一种优化的荧光激活细胞分选（FACS）方法用于从胎鼠内脏器官中分离自主神经前体细胞

摘要

本文介绍了一种从胎鼠组织中纯化神经嵴来源的神经前体细胞的优化方案。该方法利用荧光报告等位基因的表达，通过荧光激活细胞分选（FACS）分离特定细胞群体。该技术可用于在发育过程中或从成体组织中分离神经元亚群。

摘要

在发育过程中，源自神经嵴（NC）的神经元前体细胞会从神经管迁移出来，进而在肠道和下泌尿道等内脏器官中形成自主神经节。无论是在发育阶段还是在成熟组织中，这些细胞通常在组织内广泛分布，因此使用激光捕获显微切割等方法分离特定细胞群体较为困难。然而，这些细胞可通过神经元特异性基因（如酪氨酸羟化酶（TH））调控区域驱动的荧光报告基因表达而被直接观察到。本文介绍一种优化的方法，可从胎鼠的内脏组织（包括肠道和下泌尿生殖道（LUT））中高效分离出大量具有活性的TH+神经元前体细胞，该方法基于组织解离和荧光激活细胞分选（FACS）技术。

Th 基因编码儿茶酚胺合成的限速酶。肠神经前体细胞在胎儿肠道内迁移过程中开始表达 TH¹，TH 也在成年盆腔神经节神经元的一个亚群中存在^2-4。然而，该细胞谱系的首次出现时间、其在下尿路（LUT）其他部位的分布情况以及这些神经元的分离方法尚未见报道。在携带转基因构建体 Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mmnc¹ 的小鼠中，表达 TH 的神经前体细胞可通过 EGFP 的表达被清晰地观察到。我们对胎鼠中该转基因的表达进行了成像，以记录在交配后 15.5 天（dpc）发育中的下尿路（LUT）内 TH+ 细胞的分布情况，其中将检测到阴栓的早晨定为 0.5 dpc。我们观察到，在聚集中的盆腔神经节内的部分神经前体细胞表达 EGFP。

为了分离下泌尿道（LUT）TH+ 神经元前体细胞，我们优化了最初用于从胎鼠肠道中纯化神经嵴干细胞的方法^2-6。以往分离神经嵴来源细胞群体的研究主要依赖胶原酶和胰蛋白酶混合消化法来获得用于流式细胞术的单细胞悬液。然而，我们发现这些方法所得的下泌尿道细胞悬液活力相对较低。鉴于胎鼠下泌尿道组织中神经元前体细胞本就稀少，我们着手优化组织解离方法，以提高最终解离产物中细胞的存活率。我们发现，使用Accumax（Innovative Cell Technologies, Inc）进行温和解离、手动过滤，并在低压力条件下进行流式分选，可使细胞存活率稳定提高（>总细胞数的70%），并获得足够数量的神经元前体细胞用于后续分析。本文所述方法可广泛应用于从胎鼠或成年小鼠组织中分离多种神经元细胞群体。

方案

1. 培养基的制备（所有步骤均在组织培养罩内进行）

1. 混合以下成分：44 ml L-15 培养基、0.5 ml 100倍青霉素/链霉素（P/S）、0.5 ml 100 mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）、0.5 ml 1 M HEPES、5 ml 细胞培养级水。在添加前务必充分混匀 BSA 和 P/S。此体积足以用于最多五种不同类型组织的解离。该培养基将在步骤 3.4 中用于配制酶解组织后的淬灭溶液。
2. 使用 0.22 μm 聚醚砜（PES）滤器过滤培养基。
3. 使用细胞培养级水将 10 倍储存液稀释为 1 倍汉克斯平衡盐溶液（HBSS）和 1 倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）。通过 0.22 μm PES 滤器过滤。这些试剂可提前配制大量溶液，并于 4 °C 保存，根据需要在细胞培养超净台中分装成小体积。
4. 将多个 15 ml 圆锥形离心管装入 1 倍 HBSS（管数应等于计划进行亚解剖的组织数量），并将离心管置于冰上保存。

2. 解剖

1. 根据机构动物护理和使用委员会批准的方案，处死孕鼠，并将子宫转移至含有冰上预冷的1×PBS的60或100 mm培养皿中。
2. 从子宫中取出胚胎，在冰上预冷的1×PBS中通过断头法处死。在荧光照明下逐个筛选，分为阳性转基因和野生型（WT）非转基因组。解剖过程中始终保持胚胎置于冰上预冷的1×PBS中。
3. 在体....

讨论

随着小鼠遗传学领域多个研究团队的努力，表达荧光报告基因的小鼠报告品系正变得广泛可及^1,8,9。因此，本文所展示的解离方法可广泛应用于从胎鼠或成年鼠组织中，根据神经递质或受体的表达模式分离特定的神经元亚型。尽管本方法的优化基于荧光转基因报告基因的表达，但它同样适用于通过活细胞免疫标记法标记细胞表面受体的样本^3-5,10。

在我们的实验中，观察到多个因素影响了细胞在解离过程中存活的比例。这些因素包括从胎儿组织初次解剖到通过流式细胞术分离细胞所经历的时间、细胞悬液在过滤和流式分选过程中的轻柔操作，以及解离过程中所使用的酶的类型。肠神经和下泌尿道（LUT）前体细胞的存活均受益于快速解剖/解离以及在细胞分选过程中采用温和条件（17 psi，100 微米喷嘴，每秒 3,000 个事件）。我们发现，在流式分选仪分离前，仪器检测到的总样本群体（包括碎片和多联体在内的所有事件）中，由胎儿肠道或 LUT 组织制备的细胞悬液通常表现出约 80% 的存活率。为了排除碎片和细胞团块，首先对总群体设置前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）的初始门控。随后，通过电.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accumax	Sigma（制造商：Innovative Cell Technologies）	A7089-100ML	分装成 1 ml 等份，冷冻保存
DNase I	Sigma	D-4527	在 -20 °C 冷冻保存，5 mg/ml 溶于 1×HBSS 中， （用于淬灭步骤，按 1:5 比例稀释使用）
10× PBS pH 7.4	Gibco	70011-044	用细胞培养级水稀释至 1×，然后经无菌过滤
不含 Ca 或 Mg 的 10× HBSS	Gibco	14185-052	用细胞培养级水稀释至 1×，然后经无菌过滤
Leibovitz's L-15 培养基	Gibco	21083027
青霉素/链霉素 100×	Gibco	15140-133	分装后于 -20 °C 保存
BSA	Sigma	A3912-100G	分装后于 -20 °C 保存，100 mg/ml 溶于水中
Biowhittaker 1 M HEPES 溶于 0.85% NaCl 中	Lonza	17-737E
38 μm NITEX 尼龙筛膜	Sefar America	3-38/22	裁剪为约 3 cm 的正方形，置于超净台内紫外照射过夜以灭菌
7-AAD	Invitrogen	A1310	1 mg/ml
TRIzol LS	Invitrogen	10296-028
5 ml 聚苯乙烯管	Falcon	352058
15 ml 圆锥形离心管	Corning	430790
精细解剖镊	Fine Science Instruments	11251-30	Dumont#5 镊子，Dumoxel 材质，标准尖端 0.1×0.06 mm
解剖勺	Fine Science Instruments	10370-18