一个的趋电含量为神经前体细胞迁移的动力学分析外部施加直流电场

摘要

在这个协议中，我们将演示如何构建自定义室，允许应用程序的直流电场，使时间的推移成像的成人脑源性神经前体细胞转趋电性。

摘要

神经干细胞和祖细胞（统称为神经前体细胞）（的NPC）在成年哺乳动物大脑的发现已导致一个机构的研究，目的是在利用这些细胞的多能和增殖特性的发展的神经再生策略。这种战略成功的一个关键步骤是动员的NPC外源性移植后向病变部位或提高内源性的前体，发现脑室周围白质区域的中枢神经系统的反应。因此，有必要了解的机制，促进，引导，增强人大迁移。我们的工作主要集中在利用直流电场（量增多），以促进和直接的NPC迁移 - 这种现象被称为趋电性。内源性生理电场的正常发育和伤口修复细胞迁移过程中发挥作用的关键线索。药理中断在蝾螈胚胎的的跨神经管潜力会导致严重的发育畸形。的速度修复受伤的角膜伤口愈合的情况下，直接与上皮损伤后产生的伤害潜力的幅度，药理增强或中断，这DCEF ^2-3所示。我们已经证明，成年室管膜下的NPC进行快速和导演的阴极迁移的影响 ，当暴露在外部施加的dcEF。在这个协议中，我们将介绍创建一个简单而有效的高分辨率，长期观察的细胞体易位（迁移）在单细胞水平的趋电检测实验室的技术。该测定中，将适合于调查机制调节dcEF转导到细胞运动通过使用转基因或基因敲除小鼠，短干扰RNA，或特定的受体激动剂/拮抗剂。

方案

多伦多大学的动物保健委员会批准了在所有涉及动物处理的程序，按照制度指引（协议。20009387）。应当执行下面的方法，使用无菌的工具和技术，在层流罩（如适用）。

在下面的协议文本中，短语"EFH-SFM"是指以与表皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子和肝素的无血清培养基中。 EFH-SFM调查时，未分化的NPC，因为这些有丝分裂原的趋电维持其未分化状态的NPC ^4。当调查趋电的NPC诱导分化成成熟的细胞类型，"FBS-SFM"指的是含1％胎牛血清的无血清培养基中。 FBS促进NPC的分化为成熟的神经表型。

1。神经前体细胞的分离和培养（不视频中所示）

1. 一个CD1小鼠（6-8周龄）麻醉与异氟烷和牺牲精神，通过颈椎脱位。
2. 浇在70％的乙醇和锐性剥离剪刀斩首动物的头。
3. 用手术钳头，背表面上去除皮肤暴露的头骨。
4. 用手术刀并没有。 11刀，颅骨额窦的沿内外侧轴的得分，也沿矢状缝在rostrocaudal方向。
5. 没有远离头部顶骨去皮。 7弯曲的镊子，小心不要刺破脑组织。
6. 将下方的小脑和大脑开始走向嗅球薄锅铲下。用钳子按住头骨的地方，轻轻一拉从头骨的脑，并立即将其放置在冰冷的人工脑脊液（见下面的食谱）。
7. 在解剖显微镜下，用消毒解剖剪刀和镊子把大脑中的一半沿中线。旋转，使每个半球的内侧表面（切段）朝上。
8. 选择一个半球，内侧面朝上，找到胼胝体压部，胼胝体（胼胝体后区）。
9. 做一个切口从皮层的表面沿背腹轴的胼胝体的胼胝体压。
10. 去皮，切开皮层向嗅球暴露侧脑室壁的内侧和外侧。
11. 旋转，这样的半球背表面朝上，并使用弯曲microscissors，切出，收集暴露的内侧和外侧的墙壁，其中包含的脑室周围地区的NPC位于。
12. 重复步骤1.8-1.11另一半球。
13. 用移液管的离体组织到7毫升的胰蛋白酶溶液（见下面的配方），在15毫升管中，并放置在37℃的管上的摇杆培养箱中培养25分钟。
14. 管在1,500 rpm离心5分钟，吸出上清液，并重新悬浮在2毫升的胰蛋白酶抑制剂溶液（见下面的配方）的组织。
15. 轻轻捣碎组织一个小孔径巴斯德吸管30-50倍小心，以避免气泡。
16. 离心管在1,500 rpm离心5分钟，吸出上清液，并重新悬浮在1-2ml的SFM（见配方下面）通过捣碎沉淀3-5倍。
17. 离心管在1,500 rpm离心3分钟，吸出上清液，重悬在1ml的SFM + EFH。
18. 用血细胞计数板在T25培养瓶中的细胞的密度为10个细胞每微升SFM + EFH中，计数活细胞密度。
19. 允许的文化成长为7天不受干扰产生的NPC组成的自由浮动的主要神经球。

2。趋电池准备

1. 放置3个方形玻璃。 1盖玻片（22×22×0.17毫米）呐瓶的6N盐酸过夜。
2. 第二天，使用金刚石尖端玻璃刀片削减6矩形条（22×5×0.17毫米）的玻璃从方无。 1盖玻片上。
3. 酸洗方形单和矩形单传送到在层流罩中。矩形和正方形带先用70％乙醇洗净，然后用组织培养级的灭菌水，并允许上的金擦拭干燥（用于加入无菌，玻璃可能被允许空气干燥）。
4. 应用真空脂玻片的平方的一个表面的周边，将它们密封的60毫米的塑料陪替氏培养皿的基础上。
5. 应用真空润滑脂沿长轴的长方形玻璃条的一个表面，将它们密封的相对边缘的方形的载玻片（使得它们彼此平行地），以建立一个中部槽。
6. 紫外线消毒室，层流罩至少15分钟。
7. 移液器250-300μl的聚-L-LYSI东北到中央槽室，室温孵育2小时。
8. 约15分钟之前结束的潜伏期，准备Matrigel的解决方案（见下面的配方）。
9. 吸取聚-L-赖氨酸，用1毫升灭菌水，和移液管250-300微升到中央槽的Matrigel溶液洗中央槽。
10. 在37°C孵育室1小时。
11. 吸取基质胶溶液，轻轻地洗1-2毫升SFM中央槽。
12. 吸取100微升EFH-SFM或FBS-SFM到中央槽和转移的趋电室搬上舞台，显微镜计数。
13. 移液器3-4毫升的神经球的含培养一个60毫米的培养皿中，并转移到陪替氏培养皿的计数显微镜的阶段。
14. 在观看目标的5x，使用P10吸管5-8整个神经球（最多四个在一个时间）传输到各趋电槽中央室无解离，并小心地围绕中部槽不破坏基底膜基板的情况下的神经球。
15. EFH-SFM或FBS-SFM添加一个额外的150-200微升到中央的低谷。
16. 趋电室转移到在37℃，5％CO _2，100％湿度的培养箱中培养17-20小时（如果分析未分化的NPC）允许神经球坚持的Matrigel的衬底，并分离成单个细胞，如在图1中所示。如果分析差异化的NPC，潜伏期延长到69-72小时，让细胞分化。

3。活细胞延时成像

1. 允许活细胞成像系统平衡，在37℃，5％CO _2中的至少30分钟的时间推移记录开始前。
2. 剪下的两个12厘米的块1毫米直径的银线，线圈的一端，并将其放置在高乐氏（Clorox）b浸20分钟，以形成Ag / AgCl电极。
3. 转移的趋电性室的计数显微镜搬上舞台，并选择该室将被用于活细胞成像迁移分析基于以下标准:i）本神经球应该是几乎完全离解成单个细胞及ii）应具备的细胞小到没有任何进程从细胞体延伸的圆形形态。
4. 转移到在层流罩中选定的趋电室，以及一个单独的正方形无。 1玻璃盖片和真空润滑脂。
5. 洗盖滑先用70％的乙醇，然后用无菌水，并应用真空润滑脂在两条平行的盖玻片的边缘的带状。
6. 吸出培养基从中部槽室，室的润滑脂条剩下的两个平行的长方形玻璃条，有效地创建一个屋顶上，然后迅速将的盖玻片（油脂面朝下）会议厅。
7. 吸取100微升新鲜EFH-SFM或FBS-SFM到中央槽通过毛细作用。
8. 使用真空脂培养基池创建边界的中心槽的每一端上，如在图2中示出。
9. 剪切PVC管的两个15厘米的片，并使用10毫升的用18号针头的注射器仔细的琼脂糖溶液注入到管中，确保无气泡在管中形成的，使凝胶固化5分钟。
10. 转移趋电室的活细胞成像系统中，沿与琼脂糖凝胶管，的Ag / AgCl电极，以及一对空的60毫米的培养皿中，将被用作培养介质储层并且将包含Ag / AgCl电极。允许的趋电室休息内的37℃，5％CO _2的环境，为20-30分钟。
11. 在此期间，准备钻孔的2个空培养皿的盖子和趋电性室的皮氏培养皿的盖子到他们具有的Dremel或类似的工具，如在图3中所示。
12. 用移液管1-1.5毫升EFH-SFM或FBS-SFM到两侧的中部槽，和7-8毫升的SFM到每一个空的培养皿中。将一个培养皿每一侧的趋电性室的的槽中央和地方，一个Ag / AgCl电极为每一道菜。趋电室和培养皿建立电连续性与琼脂糖凝胶桥桥之间的间隙，如在图4中示出。
13. Ag / AgCl电极连接到一个外部电源，用电流表串联测量电流，并开启电源。使用电压表测量直接跨接在槽中央的电场强度，调整输出的电源，直到所需的电场强度达到（在该实验室进行的检测采用DCEF强度在250 mV /月之间的电流1和1.5毫安）。
14. 创议特的时间推移模块上的活细胞成像系统，并允许在实验过程中运行所需的时间量。测定完成后，进行细胞固定在4％多聚甲醛的标准免疫染色分析。

结果

运动学分析表明，在250毫伏/毫米dcEF的存在下，未分化的NPC表现出高度定向和快速的趋电向阴极（ 图5A，电影1）。在一个dcEF缺席，随机运动的细胞中观察到（ 图5B，电影2）。在此输入强度，> 98％的未分化的NPC迁移整个6-8小时，这是他们的成像，并自死细胞不迁移，这表明，它们在此期间，在存在或不存在的dcEF仍然可行。

有区别的表型进行可以忽略不计的迁移，无论是在存在和不存在的DCEF（ 电影3，4）。分化的细胞的亚群的延伸过程，往往对齐垂直方向的dcEF，但没有明显的细胞体观察到易位。

免疫组化染色验证的NPC保持积极的表达探讨n为DCEF曝光（ 图6A），6小时后的神经前体标记物巢蛋白。在检测涉及的NPC诱导分化成成熟的表型的，大多数的细胞表达成熟的星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP），6小时后的DCEF曝光（ 图6B）。 <...

讨论

该协议已经进行了调整，从以前的研究^7-9的行之有效的方法。可以使用各种不同的技术，包括建造一个单独的玻璃以及禁闭细胞接种中部槽^10,11的微细化，或使用CO ₂激光烧蚀构造galvanotactic室。有些技术可能比别人更费力，代价高昂的。我们描述了一个简单和成本效益的分析，为构建全国人民代表大会趋电性室使用的材料通常存在于大多数细胞生物学实验室。我们的协议，包括可加热，加湿，CO ₂稳压孵化器，周围的活细胞成像系统，以保持在最佳条件下长期连续成像的细胞。这种装置是缺乏的限制，以前的一些技术^9,12。

另一组最近的工作表现出了类似的GALVAnotactic行为的细胞海马细胞株^13，使用不同的协议和劳动密集的趋电性室设计。我们的分析是特别优雅，因为它允许细胞的的同一起跑线人口的分析 - 原代细胞培养获得的未分化的神经球的NPC - 已经暴露在不同的条件，从而使未分化和分化细胞的迁移特性的比较，简单地通过修改用于补充培养基内的趋电室的因素。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
项目名称	公司	目录编号	评论
			神经前体细胞分离
2M的NaCl	西格玛	S5886	11.688克溶解在100毫升蒸馏水2 O
1M氯化钾	西格玛	P5405	7.456克溶解在100毫升蒸馏水2 O
1M MgCl 2的	西格玛	M2393	20.33克溶解在100毫升蒸馏水2 O
155毫米碳酸氢钠	西格玛	S5761	1.302克溶解在100毫升蒸馏水2 O
0.5M葡萄糖	西格玛	G6152	溶解在1009.01克毫升蒸馏水2 O
108毫米氯化钙	西格玛	C7902	1.59克溶解在100毫升蒸馏水2 O
青霉素，链霉素	Gibco公司	15070
牛胰腺胰蛋白酶	西格玛	T1005
羊睾丸透明质酸酶	西格玛	H6254
犬尿喹啉酸	西格玛	K3375
卵类粘蛋白胰蛋白酶抑制剂	沃辛顿	LS003086
DMEM	Invitrogen公司	12100046
F12	Invitrogen公司	21700075
30％葡萄糖	西格玛	G6152
7.5％的NaHCO 3	西格玛	S5761
1M HEPES	西格玛	H3375	23.83克溶解在100毫升蒸馏水2 O
L-谷氨酰胺	Gibco公司	25030
EGF	Invitrogen公司	PMG8041	复溶在1毫升的激素组合和等分成20微升单位。
成纤维细胞生长因子	Invitrogen公司	PHG0226	复溶在0.5毫升的激素组合和等分成20微升单位。
肝素	西格玛	H3149
APO转	R＆D Systems公司	3188-AT	0.1 g溶于4毫升蒸馏水2 0
腐胺	西格玛	P7505	将9.61毫克到APO转，所以lution
胰岛素	西格玛	I5500	25毫克，溶于0.1N盐酸0.5毫升增加至3.5毫升卫生署2 0
硒	西格玛	S9133
黄体激素	西格玛	P6149
标准的解剖工具	精细科学工具
解剖显微镜	蔡司	STEMI 2000
			趋电池准备
方形玻璃盖幻灯片	VWR	16004
6N盐酸	VWR	BDH3204-1
高真空润滑脂	道康宁
60毫米陪替氏培养皿	Fisher Scientific则	0875713A
聚-L-赖氨酸	西格玛	P4707
基底膜	BD Biosciences公司	354234	解冻后取到150微升单位
FBS	Invitrogen公司	10082139	只有使用诱导NPC分化，以其他方式使用SFM + EFH文化传媒如上文所述的
计数显微镜	奥林巴斯	CKX41
			活细胞延时成像
银线	阿法埃莎	11434
超纯琼脂糖	Invitrogen公司	15510-027
热灭活ated FBS	西格玛	16140071
PVC管	Fisher Scientific则	80000006	3/32"ID×5/32"OD
漂白	高乐氏（Clorox）
10毫升注射器	BD	309604
18号针	BD	305195
DREMEL钻	DREMEL	型号750
倒置显微镜配备了加湿，孵化室	蔡司	Axiovert-200M
			食谱 项目 量 2M的NaCl 6.2毫升 1M氯化钾 0.5毫升 1M MgCl 2的 0.32毫升 155MM 碳酸氢钠 16.9毫升 1M葡萄糖 1毫升 108毫米氯化钙 0.09256毫升 青霉素，链霉素 1毫升 无菌水 74毫升 人工脑脊液 项目 体积或质量 人工脑脊液 30毫升 牛胰腺胰蛋白酶 40毫克 羊睾丸透明质酸酶 22.8毫克 犬尿喹啉酸 5毫克 胰蛋白酶溶液 项目 体积或质量 SFM 15毫升 卵类粘蛋白胰蛋白酶抑制剂 10毫克 胰蛋白酶抑制剂解决方案 项目 量 无菌水 37毫升 10X DMEM/F12 10毫升 30％葡萄糖 2毫升 7.5％的NaHCO 3 1.5毫升 1M HEPES 0.5毫升 转铁蛋白，腐胺溶液 4毫升 25毫克胰岛素的解决方案 4毫升 硒 100亩; L 黄体激素 100微升 激素组合 （100毫升总，储存在-20°C） 项目 量 无菌水 37.5毫升 10X的DMEM/F12（3:1） 5毫升 30％葡萄糖 1毫升 7.5％的NaHCO 3 0.75毫升 1M HEPES 0.25毫升 激素组合 5毫升 L-谷氨酰胺 0.5毫升 青霉素，链霉素 0.5毫升 EFH-SFM无血清培养基:添加10μl的表皮生长因子，10μl的成纤维细胞生长因子，肝素FBS-SFM和3.66微升:添加0.5毫升FBS
项目	量
基底膜	150微升
SFM	3.6毫升

项目	体积或质量
超纯琼脂糖	在10毫升DDH 2 O 300毫克
SFM 热灭活FBS	8毫升 2毫升