在本实验方案中，我们演示了如何构建定制腔室，以施加直流电场，从而实现对成年脑源性神经前体细胞在电趋化过程中细胞体迁移的延时成像观察。
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摘要
摘要
成年哺乳动物大脑中神经干细胞和祖细胞（统称为神经前体细胞，NPCs）的发现，推动了一系列研究，旨在利用这些细胞的多能性和增殖特性，开发神经再生策略。此类策略成功的关键步骤之一，是通过外源性移植将NPCs动员至损伤部位，或增强中枢神经系统室周区域内在前体细胞的响应能力。因此，深入理解促进、引导和增强NPC迁移的机制至关重要。本研究聚焦于利用直流电场（dcEFs）促进并引导NPC迁移——这一现象称为电趋向性。内源性生理电场在正常发育和伤口修复过程中，作为细胞迁移的关键信号发挥作用。在墨西哥钝口螈胚胎中，药理学手段干扰神经管跨膜电位可导致严重的发育畸形。1在伤口愈合过程中，角膜损伤的修复速率与损伤后产生的上皮伤口电位的大小呈直接相关性，这一点已通过药物增强或破坏该直流电场得到证实。2-3我们已证明，成年脑室下区神经前体细胞在直流电场作用下会迅速且定向地向阴极迁移 体外 当暴露于外加直流电场（dcEF）时。在本方案中，我们描述了实验室建立一种简单且高效的趋电性检测方法的技术，用于在单细胞水平上对细胞体的定向迁移（迁移）进行高分辨率、长期的观察。该检测方法适用于通过使用转基因或基因敲除小鼠、短干扰RNA或特异性受体激动剂/拮抗剂，研究调控直流电场转化为细胞运动性的机制。
方案
所有涉及动物操作的实验程序均经多伦多大学动物护理委员会根据机构指南批准（方案编号：20009387）。以下方法应使用无菌工具和技术进行，适用时应在层流罩内操作。
在以下实验方案文本中，“EFH-SFM”指添加了表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和肝素的无血清培养基。由于这些有丝分裂原可维持神经前体细胞（NPCs）处于未分化状态，因此在研究未分化NPCs的电向性时使用EFH-SFM4。当研究诱导分化为成熟细胞类型的NPCs的电向性时，“FBS-SFM”指添加了1%胎牛血清的无血清培养基。FBS可促进NPCs向成熟神经表型分化5。
1. 神经前体细胞的分离与培养（视频中未展示）
- 用异氟烷麻醉一只 CD1 小鼠（6-8 周龄），并通过颈椎脱位处死。
- 用70%乙醇浸泡头部，然后用锋利的解剖剪剪下动物的头部。
- 用手术镊夹住头部，去除背侧表面的皮肤以暴露颅骨。
- 使用手术刀和11号刀片，沿额窦的内外侧轴以及矢状缝的前后方向在颅骨上划痕。
- 使用7号弯头镊子将顶骨从头部剥离，注意不要刺破脑组织。
- 从 cerebellum（小脑）下方开始，将一把薄刮铲插入脑组织下方，并向前推进至 olfactory bulbs（嗅球）。用镊子固定颅骨的同时，轻柔地将脑组织从颅腔中取出，并立即置于冰冻的 artificial cerebrospinal fluid（人工脑脊液，见下文配方）中。
- 在解剖显微镜下，使用无菌解剖剪和镊子沿中线将脑组织切成两半。将每个半脑旋转，使内侧（切割面）朝上。
- 选择一侧大脑半球，使内侧面朝上，定位胼胝体压部（胼胝体的后部）。
- 沿背腹轴方向从大脑皮层表面切至胼胝体压部。
- 将切开的皮层向嗅球方向剥离，以暴露侧脑室的内侧壁和外侧壁。
- 将半球旋转，使背侧朝上，使用弯头显微剪剪下并收集暴露的内侧壁和外侧壁，这些区域含有神经前体细胞所处的室管膜周围区6.
- 对另一侧半球重复步骤 1.8–1.11。
- 将分离的组织用移液管转移至含有7 ml胰蛋白酶溶液（见下方配方）的15 cc离心管中，将离心管置于37℃摇床中孵育 °C 培养箱中孵育 25 分钟。
- 将管子在1,500 rpm下离心5分钟，吸除上清液，并将组织重悬于2 ml胰蛋白酶抑制剂溶液中（见下方配方）。
- 使用小孔巴斯德移液管轻轻吹打组织30-50次，注意避免产生气泡。
- 以1,500 rpm离心5分钟，吸除上清液，并通过吹打沉淀3–5次，将沉淀重悬于1–2 ml SFM（见下方配方）中。
- 以1,500 rpm离心3分钟，吸除上清液，加入1 ml SFM + EFH重悬。
- 用血细胞计数板计数活细胞密度，并以每平方厘米10个细胞的密度将细胞接种于T25培养瓶中 μl 在 SFM + EFH 中。
- 将培养物静置培养7天，以获得由NPCs组成的悬浮初级神经球。
2. 电致导向迁移室的制备
- 将3块正方形1号盖玻片（22 × 22 × 0.17 mm）放入6N盐酸瓶中，浸泡过夜。
- 次日，使用金刚石尖玻璃切割器从1号正方形盖玻片上切割出6条矩形玻璃条（22 × 5 × 0.17 mm）。
- 将经酸洗的正方形玻片和矩形玻片转移至超净工作台中，先用70%乙醇清洗矩形和正方形玻片条，再用组织培养级高压灭菌水清洗，然后置于Kim Wipe纸上晾干（为提高无菌性，可让玻片自然风干）。
- 在正方形玻璃片的一面边缘涂抹真空脂，并将其密封至60 mm塑料培养皿底部。
- 在矩形玻璃条的一面长轴方向涂抹真空脂，并将其密封在正方形玻璃片的相对两侧边缘，使两者相互平行，从而形成一个中央槽道。
- 在超净工作台中对培养室进行至少15分钟的紫外灭菌。
- 用移液器将250–300 μl多聚-L-赖氨酸滴加至培养室的中央槽道中，在室温下孵育2小时。
- 在孵育结束前约15分钟，开始配制Matrigel溶液（见下文配方）。
- 吸除多聚-L-赖氨酸，用1 ml高压灭菌水清洗中央槽道，然后向其中滴加250–300 μl Matrigel溶液。
- 将培养室置于37 °C条件下孵育1小时。
- 吸除Matrigel溶液，用1–2 ml SFM轻柔清洗中央槽道。
- 向中央槽道中加入100 μl EFH-SFM或FBS-SFM，并将电趋化培养室转移至计数显微镜载物台上。
- 将含神经球的培养液3–4 ml移入一个60 mm培养皿中，并将该培养皿转移至计数显微镜载物台上。
- 在5×物镜下，使用P10移液器将5–8个完整神经球（每次最多四个）转移至每个电趋化培养室的中央槽道中，避免解离神经球，并小心地将神经球分散于中央槽道内，避免破坏Matrigel基质。
- 向中央槽道中额外添加150–200 μl EFH-SFM或FBS-SFM。
- 将电趋化培养室转移至37 °C、5% CO2、100%湿度的培养箱中孵育17–20小时（若分析未分化的NPCs），以使神经球黏附于Matrigel基质并解离为单个细胞，如图1所示。若分析已分化的NPCs，则应将孵育时间延长至69–72小时，以允许细胞充分分化。
3. 活细胞延时成像
- 在启动延时录像前，让活细胞成像系统在 37 °C、5% CO2 条件下至少平衡 30 分钟。
- 剪取两段 12 cm 长、直径 1 mm 的银丝，从一端卷绕后放入 Clorox 漂白剂中浸泡 20 分钟，以制备 Ag/AgCl 电极。
- 将电致趋化室转移至计数显微镜载物台上，根据以下标准选择用于活细胞成像迁移分析的腔室：i) 神经球应几乎完全解离为单个细胞；ii) 细胞应呈圆形形态，细胞体几乎无突起延伸。
- 在超净工作台中放置选定的电致趋化室，同时准备一片独立的方形 1 号玻璃盖玻片和真空脂。
- 先用 70% 乙醇清洗盖玻片，再用高压灭菌水冲洗，并在盖玻片两条平行边缘涂上一条真空脂。
- 吸除腔室中央槽内的培养基，迅速将盖玻片（涂有真空脂的一面朝下）放置在腔室上，使真空脂条贴合在两条平行的矩形玻璃条上，从而在腔室上方形成密封顶盖。
- 通过毛细作用向中央槽内加入 100 μl 新鲜的 EFH-SFM 或 FBS-SFM。
- 使用真空脂在中央槽两端分别构建培养基储液池的边界，如 图 2 所示。
- 剪取两段 15 cm 长的 PVC 管，用 10 ml 注射器配合 18 号针头小心将琼脂糖溶液注入管中，确保管内无气泡产生，静置 5 分钟使凝胶固化。
- 将电致趋化室连同琼脂糖凝胶管、Ag/AgCl 电极以及一对空的 60 mm 培养皿（用作培养基储液池并容纳 Ag/AgCl 电极）一起转移至活细胞成像系统中，使电致趋化室在 37 °C、5% CO2 环境中静置 20–30 分钟。
- 在此期间，使用 Dremel 工具或类似设备在两个空培养皿的盖子以及电致趋化室所用培养皿的盖子上钻孔，如 图 3 所示。
- 向中央槽两侧各加入 1–1.5 ml EFH-SFM 或 FBS-SFM，向每个空培养皿中加入 7–8 ml SFM。将两个培养皿分别置于电致趋化室中央槽的两侧，并将一根 Ag/AgCl 电极插入每个培养皿中。使用琼脂糖凝胶桥连接电致趋化室与培养皿，以建立电连续性，如 图 4 所示。
- 将 Ag/AgCl 电极连接至外部电源，并串联一个电流表以测量电流，然后打开电源。使用电压表直接测量中央槽之间的电场强度，并调节电源输出，直至达到所需电场强度（本实验室实验采用 250 mV/mm 的直流电场强度，电流维持在 1 至 1.5 mA 之间）。
- 启动活细胞成像系统的延时成像模块，让实验按预定时间运行。实验结束后，用 4% 多聚甲醛固定细胞，用于标准免疫染色分析。
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结果
运动学分析显示，在250 mV/mm直流电场（dcEF）存在下，未分化的神经前体细胞（NPCs）表现出高度定向且快速的向阴极趋电性图5A，视频1）。在无直流电场（dcEF）时，可观察到细胞的随机运动（图 5B，视频 2）。在此场强下， > 98%的未分化NPC在成像期间的整个6-8小时内持续迁移，由于死亡细胞不会发生迁移，这表明无论是否存在直流电场（dcEF），这些细胞在此期间均保持活性。
无论是否存在直流电场（dcEF），分化表型的细胞迁移均不明显（视频3、4）。部分分化细胞会延伸出突起，这些突起倾向于垂直于dcEF方向排列，但未观察到明显的细胞胞体移位。
免疫染色证实，神经前体细胞（NPCs）在直流电场（dcEF）暴露6小时后，仍保持对神经前体标志物nestin的阳性表达（图6A）。在诱导NPCs分化为成熟表型的实验中，经过6小时的dcEF暴露后，大部分细胞表达成熟星形胶质细胞标志...
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讨论
本方案改编自以往研究中已建立完善的方法7-9。趋电性实验腔室可通过多种不同技术构建，包括使用独立的玻璃小室来限制细胞接种区域，或采用CO2激光烧蚀法对中央槽进行微加工10,11。某些技术可能比其他方法更耗时或成本更高。我们描述了一种简单且经济高效的神经前体细胞趋电性腔室构建方法，所用材料在大多数细胞生物学实验室中均常见。本方案包含一个加热、加湿、CO2浓度可控的培养箱，包裹在活细胞成像系统外部，以维持细胞处于最佳状态，实现持续的长期成像。缺乏此类装置是此前部分已发表技术的局限性9,12。
近期另一研究团队利用不同的实验方案和更为繁琐的电趋性装置设计，证实了海马体细胞系的细胞具有类似的电趋性行为13。我们的实验方法尤为精巧，其优势在于能够对完全相同的起始细胞群体——即未分化的神经球来源的原代NPC细胞培养物——在不同条件下进行分析，从而只需通过调整电趋性装置中培养基所添加的因子，即可实现对未分化与已分化细胞迁移特性的直接比较。
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致谢
本研究由加拿大自然科学与工程研究委员会（资助号 #249669 和 #482986）以及加拿大心脏与中风基金会（资助号 #485508）提供资金支持。作者感谢 Youssef El-Hayek 和 Qi Wan 博士在实验方案开发过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 神经前体细胞分离 | |||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.688 g 溶于 100 ml dH₂O2O |
| 1 M KCl | Sigma | P5405 | 7.456 g 溶于 100 ml dH₂O2O |
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g 溶于 100 ml dH₂O2O |
| 155 mM NaHCO₃3 | Sigma | S5761 | 1.302 g 溶于 100 ml dH₂O2O |
| 0.5 M 葡萄糖 | Sigma | G6152 | 9.01 g 溶于 100 ml dH₂O2O |
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g 溶于 100 ml dH₂O2O |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15070 | |
| 牛胰蛋白酶 | Sigma | T1005 | |
| 绵羊睾丸透明质酸酶 | Sigma | H6254 | |
| 犬尿酸 | Sigma | K3375 | |
| 卵类粘蛋白胰蛋白酶抑制剂 | Worthington | LS003086 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 21700075 | |
| 30% 葡萄糖 | Sigma | G6152 | |
| 7.5% NaHCO₃3 | Sigma | S5761 | |
| 1 M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g 溶于 100 ml dH₂O2O |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030 | |
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | 用1 ml激素混合液重悬，并分装为20份 μl 单位。 |
| FGF | Invitrogen | PHG0226 | 用0.5 ml激素混合液重悬，并分装为20份 μl 单位。 |
| 肝素 | Sigma | H3149 | |
| 脱铁转铁蛋白 | R&D Systems | 3188-AT | 0.1 g 溶解于 4 ml dH₂O 中20 |
| 腐胺 | Sigma | P7505 | 将9.61 mg溶解于无转铁蛋白溶液中 |
| 胰岛素 | Sigma | I5500 | 将25 mg溶解于0.5 ml的0.1N HCl中，然后加入3.5 ml的dH₂O20 |
| 硒 | Sigma | S9133 | |
| 孕酮 | Sigma | P6149 | |
| 标准解剖工具 | 精细科学工具 | ||
| 解剖显微镜 | 蔡司 | Stemi 2000 | |
| 电趋化室制备 | |||
| 方形玻璃盖玻片 | VWR | 16004 | |
| 6N 盐酸 | VWR | BDH3204-1 | |
| 高真空润滑脂 | 道康宁 | ||
| 60 mm 培养皿 | Fisher Scientific | 0875713A | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma | P4707 | |
| 基质胶 | BD Biosciences | 354234 | 解冻并分装至150 μl 单位 |
| FBS | Invitrogen | 10082139 | 仅在诱导NPC分化时使用，否则使用上述指定的SFM + EFH培养基 |
| 计数显微镜 | 奥林巴斯 | CKX41 | |
| 活细胞延时成像 | |||
| 银丝 | Alfa Aesar | 11434 | |
| UltraPure 琼脂糖 | Invitrogen | 15510-027 | |
| 热灭活胎牛血清 | Sigma | 16140071 | |
| PVC管 | Fisher Scientific | 80000006 | 3/32"ID x 5/32"光密度 |
| 漂白 | Clorox | ||
| 10 cc 注射器 | BD | 309604 | |
| 18号针头 | BD | 305195 | |
| Dremel 钻头 | Dremel | Model 750 | |
| 配备加湿、培养箱式腔室的倒置显微镜 | 蔡司 | Axiovert-200M | |
| 配方 <表格 边框="1"> | |||
| 项目 | 体积 | ||
| 2M NaCl | 6.2 ml | ||
| 1M KCl | 0.5 ml | ||
| 1M MgCl₂2 | 0.32 ml | ||
| 155 mM NaHCO₃3 | 16.9 ml | ||
| 1M 葡萄糖 | 1 ml | ||
| 108 mM CaCl2 | 0.09256 ml | ||
| 青霉素-链霉素 | 1 ml | ||
| 高压灭菌水 | 74 ml |
人工脑脊液
<表格 边框="1"> 项目 体积或质量 人工脑脊液 30 ml 牛胰蛋白酶 40 mg 绵羊睾丸透明质酸酶 22.8 mg 犬尿喹啉酸 5 mg胰蛋白酶溶液
<表格 边框="1"> 项目 体积或质量 SFM 15 ml 卵类粘蛋白胰蛋白酶抑制剂 10 mg胰蛋白酶抑制剂溶液
<表格 边框="1"> 项目 体积 高压灭菌水 37 ml 10X DMEM/F12 10 ml 30% 葡萄糖 2 ml 7.5% NaHCO₃3 1.5 ml 1 M HEPES 0.5 ml 转铁蛋白，腐胺溶液 4 ml 25 mg 胰岛素溶液 4 ml 硒 100 μl 孕酮 100 μl激素混合物 （总体积100 ml，于-20℃保存） °C)
<表格 边框="1"> 项目 体积 高压灭菌水 37.5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml 30% 葡萄糖 1 ml 7.5% NaHCO₃3 0.75 ml 1 M HEPES 0.25 ml 激素混合物 5 ml L-谷氨酰胺 0.5 ml 青霉素-链霉素 0.5 ml无血清培养基 EFH-SFM： 加入10 μl 的 EGF，10 μl 的 FGF，以及 3.66 μl 肝素 FBS-SFM：加入 0.5 ml FBS
<表格 边框="1"> 项目 体积 基质胶 150 μl SFM 3.6 ml基质胶溶液 Matrigel 分装样品应置于冰盒中，缓慢融化4-5小时，形成黏稠液体后再与无血清培养基（SFM）混合。这将确保形成均匀平滑的 Matrigel 基质层。若融化过快，所得基质中可能出现 Matrigel 结块，可能阻碍细胞迁移。
<表格 边框="1"> 项目 体积或质量 UltraPure 琼脂糖 300 mg 溶于 10 ml ddH₂O20 SFM热灭活胎牛血清 8 ml
2 ml
Matrigel 溶液 将8 ml SFM与2 ml热灭活的FBS在15 cc离心管中混合。将琼脂糖与10 ml ddH₂O混合。20 放入锥形瓶中，分次微波加热，每次 10 秒，共加热 30 秒，每次加热后均需将溶液从微波炉中取出并充分混匀。最后一次 10 秒加热结束后，将琼脂糖溶液与 SFM/FBS 溶液混合，并储存于 57 °C 水浴
参考文献
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