对下丘脑小鼠脑切片中GFP标记神经元的钙反应进行成像

摘要

在本方案中，我们介绍了利用红色荧光Ca²⁺指示剂染料对脑组织切片中GFP标记的神经元进行Ca²⁺信号成像的最新进展。

摘要

尽管我们对大脑中信息编码机制的认识已大幅增长，但关于下丘脑等脑区多功能核团中特定神经元的精确分子步骤及其活动的核心问题仍然存在。这一问题包括参与调控各种神经激素信号转导级联反应的分子组分的鉴定。细胞内 Ca²⁺ 浓度的升高在调节神经元敏感性方面起着重要作用，无论是在信号转导水平还是在突触部位均如此。

近年来，一些新工具被开发出来，用于在大脑中纷繁复杂的神经元中识别特定神经元，其原理是在特定启动子的调控下表达绿色荧光蛋白（GFP）。为了在空间和时间上同时监测GFP标记神经元中由刺激诱导的Ca²⁺反应，需要使用非绿色荧光的Ca²⁺指示剂染料。此外，共聚焦显微镜因其能够清晰显示组织切片中不同深度平面的单个神经元，并有效限制非焦平面的荧光干扰，已成为成像单个神经元的常用方法。已有研究将比率型Ca²⁺指示剂fura-2与GFP标记的神经元结合使用¹。然而，该染料需用紫外光（UV）激发，而紫外激光器成本较高，且紫外光在组织中的穿透深度有限，限制了其在许多实验室的应用。此外，GFP的荧光可能干扰fura-2的信号²。因此，我们决定采用一种红色荧光的Ca²⁺指示剂染料。fura-red具有极大的斯托克斯位移，使其可在单一激发波长下与GFP联合实现红色荧光的多色分析。我们此前在GFP标记的嗅觉神经元中联合使用fura-red已取得良好效果³。用于嗅觉组织切片的实验方案在下丘脑神经元中似乎同样有效⁴。基于fura-red的Ca²⁺成像也已成功应用于GFP标记的胰岛β细胞以及在HEK细胞中表达的GFP标记受体^5,6。fura-red的一个特殊性质是：当该指示剂与钙结合后，其在650 nm处的荧光强度会降低⁷。因此，Ca²⁺浓度较低的静息状态神经元具有相对较强的荧光强度。需要指出的是，目前已有其他红色Ca²⁺指示剂染料或正在开发中的新型染料，可能在不同类型的神经元或脑区中提供更优或改进的成像结果。

方案

1. 溶液与琼脂糖凝胶的制备

1. 根据表格使用双蒸水配制细胞外液。用碳氧混合气体（95% O₂ / 5% CO₂）充气约10分钟后，pH值约为7.3，渗透压为300 mOsm⁸。若需更高渗透压，可通过添加葡萄糖进行调节（1 mM相当于1 mOsm）。溶液需使用0.2 μm膜滤器过滤两次，以去除灰尘颗粒和可能的细菌污染。

试剂名称	缩写	分子量	浓度	公司	目录号 N°
氯化钠	NaCl	58.44 g/mol	120 mM	VWR	27810
碳酸氢钠	NaHCO₃3	84.01 g/mol	25 mM

讨论

神经科学中的一个核心问题是理解大脑如何处理社会信息。社会识别所需的主要信息来源由嗅觉或信息素信号编码。这些信号通过鼻腔内的神经元群体检测，并在大脑中（尤其是下丘脑）被识别，这在许多社会行为过程中发挥关键作用，并影响激素及其他神经内分泌因子^13-16。在如下丘脑等包含多种功能核团和大量神经元的脑区中，分析神经元反应的一个主要障碍在于如何识别出特定的目标神经元。

已开发出许多转基因小鼠品系，其中主要利用GFP来标记神经元。然而，GFP的荧光特性会干扰使用如fluo-3和fluo-4等Ca²⁺指示剂染料进行的测量¹⁷。因此，我们开始采用红移型Ca²⁺指示剂染料（如fura-red）来研究GFP标记的神经元^3,4。此前，基于fura-red的Ca²⁺成像已与表达GFP的胰岛β细胞以及在HEK细胞中表达GFP标记受体的研究相结合^5,6。与fura-2类似，已有报道指出fura-red与GFP之间存在一定的串扰²。然而.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Sigma	A1296
Fura-red/AM	Invitrogen	F-3021
Pluronic F-127	Sigma	P2443
二甲基亚砜	Fisher Scientific	BP231
振动切片机 Hyrax V 50	Zeiss	9770170
切片机冷却装置 CU 65（适用于 Hyrax V 50）	Zeiss	9920120
O2/CO2 培养箱，CB210-UL	Binder	0019389
超级胶水，Loctite 406TM	Henckel	142580
双头刮勺，勺形	Bochem	3182
微型刮勺，勺形	Bochem	3344
弹簧剪刀，Moria-Vannas-Wolff，7 mm 刀片	Fine Science Tools	15370-52
弹簧剪刀，Vannas，3 mm 刀片	Fine Science Tools	15000-00
Wagner 剪刀	Fine Science Tools	14071-12
医用镊子，Dumont 7b	Fine Science Tools	11270-20
大型矩形开放式浴槽（RC-27）	Warner Instruments	64-0238
共聚焦显微镜 BioRad Radiance 2100	Zeiss	n.a.