本文介绍一种新型的高内涵化学诱导炎症检测方法，旨在鉴定具有免疫调节作用的生物活性物质。我们已成功将自动化显微镜技术与自主开发的软件脚本相结合，实现了对炎症反应的自动化定量，以及后续的数据处理、分析、挖掘和存储。
本文内容
摘要
摘要
斑马鱼幼鱼因其体型小、易于操作和观察，且化合物可直接加入孵育水中，并能在含 <1% DMSO 的溶液中被有效吸收，因而特别适用于全动物小分子筛选1,2。由于斑马鱼幼鱼具有良好的光学通透性，并且已有多种转基因品系可在白细胞中表达荧光蛋白，因此能够实现对急性炎症反应进行活体（in vivo）实时监测，这是其独特的优点。因此，已有研究提出利用斑马鱼开展高通量、高内涵的小分子筛选，以鉴定具有免疫调节功能的化合物3-6，并建立了多种诱导炎症的模型，例如局部鳍组织划伤、激光照射胚胎卵黄表面7或尾鳍截除3,5,6。然而，这些方法的主要局限在于需要手动操作幼鱼以造成损伤，因而难以实现高通量筛选。化学诱导炎症（ChIn）检测法的建立8克服了上述障碍。由于损伤是通过化学方法诱导的，因此可同时处理的胚胎数量几乎不受限制。短暂暴露于硫酸铜可选择性地诱导侧线系统毛细胞死亡，并迅速招募粒细胞至受损的感觉丘（neuromast）。通过使用双转基因 cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 斑马鱼幼鱼，可实时追踪炎症反应，其中绿色荧光蛋白在感觉丘细胞中表达，红色荧光蛋白则标记粒细胞。
为了设计一种既能实现高内涵又能实现高通量分析的筛选策略，我们引入了机器人液体处理系统，并将自动显微成像与自行开发的软件脚本相结合。该脚本通过计算在经验确定的损伤绿色荧光神经丘周围区域内红色荧光白细胞所占的百分面积，实现对炎症反应的自动量化。此外，我们还基于自行开发的 MATLAB 和 Python 脚本，实现了数据处理、管理、可视化和存储的自动化。
简而言之，我们介绍了一种自动化的高通量/高内涵筛选方法，可用于检测化学化合物对粒细胞炎症反应的启动、进展或消退的影响。该方案为深入分析药物在调控先天免疫反应中所涉及的作用机制和信号通路提供了良好的起点。未来，该方法可能有助于在药物发现的早期阶段识别不可接受的毒性或脱靶效应，从而降低药物研发过程中的风险和成本。
方案
1. 动物操作
进行ChIn检测时，使用纯合双转基因cldnB::GFP/lysC::DsRED2鱼与AB（野生型）鱼群体交配后产生的3 dpf幼鱼。通过自然产卵收集胚胎，并在培养皿中用E3培养基（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4和0.1%亚甲蓝，pH平衡至7.0）于29 °C条件下培养。每个培养皿中胚胎密度必须控制在每皿不超过50–70个。
2. 幼虫分选
在荧光体视显微镜下检查所有幼虫的荧光报告基因表达、自发性炎症以及与年龄相符的发育情况。
3. 筛选培养基的制备（务必新鲜配制）
配制不含亚甲蓝但添加DMSO（终浓度1%）和MS222（0.05 g/L）的E3培养基。
4. 硫酸铜溶液的配制（务必新鲜配制）
首先称取CuSO4（Mr=159.6 g/mol），用dH2O配制20 mM的储备液。用E3/DMSO(1%)/MS-222将20 mM储备液稀释配制120 μM的CuSO4工作液。避光保存CuSO4溶液。
5. 384孔板制备（Greiner 384孔微孔板）
使用反向移液法，预先向每个孔中加入 20 μl 的 E3/DMSO(1%)/MS-222。为避免损伤胚胎，需使用孔径增大的移液枪头，可通过剪切枪头使其孔径达到 2 mm 来实现。将单个幼鱼转移至含 74 μl 培养基的孔中（未处理对照组为 84 μl）。如有必要，可使用柔性 Eppendorf Microloader 移液枪头（Eppendorf；5242 956.003）将幼鱼在孔内调整为侧卧位置。
使用机器人液体处理工作站进行以下所有液体操作步骤，以确保同时处理所有幼虫。
6. 药物处理
用移液器上下吹打5次，混匀药物储备板中的化合物。向每个孔中加入16 μl的7.5倍浓度药物储备液，并吹打混匀5次。调整移液枪头在孔内的位置，避免损伤幼虫，并以10 μl/s的速度加入培养基。在孔内吹打混匀培养基4次，以确保药物在孔内均匀分布。
7. 孵育
将筛选板在29 °C孵育1小时，表面用铝箔覆盖，以保护化合物以及CuSO4免受光照。
8. 化学损伤
除阴性对照外，向每个孔中加入10 μl 120 μM CuSO4工作溶液，混匀4次，再于29 °C孵育1小时。
9. 清洗
每次加入 20 μl 培养基，重复两次，共移除并更换每孔 80 μl 培养基，以去除化合物和 CuSO4。
10. 图像采集
在初次铜处理后90分钟，于倒置自动显微镜（例如：Olympus scan^R）上开始图像采集。设置初始z轴位置，使左右后侧线的神经丘可见。使用4倍物镜（数值孔径 = 0.13），每小时对每个孔进行一次成像，采集明场、Cy3和GFP通道的图像，共采集4个焦平面（间距50 μm）。
如有需要，可提供有关图像和数据处理的更多信息。
11. 图像处理
1. 数据排序
原始图像通过我们定制的 LabView 软件脚本进行处理。图像处理流程中的第一步是根据通道、孔板和时间点信息，对来自显微镜生成数据文件夹中的原始图像进行分类排序。
2. 扩展焦距
随后，软件会从每个通道的4个焦平面生成扩展焦距图像。
3. RGB叠加
最后一步是将三个通道的扩展焦距图像合并，得到最终的 RGB 叠加图像。
4. 自动化神经丘检测
一种模式识别工具（LabView Rapid IA 原型开发工具）可在 RGB 叠加图像中识别神经丘，并在神经丘周围创建一个经验定义的兴趣区域。
5. 定量分析
在定义的损伤后感觉细胞周围经验性感兴趣区域内，对红色荧光标记的白细胞（以红色像素反映）进行计数，从而获得主要的读出结果 p百分比 area o被占据的 l白细胞（Paol）。平均而言，95.27 ± 2.11%（FDA1）和 95.12 ± 1.56%（FDA2）的孔（幼虫）被正确检测，并进入后续数据处理。原始数据输出（Paol 每个检测到的神经丘的数据均存储在txt文件中，并作为MATLAB脚本进一步处理原始数据的输入。
12. 数据处理
1. iMaps
通过使用所谓的炎症图谱（iMaps）以颜色编码的方式对原始数据输出Paol进行图形化可视化，可评估单个实验的成功与否（图2）。亮绿色表示较高的初始炎症指数；黑色表示无炎症。这种快速概览有助于迅速识别失败的实验，从而将其排除在后续数据分析之外。
2. 对照组的平均值计算
每块实验板包含320种化合物，每种化合物在每个时间点仅反映一个数据点，同时包含32个阳性对照和32个阴性对照。32个对照重复实验的数据取平均值并计算标准差。对于对照，仅纳入在2个标准差范围内的数据点。
3. 标准化
标准化通过电子表格分析完成。以DMSO作为阴性对照，其平均值设为0；铜对照的最高平均Paol值设为1，从而使阳性与阴性对照之间的最大差异为1。每个化合物的Paol值在实验板上相对于相应对照进行线性插值或外推。
4. 最终读数：炎症指数
在完成足够数量的重复实验（即15次）后，将重复实验的归一化原始数据取平均值，得到最终读数——炎症指数。铜对照组的初始炎症指数在零时间点设为100%，该时间点对应于图像采集的开始时间（即初始铜处理后90分钟）。
5. 单调指数回归拟合
由于炎症会随时间逐渐消退，我们通过使用
对初始炎症进行单调指数非线性回归拟合——其中 a0 表示在 t=0 时的初始反应程度，a1 与炎症强度随时间变化的斜率相关。
6. 二维特征空间图（图4）
为了生成特征空间，采用非线性回归方法，并通过聚类分析将特征空间划分为若干特征区域，从而实现对不同免疫调节类别（抗炎、抗消退、促炎、促消退）中感兴趣候选物的自动识别。所有化合物均基于参数 a0 和 a1 在二维图中显示。
13. 数据处理与存储
我们的数据处理流程可生成网页，用于可视化和展示此类药物筛选结果，既可快速概览图像和数据处理步骤的结果，也可根据用户需求提供详细视图10。同时整合了与其他相关异构生物和化学数据库的软链接，为比较研究和创新性研究提供有价值的资源11。通过这些流程，为数据的长期存储建立了适当的数据标准和元信息。
14. 代表性结果
在一项初步筛选中，我们分析了一个包含640种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的已知生物活性化合物的文库，评估其对粒细胞性炎症反应的起始、进展或消退过程的影响。根据观察到的效果，我们将免疫调节表型分为四类，可能提示不同的作用机制：抗炎型（1）、抑制消退型（2）、促炎型（3）和促消退型（4）。这些表型可通过参数a0和a1进行描述，这两个参数来源于对初始炎症程度的单调非线性回归拟合（eao+alx-）。其中，a0代表炎症反应的强度，而a1表征曲线的斜率，从而反映炎症的消退情况。将所有化合物在二维特征空间图中（a1 对 a0）进行展示，可实现对不同免疫调节类别中潜在阳性化合物的自动化识别（图3）。
在640种化合物中，有45种通过将初始炎症指数降低至50%或更低，表现出显著的抗炎效果。在此类别中，我们发现了6种属于非甾体抗炎药（NSAIDs）药理类别的化合物，证实了我们方法的有效性。然而，NSAIDs并未位列抗炎作用最强的药物之中。除NSAIDs外，我们还发现了其他多种药理类别的药物，例如血管紧张素受体阻滞剂（ARBs）、抗生素和质子泵抑制剂。
有7种化合物符合经验定义的潜在促分解药物阈值标准。
18 种药物产生了促炎效应，与阳性对照相比，导致向受损神经丘募集的白细胞显著增加。
仅有两种化合物能够防止炎症反应的及时消退。
在后续的二次ChIn检测中，初步筛选中发现的若干命中候选药物（上述药理学药物类别中的代表性候选药物）的抗炎作用得以以剂量依赖的方式得到证实（数据未显示）。对4种潜在促分解药物的重复测试未能证实其在初筛中所显示的作用模式。其中2种药物在较高浓度（20 μM）下表现出轻微的抗炎潜力。第三种药物在5–20 μM的药物浓度范围内表现出微弱的、非剂量依赖性的抗炎效应。第四种药物在所测试的浓度下对炎症反应无任何影响。
图 1. ChIn 检测的工作流程。 将单个化合物转基因 cldnB::GFP/lysC::DsRED2 斑马鱼幼体（3 日龄）手动分配至 384 孔微孔板中。使用 Zephyr Compact 液体处理工作站向每个孔同时加入药物。随后将检测板在 29 °C 下孵育 1 小时。用 CuSO4 溶液（终浓度 10 μM）处理 1 小时以造成损伤并引发急性炎症反应。最后，洗去硫酸铜溶液和药物，并开始自动图像采集（在初次铜处理后 90 分钟）。
图2. 原始图像概览。 该图显示了在Cy3（左）和GFP（右）通道中，四个焦平面（Z=0 - 3）的原始图像，各平面间距为50 μm。箭头（Z=1,2）指示示例性的神经丘，箭头尾（Z=1,2）指向围绕神经丘聚集的白细胞。
图3. 炎症图谱（iMaps）。 单个实验的成功与否可以通过以下方面进行评估 iMaps 以颜色编码反映炎症反应（原始数据）：亮绿色表示强烈的初始炎症反应；黑色表示无炎症。 iMaps 在时间点0（左）和时间点5（右）的结果可清晰判断该实验是否应纳入后续数据处理。铜对照孔（第13和24行）呈现不同深浅的绿色，而DMSO对照孔（第1和12行）则为深绿色或黑色。在时间点5，铜对照组的炎症几乎已消退，表现为深绿色或黑色。 单击此处查看大图.
图4. 基于FDA批准化合物库中320种化合物及其相应对照的二维特征空间图。 所有化合物孔位可根据参数a0和a1在二维特征空间图中显示，这些参数来源于对初始炎症的非线性回归拟合（）。该特征空间图可自动识别属于以下四种免疫调节类别之一的潜在候选化合物，这些类别可能提示药物的作用机制：抗炎（1）、抗消退（2）、促炎（3）和促消退（4）。 点击此处查看高清大图。
讨论
在此，我们介绍一种完全自动化的高通量筛选策略，可在整体动物背景下实现免疫调节化合物的鉴定，从而能够监测急性炎症反应。 体内 并实时地。
我们提供了一种利用斑马鱼作为药物发现或药物再利用研究的有价值模式生物的实验方案，因为可以在具有完整功能的先天免疫系统的背景下，相对容易地研究药物对白细胞向伤口募集的影响。本方法的独特优势在于，化学损伤可避免对手工操作幼体的依赖，从而实现自动化以及高通量形式的筛选。
此外，利用所提出的实验设置，可以方便地评估药物的不良或毒性作用以及强烈的脱靶效应。然而，FDA 批准的化合物库在给定的筛选浓度下并不包含任何有毒化合物。尽管如此，我们建议对于明显具有毒性的化合物，应比较测试库中同一药理物质类别成员之间的可用数据集（例如免疫调节表型、药物浓度）。如果某一物质家族中存在具有毒性的成员，而该家族其他成员表现出有前景的免疫调节表型，则可根据需要在更低浓度下重新测试这些有毒成员。
我们已证明可根据药物发挥的免疫调节作用，自动对其进行分类。属于抗炎化合物类别的药物已在独立实验中得到验证，其中大多数化合物的作用呈剂量依赖性。迄今为止，所鉴定出的四种潜在促分解药物尚无法确认其促分解作用。这还表明，这一特定的免疫调节类别较难界定，因为目前文献中尚未描述仅影响炎症消退过程的药物。然而，在重新测试的4种药物中，有3种在较高摩尔浓度下表现出抗炎趋势。优化经验定义的阈值标准将有助于减少假阳性结果的数量。
此外，该技术还可用于鉴定影响白细胞迁移行为的基因中的突变8。
综上所述，该方法可通过提供潜在新先导化合物在药物耐受性、毒性、剂量以及潜在脱靶效应方面的 readily available 信息，促进并加速药物发现或药物再利用的研究。因此，该方法可作为药物开发早期阶段一种简单、节约成本和时间的策略。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢 Nadeshda Wolf、Nadine Eschen 和 Susanne Delong 在动物饲养方面提供的出色支持。CW 获得了亥姆霍兹研究项目“BioInterfaces 国际研究生院”（BIFIGS）提供的博士奖学金支持。CG 获得了卡尔斯鲁厄理工学院研究种子基金（KIT-RISC）以及第七个欧洲共同体框架计划内的玛丽·居里国际回归基金（PIRG07-GA-2010-267552）的进一步资助。AHS 获得了 BOLD（肝脏与胰腺发育及疾病生物学）——玛丽·居里初始培训网络（238821）的支持。UL 获得了 Dopaminet FP7（第七框架计划）（223744）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 二甲基亚砜 | Carl Roth GmbH & Co KG | A994.2 | |
| 无水硫酸铜(II) | Carl Roth GmbH & Co KG | PO23.1 | |
| 经FDA批准的药物文库 | Enzo Life Sciences | BML-2841-0100 | |
| 384孔微孔板 非结合表面，μClear | Greiner | 781906 | 黑色 |
| Olympus scan^R | Olympus | ||
| Zephyr Compact 液体处理工作站 | Caliper |
参考文献
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