本文介绍了一种从胎鼠组织中纯化神经嵴来源的神经前体细胞的优化方案。该方法利用荧光报告等位基因的表达，通过荧光激活细胞分选（FACS）分离特定细胞群体。该技术可用于在发育过程中或从成体组织中分离神经元亚群。
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摘要
摘要
在发育过程中，源自神经嵴（NC）的神经元前体细胞会从神经管迁移出来，进而在肠道和下泌尿道等内脏器官中形成自主神经节。无论是在发育阶段还是在成熟组织中，这些细胞通常在组织内广泛分布，因此使用激光捕获显微切割等方法分离特定细胞群体较为困难。然而，这些细胞可通过神经元特异性基因（如酪氨酸羟化酶（TH））调控区域驱动的荧光报告基因表达而被直接观察到。本文介绍一种优化的方法，可从胎鼠的内脏组织（包括肠道和下泌尿生殖道（LUT））中高效分离出大量具有活性的TH+神经元前体细胞，该方法基于组织解离和荧光激活细胞分选（FACS）技术。
Th 基因编码儿茶酚胺合成的限速酶。肠神经前体细胞在胎儿肠道内迁移过程中开始表达 TH1，TH 也在成年盆腔神经节神经元的一个亚群中存在2-4。然而，该细胞谱系的首次出现时间、其在下尿路（LUT）其他部位的分布情况以及这些神经元的分离方法尚未见报道。在携带转基因构建体 Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mmnc1 的小鼠中，表达 TH 的神经前体细胞可通过 EGFP 的表达被清晰地观察到。我们对胎鼠中该转基因的表达进行了成像，以记录在交配后 15.5 天（dpc）发育中的下尿路（LUT）内 TH+ 细胞的分布情况，其中将检测到阴栓的早晨定为 0.5 dpc。我们观察到，在聚集中的盆腔神经节内的部分神经前体细胞表达 EGFP。
为了分离下泌尿道（LUT）TH+ 神经元前体细胞，我们优化了最初用于从胎鼠肠道中纯化神经嵴干细胞的方法2-6。以往分离神经嵴来源细胞群体的研究主要依赖胶原酶和胰蛋白酶混合消化法来获得用于流式细胞术的单细胞悬液。然而，我们发现这些方法所得的下泌尿道细胞悬液活力相对较低。鉴于胎鼠下泌尿道组织中神经元前体细胞本就稀少，我们着手优化组织解离方法，以提高最终解离产物中细胞的存活率。我们发现，使用Accumax（Innovative Cell Technologies, Inc）进行温和解离、手动过滤，并在低压力条件下进行流式分选，可使细胞存活率稳定提高（>总细胞数的70%），并获得足够数量的神经元前体细胞用于后续分析。本文所述方法可广泛应用于从胎鼠或成年小鼠组织中分离多种神经元细胞群体。
方案
1. 培养基的制备（所有步骤均在组织培养罩内进行）
- 混合以下成分：44 ml L-15 培养基、0.5 ml 100倍青霉素/链霉素（P/S）、0.5 ml 100 mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）、0.5 ml 1 M HEPES、5 ml 细胞培养级水。在添加前务必充分混匀 BSA 和 P/S。此体积足以用于最多五种不同类型组织的解离。该培养基将在第 3.4 步中用于配制酶解组织后的淬灭溶液。
- 使用 0.22 μm 聚醚砜（PES）滤器过滤培养基。
- 使用细胞培养级水将 10 倍储存液稀释为 1 倍汉克斯平衡盐溶液（HBSS）和 1 倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）。通过 0.22 μm PES 滤器过滤。这些试剂可提前配制大量溶液，并于 4 °C 保存，根据需要在细胞培养超净台中分装成小份。
- 将多个 15 ml 圆锥形离心管装入 1 倍 HBSS（管数应等于计划进行亚解剖的组织数量），并将离心管置于冰上保存。
2. 解剖
- 根据机构动物护理和使用委员会批准的方案，处死孕鼠，并将子宫转移至含有冰上预冷的1×PBS的60或100 mm培养皿中。
- 从子宫中取出胚胎，在冰上预冷的1×PBS中通过断头法处死。在荧光照明下逐个筛选，分为阳性转基因和野生型（WT）非转基因组。解剖过程中始终保持胚胎置于冰上预冷的1×PBS中。
- 在解剖显微镜下进一步分离泌尿生殖道组织。用精细镊子在前肢水平固定胚胎，将镊子插入膈肌水平，迅速将肝脏至生殖结节之间的内脏器官从背侧体壁向下拉出并移除。
- 进一步将目标组织与周围组织分离（图1）。将每份单独分离的组织类型放入含有冰上预冷的1×HBSS的15 ml锥形管中。根据胚胎表型将相同类型的组织合并（例如，所有胎儿肠道的GFP阳性样本合并至同一支15 ml锥形管中）。
- 同时，从野生型胚胎中分离相应的组织，用于后续流式细胞术的补偿对照。
3. 分离显微解剖后的组织
- 以210相对离心力（rcf）离心沉淀组织碎块， 4 °C 5 分钟。离心后，尽可能吸除全部 HBSS。
- 将组织沉淀重悬于Accumax（Innovative Cell Technologies, Inc）中，注意每次更换样本时更换移液器吸头，以避免不同组织类型间的交叉污染。Accumax的用量可根据组织量的多少进行调整。通常情况下，1-5个胎儿肠道样本使用1 ml Accumax，但较大规模的组织混合样本需要更大体积以实现充分解离。
- 将试管放入 37 °C 水浴 20-45 分钟，具体时间取决于所分离组织的发育阶段（例如 13.5 dpc 肠道 20 分钟，15.5 dpc 肠道 35 分钟）。在解离时间进行到一半时，通过将离心管敲击水浴锅壁（或任何固体表面）以及轻弹离心管（类似于甩动传统的水银温度计）的方式手动打散组织。解离时间结束时，重复多次上述轻弹操作，以进一步解离样品。对于更为脆弱的样品，应降低轻弹的剧烈程度，并在步骤 3.5 中改用移液器吹打重悬，以达到适当的解离程度。14.5 dpc 和 15.5 dpc LUT 的典型解离时间分别为 35 和 45 分钟。
- 在组织于Accumax中孵育的同时，配制淬灭溶液，分别称为Quench和Quench 1:5。Quench通过加入以下成分制备： 45 μl 将5 mg/ml DNase I加入6 ml L-15培养基中。终止液1:5通过添加 45 μl 5 mg/ml DNase I 加入 30 ml L-15 培养基中。
- 消化结束后，立即将15 ml离心管置于冰上，并向每管中立即加入1 ml终止液。反复吹打每个样本，直至组织几乎完全解离（图2）。溶液中仍会存在一些细小的组织碎片。完全均质的样品既难以实现，也不可取，因为它可能导致细胞活力下降。
- 在实验方案剩余步骤中，应尽可能将样品置于冰上。吸取淬灭液或1:5稀释的淬灭液时，务必使用新的移液器吸头，以避免样品间的交叉污染。
4. 过滤细胞悬液
- 使用已浸泡在70%乙醇中的镊子，将一块3 cm见方的38 μm尼龙筛膜（Sefar America）覆盖在新的15 ml圆锥形离心管管口。用窄口吸头将细胞悬液滴加至筛膜中心，使细胞通过筛膜过滤。若过滤过程中筛膜饱和，需取下筛膜，用无尘纸（kimwipe）擦干管口，并更换新的尼龙筛膜继续过滤剩余的细胞悬液。所有细胞过滤完成后，用1 ml Quench 1:5冲洗离心管内壁，并将残留细胞通过筛膜再次过滤。
- 过滤完成后，或更换堵塞的筛膜时，使用镊子将筛膜边缘卷起，并在离心管口上轻轻擦拭筛膜顶部，以去除残留的细胞液滴。
- 将细胞悬液在210 rcf、4 °C条件下离心5分钟，使细胞沉淀。吸除上清液后，用1 ml Quench 1:5重悬沉淀。
- 将细胞悬液通过尼龙筛膜过滤至5 ml聚苯乙烯管中。用1 ml Quench 1:5冲洗15 ml离心管，并将冲洗液过滤，以回收任何残留的细胞。
5. 准备 FACS 样品
- 如果使用同一样本组织进行分选以及补偿对照，转移1/10th 至 1/20th 将样品体积转移至新的5 ml聚苯乙烯管中，用于补偿对照。将野生型组织样品分为两部分：一部分为未染色的野生型（WT Only），另一部分则加入7-氨基放线菌素D（7-AAD，一种可排除活细胞的荧光嵌入剂，用作“活力染色”）（7-AAD Only）。这些单独的对照用于校正流式分选仪中不同荧光染料发射光谱之间的任何重叠。例如，对于单一荧光报告分子如EGFP，所需的对照应包括：仅EGFP、未染色的WT细胞，以及仅用7-AAD染色的管。 （图 3).
- 将所有含细胞悬液的5 ml离心管用Quench 1:5补足体积，于210 rcf离心。 4 °C 5分钟。吸除上清液，保留约 200 μl 管中的液体量
- 将7-AAD按1:1000比例稀释于Quench 1:5中。将7-AAD染色稀释液加入仅用于7-AAD补偿对照及待分选样品中。不要将7-AAD加入仅EGFP或仅WT的补偿对照中。所添加7-AAD的体积需根据起始材料的量及获得的细胞沉淀大小进行调整。在向相应试管中加入7-AAD后，样品即可用于分选。
组织 样本池大小 7-AAD 的添加体积至试管* 15.5 天胚胎期肠道 1-5 200 μl 15.5 天胚胎龄 LUT 1-5 150 μl
表1. 加入不同组织解离液中的 7-AAD 用量 * 每管中的最终总体积将因加入量不同而有所变化，变化范围为 50-100 μl 由于吸除培养基是一个近似操作，需小心避免吸到沉淀。最终体积不再测定，以尽量减少对溶液中细胞的处理。 - 准备收集管以捕获用于RNA提取的细胞，向1.5 ml 微离心管中加入0.75 ml TRIzol-LS。
- 若需收集细胞用于 体外 将细胞直接分选至6孔组织培养板中，孔板预先包被纤连蛋白，并加入前述自更新培养基，而非进行RNA提取。2,6,7
6. 流式细胞术
- 在流式细胞仪上首先检测补偿对照，确保每次样本之间进行反向冲洗，以避免污染。利用补偿样本的轮廓设置分选所需的电压/门控参数。需要注意的是，如果目标组织中阳性细胞数量有限，只要荧光强度和细胞大小在样本间具有可比性，可使用另一种明确的组织来建立补偿设置。
- 设置补偿参数和门控，排除摄取7-AAD染料的死细胞，并收集相对于未染色对照具有较高GFP荧光强度的细胞（图4）。
- 将最多25,000个细胞分选至每个微量离心管中。为保持神经前体细胞的活性，分选时应使用尽可能低的压力、大孔径喷嘴和低流速（例如，17 psi、100 μm喷嘴、3,000 事件/秒）。对于EGFP+细胞的分选，我们使用BD Biosciences FACSAriaII流式分选仪，并采用488 nm 20 mW激光激发EGFP报告基因。
- 如果样本中细胞浓度过高，建议进一步用1:1000稀释的7-AAD染色液稀释细胞悬液，以提高分选时的捕获效率。
- 分选完成后，立即对收集在TRIzol-LS中的每管细胞进行涡旋振荡处理。
7. 代表性结果
将组织解离为用于流式分选的细胞悬液，需要在充分的酶消化与避免过度消化之间取得精细平衡，因为过度消化可能导致细胞活力降低。理想的组织解离程度示例如图2所示。在酶消化适度的组织中，经手工吹打前，显微解剖后的器官碎片仍清晰可见（图2b、2f）。而在酶处理时间过长或酶浓度过高的组织中，所得悬液中已无任何残留的较大组织碎片（图2d、2h）。
适当的解离和手动过滤可在流式细胞术中获得分选图谱，通常显示超过90%的活细胞，并表现出高水平的EGFP表达（图4）。通过该方法获得的细胞群体具有良好的存活率，可通过圈选EGFP+神经前体细胞，用于后续培养或基因表达分析。
图 1. 胎鼠下尿路中 TH-EGFP+ 神经祖细胞的分布。在 15.5 dpc 时，整体尿生殖道在明场照明下腹侧观察（a），与在荧光照明下通过 TH-EGFP 转基因表达标记的 EGFP+ 细胞分布进行比较（b）。TH-EGFP 表达存在于肾上腺（a）以及位于中线的腹腔神经节（cg）。15.5 dpc 时经部分解剖的 TH-EGFP 膀胱的侧视图（c）显示，盆腔神经节（pg）、膀胱壁（bla）和尿道（u）中存在转基因表达的荧光信号。背侧视图（d）中，EGFP+ 细胞明显分布于尿道前背侧区域。其他标注：肾脏（k）、睾丸（t）、膀胱（bla）和生殖结节（gt）。
图 2. 分别为15 dpc胎儿下泌尿道 (a) 和肠道 (e) 的明场图像，拍摄于解离孵育中途、解离孵育结束但尚未进行机械吹打时 (b, f)、手动吹打后 (c, g)，以及一个过度解离的样本 (d, h)。
图3. 示意图展示了建立严格FACS设门参数所需的补偿对照。
图4. 14.5天（dpc）（a）和15.5天（dpc）（b）流式分选图谱的代表性图像。黑色群体基于前向散射和侧向散射确定的单细胞，为死亡细胞并被7-AAD荧光标记。灰色群体为排除7-AAD、具有活力的单细胞群体。绿色门控群体由方框标示的“GFP+”区域指示，包含排除7-AAD（具活力）并表现出EGFP荧光的单细胞。
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讨论
随着小鼠遗传学领域多个研究团队的努力，表达荧光报告基因的小鼠报告品系正变得广泛可及1,8,9。因此，本文所展示的解离方法可广泛应用于从胎鼠或成年鼠组织中，根据神经递质或受体的表达模式分离特定的神经元亚型。尽管本方法的优化基于荧光转基因报告基因的表达，但它同样适用于通过活细胞免疫标记法标记细胞表面受体的样本3-5,10。
在我们的实验中，观察到多个因素影响了细胞在解离过程中存活的比例。这些因素包括从胎儿组织初次解剖到通过流式细胞术分离细胞所经历的时间、细胞悬液在过滤和流式分选过程中的轻柔操作，以及解离过程中所使用的酶的类型。肠神经和下泌尿道（LUT）前体细胞的存活均受益于快速解剖/解离以及在细胞分选过程中采用温和条件（17 psi，100 微米喷嘴，每秒 3,000 个事件）。我们发现，在流式分选仪分离前，仪器检测到的总样本群体（包括碎片和多联体在内的所有事件）中，由胎儿肠道或 LUT 组织制备的细胞悬液通常表现出约 80% 的存活率。为了排除碎片和细胞团块，首先对总群体设置前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）的初始门控。随后，通过电...
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致谢
作者谨此感谢Catherine Alford在细胞解离方法方面提出的建议，感谢Kevin Weller、David Flaherty和Brittany Matlock在范德堡大学医学中心流式细胞术共享资源平台提供的支持，以及Melissa A. Musser在插图创作方面的艺术协助。我们感谢Jack Mosher博士和Sean Morrison博士在神经前体细胞分离技术实施过程中提供的指导。范德堡医学中心流式细胞术共享资源平台得到了范德堡英格拉姆癌症中心（P30 CA68485）和范德堡消化疾病研究中心（P30 DK058404）的支持。本研究获得了美国国立卫生研究院基金项目DK064251、DK086594和DK070219的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Accumax | Sigma（制造商：Innovative Cell Technologies） | A7089-100ML | 分装成 1 ml 等份，冷冻保存 |
| DNase I | Sigma | D-4527 | 在 -20 °C 冷冻保存，5 mg/ml 溶于 1×HBSS 中， （用于淬灭步骤，按 1:5 比例稀释使用） |
| 10× PBS pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | 用细胞培养级水稀释至 1×，然后经无菌过滤 |
| 不含 Ca 或 Mg 的 10× HBSS | Gibco | 14185-052 | 用细胞培养级水稀释至 1×，然后经无菌过滤 |
| Leibovitz's L-15 培养基 | Gibco | 21083027 | |
| 青霉素/链霉素 100× | Gibco | 15140-133 | 分装后于 -20 °C 保存 |
| BSA | Sigma | A3912-100G | 分装后于 -20 °C 保存，100 mg/ml 溶于水中 |
| Biowhittaker 1 M HEPES 溶于 0.85% NaCl 中 | Lonza | 17-737E | |
| 38 μm NITEX 尼龙筛膜 | Sefar America | 3-38/22 | 裁剪为约 3 cm 的正方形，置于超净台内紫外照射过夜以灭菌 |
| 7-AAD | Invitrogen | A1310 | 1 mg/ml |
| TRIzol LS | Invitrogen | 10296-028 | |
| 5 ml 聚苯乙烯管 | Falcon | 352058 | |
| 15 ml 圆锥形离心管 | Corning | 430790 | |
| 精细解剖镊 | Fine Science Instruments | 11251-30 | Dumont#5 镊子，Dumoxel 材质，标准尖端 0.1×0.06 mm |
| 解剖勺 | Fine Science Instruments | 10370-18 |
参考文献
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- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
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- Newgreen, D. F., Murphy, M. Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration. Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).
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勘误
Formal Correction: Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice
Posted by JoVE Editors on 10/01/2012. Citeable Link.
The authors middle initials were omitted from the publication of An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice.
