的蛋白质仅对纤毛生物合成提供次要水平的调控。为了简化系统，我们选择仅使用最少数量的基因进行研究。
的 csgDEFG 操纵子编码对CsgA和CsgB调控及转运至细胞表面至关重要的蛋白质。CsgD是该操纵子的转录激活因子。 csgBAC 操纵子，在通过调控纤连蛋白（curli fimbriae）及纤维素等生物膜组分的生成来控制生物膜形成过程中发挥关键作用 12 并通过抑制鞭毛的产生 13CsgE、CsgF 和 CsgG 构成外膜中一种纤维素特异性的分泌装置，主要纤维素亚基蛋白 CsgA 以可溶性蛋白形式通过该装置分泌。CsgA 的聚合依赖于 体内 膜结合的成核蛋白 CsgB（综述见于 14). 已发现涉及多个双组分系统的复杂调控通路可控制curli基因的表达 15-16这些复杂的调控机制使细菌能够响应环境信号，通过产生纤维素形成致密的生物膜，但在工业应用中难以控制。为了在工业过程中便于回收富集金属的细菌，确实需要通过明确定义的参数来调控细菌在固体载体上的固定。纤维素的黏附特性与其淀粉样性质相关 17 并可用于改进生物修复过程，但需要开发一种更简单且易于控制的装置。
在这7个基因中 18，一组合成纤维素所必需的5个核心基因（csgB 和 csgA 编码纤维单体）并输出（csgE csgF 和 csgG 编码卷曲菌毛分泌复合物）被选中用于构建合成操纵子。为了摆脱卷曲菌毛的“天然”调控，构建了一个包含这5个 csg 由强效且可被钴过量诱导的启动子控制的基因（图2设计并合成了编码卷曲纤维的基因区域，并描述了功能性合成操纵子的逐步分析与设计流程。同时介绍了两种用于可视化和定量分析细菌在聚苯乙烯和玻璃表面黏附的方法。
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方案
1. 纤维状菌毛操纵子的生物砖设计与合成
- 确定纤维素基因的遗传结构，并定位其内源性转录和翻译信号。这些信息收录于RegulonDB等专业数据库中a 或 EcoGeneb 并通过仔细阅读相关出版物完成。数据管理和 计算机模拟 使用Clone Manager软件进行预分析c.
- 选择相关的编码序列。一组五个合成curli所必需的基因（csgB 和 csgA 编码纤维单体）和输出（csgE csgF 和 csgG 编码卷曲素分泌复合体的基因被选中用于构建合成操纵子。从数据库中以FASTA格式提取所选序列。
随着 csgGFE 簇为反义链 E. coli 基因组，使用 Clone Manager 工具中的操作功能将该序列转换为其反向互补序列> 处理分子>翻转分子。粘贴 csgEFG 序列之后 csgBA 通过使用“Ligate”功能（Clone> 连接） - 添加合适的启动子。通过将五个选定的鞭毛素基因置于启动子P的调控之下rcn，预计在钴和镍存在的情况下，菌毛将过量产生。 rcn 基因座编码一种外排泵，负责镍和钴的解毒作用（rcnA）及其同源的金属调控蛋白（rcnRRcnR 调控基因的表达 rcnA 及其在镍和钴作用下的自身基因响应 19。该 rcn 序列包含 rcnR CDS，完整序列 rcn 基因间区域加上前41个核苷酸 rcnA 放置在前方 csgBAEFG 嵌合序列（图1，整个构建体的序列作为补充数据提供。
- 优化转录信号。在第一个ATG上游添加了完美的核糖体结合位点（或称完美RBS = AAGGAGGTATATA） csgBA DNA序列。在……前方添加了第二个完美的RBS csgEFG 序列。内源性 RBS 用于 csgB 和 csgF 和 csgG 基因具有保守性。
- 为了符合iGEM标准，该装置必须两侧分别带有标准BioBrick前缀和后缀，其中包含用于限制性酶切的酶切位点 生态RI, PstI（前缀）和 光谱我与 XbaI（后缀）。在装置的每一端粘贴相应的序列d.
- 消除任何 生态RI, Pst我， Spe我与 XbaI识别位点。为了便于后续的组装过程，BioBrick元件本身不应包含任何这些限制性酶切位点。对器件进行计算机限制性酶切分析发现其中一个 PstI 位点 csgA 序列，一个 PstI 位点 rcnR 序列和一个 生态RI 酶切位点在 csgE 基因。这些位点分别位于装置序列的第80位（Mut1）、第1340位（Mut2）和第1830位（Mut3）（补充数据），并通过同义突变进行如下修饰。
Mut1 PstI 位点 CTGCAG 变为 CGTCTG
Mut2 PstI 位点 CTGCAG 变为 CAGCAG
Mut3 生态RI位点GAATTC变为GAATT - 使用 Clone Manager 软件运行翻译模拟（操作>处理分子>使用序列比对程序 BLAST 验证野生型卷曲菌毛蛋白与合成操纵子编码的蛋白质之间是否存在完全同源性。
- 订购合成操纵子。全球有多家公司提供商业基因合成服务，我们的合作伙伴是 Genecust（卢森堡）。4 μ几周后收到了人工操纵子（3165 bp）的片段，并将其插入至pUC57中（pIG2）。
2. 在聚苯乙烯表面可视化并定量粘附细菌
- 向24孔聚苯乙烯板的每孔中加入2 ml M63最低培养基（含0.2%葡萄糖），并向每孔接种106个过夜培养的菌体细胞。在30℃下培养细菌 °C下孵育18至48小时，期间不振荡。每列（4个孔）代表一种处理方式。加入适量的钴（25至100 mM）和抗生素（氨苄青霉素100） μg.L-1必要时使用。24孔板的前3行孔位用于实验 定量 通过取3次重复的平均值来计算贴壁细菌，最后一行左侧的数据被使用 可视化 生物膜
- 对于前3行 24孔板：每个孔中收集含有浮游细胞的上清液。
- 用 1 ml M63 轻柔地冲洗每个孔，并将 1 ml 洗液与步骤 2.2 中获得的初始上清液合并。此合并液称为游动细胞（=S）。
- 用移液器刮取并反复吹打，将生物膜重悬于1 ml M63培养基中（=B）。涡旋振荡15秒。通过测定600 nm处的光密度（OD600）估算附着于表面的细菌和游动细菌的数量，计算每种条件下的黏附百分率。
- 黏附率的计算公式为：B×100/(3×S+B)。
- 仅适用于最后一行 弃去24孔板中的浮游细胞。
- 用1 ml M63缓冲液冲洗培养皿底部形成的生物膜。
- 将敞口培养皿在80℃下干燥1小时 °C.
- 加入100 μ每孔加入20%结晶紫溶液1毫升，染色2分钟，随后用大量水充分洗涤，以观察表面附着的细菌。
必须进行三次独立的实验（培养板），以确保可重复性。
3. 通过显微镜观察玻璃表面黏附的细菌
- 获取一个荧光底盘。 E. coli SCC1e 表达绿色荧光蛋白（GFP）的稳定菌株，与亲本菌株MG1655相比无可见差异 20 是携带合成卷曲菌毛操纵子质粒的合适宿主。
- 将 pIG2 质粒（=插入合成卷曲菌毛操纵子）转化入 SCC1 中 生态RI/Pst将 SCC1 转化至 pUC57 质粒的 I 位点以获得 S23 菌株。将 SCC1 转化至对照质粒（pUC18）以获得对照菌株 S24 21.
- 在30℃下过夜培养S23菌株及对照菌株（S24）的预培养物 °C 在添加了葡萄糖（0.2%）和氨苄青霉素（100）的 M63 培养基中 μg.L-1).
- 在培养皿中接种15 ml相同培养基，并加入100 μl 的预培养物。加入适当浓度的钴（即 25 μM），并设置不含钴的阴性对照。每个培养皿中放入3块矩形玻璃盖玻片，于30℃过夜培养。 °C，不振荡。
- 从培养皿中取出盖玻片并小心沥干。用浸有70%乙醇的小棉签轻轻擦拭其底面。 ° 用乙醇擦拭去除所有细菌残留物。进行共聚焦观察时，将两端上方几毫米处擦拭干净，以便后续固定盖玻片。
- 可在荧光显微镜下直接快速观察贴壁细菌，但需小心避免样品干燥。
- 进行共聚焦观察时，将盖玻片放置在载玻片上，使覆盖有生物膜的一面朝上。然后用更大的盖玻片覆盖生物膜，并用清漆将盖玻片固定在载玻片上。将整个装置倒置，使生物膜位于下方。
- 将装置置于共聚焦激光显微镜下。Platim 平台使用的是 Axioplan2 LSM510（Zeiss）共聚焦激光显微镜。f.
- 设置。在488 nm处激发GFP，收集500至600 nm范围内的细菌荧光。使用40倍油浸物镜以激光扫描共聚焦模式采集图像。以1 μm为步长，从固体表面至培养基界面扫描生物膜的整体三维结构。 μm
- 使用 IMARIS 软件（Bitplane，Zürich，瑞士）进行三维投影。通过分析统计学纵向切面的平均 z 值来确定生物膜厚度。生物膜生物体积的定量可从共聚焦 z 层扫描图像中提取，具体方法见其他文献。 22.
aRegulonDB 提供关于操纵子结构及其分解为转录单位、启动子及其σ因子类型、基因及其核糖体结合位点、终止子、特定转录调控因子的结合位点，以及这些元件如何组织成调控短语的机制信息。http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp
bEcoGene 数据库包含有关大肠杆菌（E. coli）K-12 基因组和蛋白质组序列的最新信息，包括广泛的基因文献资料。EcoGene 的一个主要研究重点是对翻译起始位点的重新评估。http://ecogene.org/
chttp://www.scied.com/dl_cmp9d.htm
dhttp://partsregistry.org/wiki/index.php?title=帮助:BioBrick前缀和后缀
e由新加坡南洋理工大学司春朝赠送。
fPlatim 显微成像平台 UMS3444 生命科学格兰德 - 里昂南。
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结果
in silico 对与转录和翻译信号优化相关的 E. coli K12 野生型 csg 序列进行注释，从而设计出如图3所示的单一合成卷曲纤维操纵子 Prcn-csg（完整序列见补充数据）。采用方案2和方案3来观察和量化与卷曲纤维产生相关的黏附能力。通过在24孔聚苯乙烯板上进行结晶紫染色（方案2），可快速观察到每个孔底部的生物膜形成情况，结果显示野生型菌株的黏附能力弱于工程菌株，表现为紫色染色强度的差异（图4A）。该定性结果通过定量测定得到进一步支持，定量数据显示工程菌株的黏附率高出1.5倍（图4B）。此外，定量方法的精确性使得能够在钴离子浓度递增条件下检测到黏附能力的显著增强。事实上，在钴离子浓度分别为0 μM、25 μM和50 μM的培养基中，黏附细胞的比例分别达到25%、30%和40%（图4B）。还可通过在载玻片上培养表达GFP标记的细菌并结合显微镜观察来比较黏附能力。落射荧光显微镜观察结果（黑色背景上的绿色细菌）显示，工程菌...
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讨论
关键步骤
在这一合成生物学方法中，最关键的步骤是基因设计。合成基因的设计必须细致严谨，以确保系统能够高效生产。本研究将编码纤维单体的两个基因以及编码其分泌系统相关蛋白的三个基因，与一个强效且金属诱导型启动子组装在一起，构建出一个用于新应用的功能单元：核废液的生物净化。正如预先设计和预测的那样，该装置可显著增强curli的高产量表达，且随着培养基中钴浓度的增加，表达效果进一步增强。这一成功得益于所选启动子（PrcnA）中存在合适的转录信号，以及在每组curli基因（csgBA 和 csgEFG）前方添加的高效翻译信号（见图3）。此外，在使用多拷贝质粒时，必须注意参与启动子调控的调节因子的拷贝数。本实验中，所用启动子（PrcnA）的主要调节蛋白RcnR也由同一质粒提供多个拷贝（图3）。
局限性及可能的改进方案
为确保实验结果具有完全的可重复性，黏附实...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢里昂INSA-ENS iGEM团队的其他成员（Viviane Chansavang、Mathilde Dumond、Alexandre Duprey、Mélanie Geffroy、Clémence Gonthier、Margaux Jaulin、Aurélie Haag、Goki Ly、Thomas Poinsot、Béryl Royer-Bertrand、Julie Soula、Michael Vonzy、Pierre Yves Zundel、Soufiane Bouhmadi、Olivier Brette、Gaël Chambonnier、Laura Izard、Aurianne Kroiss、Philippe Lejeune、Agnès Rodrigue、Arnaud Rondelet、Sylvie Reverchon 和 Valérie Desjardin），感谢我们的赞助方提供的资金支持（bioMérieux、Assystem、EDF、Fondation INSA、ENS-Lyon 以及 INSA-Lyon 生物科学系），感谢 F. Wisniewski-Dyé 对本文稿的审阅，以及感谢 Sze C.C. 博士提供菌株。B. Drogue 获得了罗讷-阿尔卑斯大区提供的博士奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pIG2 | 含有一个3165 bp EcoRI/PstI片段的pUC57（pMB1 ori，2710 bp），该片段包含合成的Prcn-csgBAEFG操纵子；Ampr | ||
| pUC18 | 多拷贝质粒（pMB1 ori，2686 bp），Ampr | ||
| S23 | SSC1（= GFP标记的MG1655，C.C. Sze惠赠）/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0.1 M 储存液，室温保存 | |
| M63 | 29 | ||
| 24孔板 | Nunc | 55429 | 聚苯乙烯24孔板 |
参考文献
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