对下丘脑小鼠脑切片中GFP标记神经元的钙反应进行成像

摘要

在本方案中，我们介绍了利用红色荧光Ca²⁺指示剂染料对脑组织切片中GFP标记的神经元进行Ca²⁺信号成像的最新进展。

摘要

尽管我们对大脑中信息编码机制的认识已大幅增长，但关于下丘脑等脑区多功能核团中特定神经元的精确分子步骤及其活动的核心问题仍然存在。这一问题包括参与调控各种神经激素信号转导级联反应的分子组分的鉴定。细胞内 Ca²⁺ 浓度的升高在调节神经元敏感性方面起着重要作用，无论是在信号转导水平还是在突触部位均如此。

近年来，一些新工具被开发出来，用于在大脑中纷繁复杂的神经元中识别特定神经元，其原理是在特定启动子的调控下表达绿色荧光蛋白（GFP）。为了在空间和时间上同时监测GFP标记神经元中由刺激诱导的Ca²⁺反应，需要使用非绿色荧光的Ca²⁺指示剂染料。此外，共聚焦显微镜因其能够清晰显示组织切片中不同深度平面的单个神经元，并有效限制非焦平面的荧光干扰，已成为成像单个神经元的常用方法。已有研究将比率型Ca²⁺指示剂fura-2与GFP标记的神经元结合使用¹。然而，该染料需用紫外光（UV）激发，而紫外激光器成本较高，且紫外光在组织中的穿透深度有限，限制了其在许多实验室的应用。此外，GFP的荧光可能干扰fura-2的信号²。因此，我们决定采用一种红色荧光的Ca²⁺指示剂染料。fura-red具有极大的斯托克斯位移，使其可在单一激发波长下与GFP联合实现红色荧光的多色分析。我们此前在GFP标记的嗅觉神经元中联合使用fura-red已取得良好效果³。用于嗅觉组织切片的实验方案在下丘脑神经元中似乎同样有效⁴。基于fura-red的Ca²⁺成像也已成功应用于GFP标记的胰岛β细胞以及在HEK细胞中表达的GFP标记受体^5,6。fura-red的一个特殊性质是：当该指示剂与钙结合后，其在650 nm处的荧光强度会降低⁷。因此，Ca²⁺浓度较低的静息状态神经元具有相对较强的荧光强度。需要指出的是，目前已有其他红色Ca²⁺指示剂染料或正在开发中的新型染料，可能在不同类型的神经元或脑区中提供更优或改进的成像结果。

方案

1. 溶液与琼脂糖凝胶的制备

1. 根据表格使用双蒸水配制细胞外液。用碳氧混合气体（95% O₂ / 5% CO₂）充气约10分钟后，pH值约为7.3，渗透压为300 mOsm⁸。若需更高渗透压，可通过添加葡萄糖进行调节（1 mM相当于1 mOsm）。溶液需使用0.2 μm膜滤器过滤两次，以去除灰尘颗粒和可能的细菌污染。

试剂名称	缩写	分子量	浓度	公司	目录号 N°
氯化钠	NaCl	58.44 g/mol	120 mM	VWR	27810
碳酸氢钠	NaHCO₃3	84.01 g/mol	25 mM	默克	106329
氯化钾	KCl	74.55 g/mol	5 mM	默克	104936
BES*	C6H15一氧化氮5S	213.25 g/mol	5 mM	Sigma	14853
无水硫酸镁	MgSO₄4	120.37 g/mol	1 mM	Sigma	M7506
二水合氯化钙	CaCl₂·2H₂O2O	147.02 g/mol	1 mM	默克	102382
D(+)-葡萄糖一水合物	C6H12O8H2O	198.17 g/mol	10 mM	默克	108342

* N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸

2. 溶液保存于 4 °C，但在使用前应使用碳氧混合气体（95% O₂ / 5% CO₂）充气 10 分钟。
3. 此时，还需准备 1 cm³ 的琼脂凝胶块，用于在切片过程中稳定脑组织（见步骤 3）。首先，将 4%（w/v）琼脂（Sigma）溶于双蒸水中，加热至约 60 °C 使其溶解。将加热后的琼脂溶液倒入方形培养皿中，厚度为 1 cm。冷却凝固后，将 4% 琼脂凝胶切成 1 cm³ 的小块。这些琼脂块可在 4 °C 下保存长达 4 周。

2. 小鼠脑组织的解剖

请确保所有动物实验操作均遵循各机构动物福利委员会制定的指导原则。

1. 在处死动物之前，确保琼脂糖凝胶块已准备好可供使用。
2. 使用异氟烷（通过精密蒸发器将1-4%异氟烷溶于氧气中，持续约1分钟）对小鼠进行麻醉。必须注意防止缺氧，从而避免神经元损伤。异氟烷的缺点在于其成本较高以及使用精密蒸发器带来的操作复杂性。在开放系统中实施致死剂量的麻醉剂过量可作为替代方案，因为小鼠将被处死。但此时职业安全是一个严重问题，异氟烷必须直接排出室外，因此在开放系统中实施过量麻醉应于化学通风橱内进行。
3. 在通过检测后肢足部反射确认麻醉深度后，对小鼠实施断头处死。该足部或足掌夹捏反射测试方法为：用手指用力夹捏足掌或脚趾，观察动物是否出现回缩反应。若动物仍存在反射反应，则尚未达到外科手术麻醉水平，绝对不可进行处死操作。
4. 断头后，使用单刃剃须刀片沿矢状方向从额骨至枕外隆凸中央切开头皮。将头皮两部分先从尾侧中线处向头侧外侧方向剥离，再向下朝腹侧方向翻开（图1A-C）。
5. 使用小型弹簧剪在枕骨大孔处做两个侧向切口和一个头侧切口（切割方向见 图1C 中黑色虚线箭头所示）。用钝头镊子从中间尾侧向侧头侧方向小心剥离颅骨（见 图1C 中粗灰色箭头所示）。在较年老的动物中，于矢状缝处做一小切口有助于分离，且通常为避免损伤脑皮质层所必需。
6. 此时枕骨、顶间骨和顶骨应已分离。若仍有残留，应使用镊子小心去除硬脑膜，以防止下一步操作中损伤脑组织。
7. 移除鳞状骨、前筛骨及额骨孔（图1D）。
8. 现在可使用倒置的微型勺形刮勺轻轻取出脑组织，并切断脑神经（图1E）。

3. 小鼠脑冠状下丘脑切片

1. 将脑组织腹侧朝下放置在耐切割的表面上，使用单刃剃须刀片切除小脑（图2A）。此平整的切面将作为将脑组织固定于切片板上以进行冠状脑切片的基础。
2. 使用少量快速固化的高性能氰基丙烯酸酯瞬干胶（Loctite 406），将脑组织的切面粘附在切片机（Zeiss, Hyrax V50）的底板上（图1A）。此外，在脑组织腹侧（见图2B中的“v”）粘附一块1 cm³的琼脂凝胶块（参见1.5）至切片机（Zeiss, Hyrax V50）的底板上，以在切片过程中支撑并固定脑组织。注意不要使用过多胶水，以免胶水渗入脑组织与凝胶块之间，导致切片后难以分离组织切片。凝胶块应位于切片刀的对侧（图2B）。
3. 数秒后胶水完全干燥，将底板放入切片机的浴槽中，浴槽内盛有6 °C、充氧（95% O₂ / 5% CO₂）的细胞外溶液（参见1.1）。
4. 采用适当的低速切片参数，切出300 μm厚的切片。在本实验所用切片机上，我们设置频率为60 Hz，振幅为0.8 mm，切片速度为0.8 mm/s（图2C）。冠状脑切片可在每次切片后立即收集，也可保留在浴槽中直至整个脑组织切片完成。随后将冠状脑切片小心转移至盛有冷的充氧细胞外溶液的烧杯中。已有多种工具可用于转移切片（例如剪开的宽口塑料或玻璃巴斯德移液管，或宽头勺形刮铲）。具体使用何种工具取决于实验操作者的选择。最重要的是应妥善处理切片，以尽量减少损伤。
5. 若切片机可编程实现自动切片，此时可开始配制Ca²⁺指示剂染料负载溶液。否则，建议在脑切片完成前配制该溶液，以尽量减少神经元Ca²⁺反应检测的延迟，即应在开始步骤2之前完成配制。

4. Ca的制备²⁺ 指示剂染料加载液

在神经元加载过程中，一个关键步骤仍然是细胞的健康状况，这取决于解剖操作所造成的损伤程度以及解剖过程的速度。另一个重要步骤似乎是使用新鲜配制的Pluronic F-127溶液（见4.1）。建议在实验室内自行配制该溶液，不要使用供应商提供的预配溶液。根据温度、湿度以及Pluronic F-127溶液的保存时间，我们观察到在Ca²⁺加载过程中嗅觉神经元和脑神经元出现退化现象。

1. 通过将Pluronic F-127粉末（Sigma）加入二甲基亚砜（DMSO）溶液中，配制20%（w/v）的Pluronic F-127溶液。无需预先涡旋或混合，直接对该溶液进行超声处理。在2分钟的超声处理内，Pluronic F-127将完全溶解。每周新鲜配制100 μl的Pluronic F-127溶液。
2. 取一管50 μg的细胞渗透性fura-red/AM（Invitrogen；AM，乙酰氧基甲酯），加入5 μl 20% Pluronic F-127溶液，使用移液器枪头轻轻混匀。
3. 向混合物中加入45 μl细胞外溶液（见1.1），短暂涡旋。
4. 再加入额外的325 μl细胞外溶液，并对试管超声处理3分钟。
5. 超声处理后，加入1.156 ml充氧（95% O₂ / 5% CO₂）的细胞外溶液，得到最终的Ca²⁺ 指示剂染料负载溶液（含30 μM fura-red/AM、0.33% DMSO和0.065% Pluronic F-127）。将试管避光保存至使用前（见4.8）。
6. 将冠状脑切片转移至已加入充氧（95% O₂ / 5% CO₂）细胞外溶液的6孔细胞培养板（BD Falcon）中（每孔最多放置六片切片）。
7. 小心吸除6孔板各孔中的充氧细胞外溶液，注意避免损伤脑切片。
8. 直接向每个孔中加入750 μl的Ca²⁺指示剂染料负载溶液，确保脑切片完全浸没于含fura-red/AM的溶液中（浸入式负载）。
9. 将切片置于O₂/CO₂细胞培养孵育箱（O₂：23.5%；CO₂：5%）中，在37 °C条件下孵育45至60分钟。
10. 孵育结束后，用新鲜的充氧细胞外溶液替换Ca²⁺指示剂染料负载溶液，以防止细胞过度负载fura-red，并避免染料的螯合作用对Ca²⁺测量产生细微干扰。随后将切片继续保存于O₂/CO₂孵育箱中（孵育条件同前），切片在该条件下可维持活性达3-6小时。

5. 显微镜观察与分析

在本实验方案中，将在脑切片中同时测量用于标识目标细胞的绿色荧光蛋白（GFP）以及Ca²⁺指示剂染料的荧光强度。因此，共聚焦显微镜应配备合适的激光器、滤光片和两个光电倍增管，以分别采集两种发射信号。GFP和fura-red荧光强度的变化可使用488 nm的单一激发波长进行测量。荧光团的发射荧光可通过522/DF35 nm滤光片采集GFP信号，而fura-red信号则使用波长超过600 nm的长通滤光片进行采集。

1. 为了开始监测荧光信号中由刺激引起的改变（该信号可反映细胞内 Ca²⁺ 浓度的变化），需将一片负载 fura-red 的脑片转移至记录室（即 Warner Instruments RC-27 Open Bath Chamber），并将其安装在共聚焦显微镜系统上（图 3A,B）。
2. 使用网格状固定器（harp）（图 3C）将脑片固定，以防止灌流液流速导致脑片移动（灌流液为含氧的细胞外溶液；见步骤 1.1）。该网格状固定器（脑片夹持器）由平行排列的尼龙丝线（间距约 1 mm）张紧于 U 形银或铂金框架上制成。此步骤中灌流液的温度应至少为室温。若需更高温度，必须采取适当措施，防止显微镜镜头产生冷凝水，以及因显微镜部件位移导致焦平面漂移。
3. 用含氧的细胞外溶液对脑片进行 10 分钟的灌流，以清除细胞外多余的 Ca²⁺ 指示剂染料。灌流速度应调节至约 100 μl/s（有关合适灌流系统的建议，参见⁹）。
4. 通过显微镜在低倍镜下观察脑片，记录脑片的方向信息，并在脑片中定位目标区域，本实验中为下丘脑区域。
5. 切换至高倍镜，通过采集 GFP 图像并同时检测 fura-red 信号的荧光强度来定位目标细胞（图 4A-C）。靠近表面的细胞可能已受损或死亡，因此应选择深度大于 10 μm 的细胞进行成像。我们可稳定测量深度达 40–50 μm 的细胞，超过此深度后信号强度开始下降。需注意，静息状态下 Ca²⁺ 浓度较低的细胞其 fura-red 荧光强度相对较高，这种高强度荧光在此情况下并非细胞死亡的标志。GFP 信号可用于检测组织切片是否发生漂移或移动，也可作为细胞内 pH 变化的指示¹⁰。
6. 调节激光功率，使其既能检测 fura-red 荧光强度的变化，又能避免两种荧光染料发生光漂白。因此，应从最低激光功率开始，通过调节黑电平（偏移量）、探测器孔径、增益和激光中性密度滤光片来获得足够的信噪比。除激光功率外，GFP 信号也应进行相同调节。
7. 以 0.5 – 2 Hz 的速率开始采集图像，以同步获取 fura-red 和 GFP 信号。图像采集速率应根据预期的 Ca²⁺ 信号变化速率进行优化。电压依赖性 Ca²⁺ 尖峰可能比某些需要多种第二信使激活的信号转导级联反应引起的信号更快且更短暂。图像采集时长应根据实验目的合理设定。GFP 信号随时间的变化有助于判断脑片是否发生移动。
8. 在图像采集和实验过程中，所有扫描头设置必须保持恒定，以确保记录结果的可靠性并可用于比较。
9. 可使用多种数学分析软件对随时间变化的荧光信号进行分析，例如 ImageJ（NIH, Bethesda, MD；http://rsb.info.nih.gov/ij/）、Igor Pro（Wavemetrics）或 MatLab（The MathWorks）。通过圈选表达 GFP 的神经元胞体以定义感兴趣区域（ROI），即可利用 fura-red 荧光信号随时间的变化，对该同一区域的 Ca²⁺ 变化进行定量分析。

Ca²⁺ 信号可以以任意荧光单位表示，或以荧光强度相对变化值（ΔF）与基础荧光（F）的比值（ΔF/F）表示。当使用 fura-red 作为 Ca²⁺ 荧光指示剂时，细胞内 Ca²⁺ 浓度升高会导致信号出现负向偏转。为了便于结果解读，我们建议将 ΔF/F 值乘以 -1，从而获得正向的荧光信号，以直观反映 Ca²⁺ 浓度的上升（图 4C）。

为了在神经元之间比较结果，需对Ca²⁺信号的幅度和频率进行分析。²⁺ 信号通常会被分析。然而，某些Ca²⁺ 信号并不以固定周期或相似的振幅出现。某些信号可能受到细胞内随机过程的强烈影响。因此，为了量化Ca²⁺的总变化情况²⁺ 在特定细胞中，并实现对 Ca 的比较²⁺ 不同脑区神经元间反应的分析，采用曲线下面积（AUC）更为合适。该指标用于衡量Ca²⁺ 涵盖任何初始的 Ca²⁺ 瞬时相、第二相和持续升高的 Ca²⁺ 反应和振荡。在此情况下，应注意分析相同的时间段，以便在神经元之间进行比较。

6. 代表性结果

为了开始表征下丘脑中表达促性腺激素释放激素受体（GnRHR）的神经元，我们使用了转基因小鼠，这些小鼠在GnRHR表达神经元中经Cre介导切除后可表达GFP^4,11。在包括下丘脑在内的多个脑区均鉴定到了GFP荧光神经元。为了研究这些GnRHR神经元的生理特性，我们首先利用共聚焦显微镜在下丘脑脑片中记录Ca²⁺信号。首先，我们采用上述方案获取该小鼠的冠状脑切片。图1展示了摘除小鼠脑组织所需的工具、材料和操作步骤。冠状下丘脑脑片被切出（图2）后，按照方案第4步的操作进行负载。将适当区域的单个脑片置于记录室中，用网格固定（图3），然后使用共聚焦显微镜成像（见步骤5.1–5.9）。图4展示了一个示例，包含两个独立的冠状脑片，标识出单个GnRHR-τGFP细胞体，在用fura-red/AM负载脑片后静息状态下的荧光，以及合并后的共聚焦图像，表明GFP神经元已充分摄取fura-red，从而能够研究这些细胞中由刺激诱导的Ca²⁺信号。根据我们的方案，我们初步测试了GnRHR神经元在下丘脑不同区域是否利用相似的Ca²⁺信号来响应GnRH直接激活以进行刺激检测（图4E）。然而，这些信号的波形因刺激强度和脑区的不同而存在差异⁴。为了量化Ca²⁺反应动力学的变化，可计算曲线下面积（AUC）作为细胞内Ca²⁺升高的衡量指标（图4E）⁴。目前正在进行的研究旨在探讨Ca²⁺波和振荡的分子基础，其对动物性别和激素状态的依赖性，以及是否可被其他天然刺激所调节。

图 1. 切取小鼠脑组织所需的工具、材料及操作步骤。 A. 脑组织解剖所用的工具与材料：1，Loctite 406 瞬间胶；2，微型勺形刮匙；3，单刃剃须刀片；4，小型和中型弹簧剪；5，钝头镊子；6，剪刀；7，含琼脂凝胶块的培养皿；8，用于将脑组织固定于切片机上的底板。B–F. 展示本实验方案第 2 部分所述部分操作步骤的图像。B. 小鼠头部照片，显示头皮切口位置（红线），橙色箭头指示剥离皮肤时应牵拉的方向（参见步骤 2.4）。C. 剥离皮肤后的小鼠头部照片，显示颅骨结构（参见步骤 2.4）。剪刀剪开的方向以及用钝头镊子撬开颅骨的方向分别以黑色虚线箭头和灰色粗箭头标示。D. 去除各种骨性结构后的小鼠脑组织照片（参见步骤 2.5–2.7）。E. 通过脑神经仍与颅骨相连时取出脑组织的照片。F. 一个相对完整无损的小鼠脑组织照片。

图 2. 小鼠脑冠状切片的下丘脑切片过程。 A. 示意图显示单刃剃须刀片用于去除小脑的位置（见步骤 3.1）。B. 琼脂糖凝胶块相对于粘附在切片机底板上的脑组织的位置（见步骤 3.2）。C. 冠状脑切片的切割过程（注意此处脑组织和凝胶块相对于切片机刀片的位置；见步骤 3.4）。d，背侧；v，腹侧。

图 3. 脑切片在记录室中的放置。 A,B. Warner Instruments RC-27 开放式浴槽记录室的概览图（A）和更高倍放大图（B），可广泛接触冠状脑切片的下丘脑区域（见步骤 5.1）。C. U 形金属丝网，内含平行排列的尼龙线，用于将脑切片固定在记录室中的位置（见步骤 5.2）。

图4. Ca²⁺ 小鼠下丘脑脑切片中τGFP神经元的信号。 A-D. 小鼠脑冠状切片中GFP标记神经元的鉴定及fura-red荧光的同时采集。A. 冠状脑切片的共聚焦图像，用于鉴定GnRHR-τGFP神经元（绿色）。B. 脑切片负载fura-red/AM后，A所示脑区呈现出相对均匀的荧光信号（红色）。C. 叠加图像，显示A中所示神经元负载了Ca²⁺ 指示剂染料（淡黄色）。GFP神经元胞体的边界以虚线白线标示，而非GFP胞体的两个示例（箭头）以灰色线条标示。D. 一个GFP和非GFP神经元的示例，其红色荧光强度高于背景。E. 胞体刺激诱导的Ca²⁺ 不同下丘脑脑区（Pe，室旁核；DM，背内侧下丘脑；Arc，弓状核）中单个GFP标记神经元的反应。曲线下面积（AUC）以红色区域表示。不同的Ca²⁺ 可利用曲线下面积（AUC）作为细胞内钙离子总变化量的估算指标，比较来自下丘脑不同核团的GnRHR表达神经元之间的信号差异²⁺ 在相同时间段内，特定细胞中的情况。F. 示意图和图解，显示了在A-E中分析的GFP标记神经元的位置。 上图：包含下丘脑脑区的冠状脑切片位置（红线）。 中面板和下面板：脑切片示意图（中段）及其红色方框区域的放大图（下图) 红点表示图 E 中 Pe、DM 和 Arc 区记录的 GFP 标记神经元的大致位置；下图示意图中的黑色区域：3^rd 脑室。下方两个图示改编自 Paxinos 和 Franklin¹²左下角数字表示距前囟（Bregma）的距离（mm）。

讨论

神经科学中的一个核心问题是理解大脑如何处理社会信息。社会识别所需的主要信息来源由嗅觉或信息素信号编码。这些信号通过鼻腔内的神经元群体检测，并在大脑中（尤其是下丘脑）被识别，这在许多社会行为过程中发挥关键作用，并影响激素及其他神经内分泌因子^13-16。在如下丘脑等包含多种功能核团和大量神经元的脑区中，分析神经元反应的一个主要障碍在于如何识别出特定的目标神经元。

已开发出许多转基因小鼠品系，其中主要利用GFP来标记神经元。然而，GFP的荧光特性会干扰使用如fluo-3和fluo-4等Ca²⁺指示剂染料进行的测量¹⁷。因此，我们开始采用红移型Ca²⁺指示剂染料（如fura-red）来研究GFP标记的神经元^3,4。此前，基于fura-red的Ca²⁺成像已与表达GFP的胰岛β细胞以及在HEK细胞中表达GFP标记受体的研究相结合^5,6。与fura-2类似，已有报道指出fura-red与GFP之间存在一定的串扰²。然而...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Sigma	A1296
Fura-red/AM	Invitrogen	F-3021
Pluronic F-127	Sigma	P2443
二甲基亚砜	Fisher Scientific	BP231
振动切片机 Hyrax V 50	Zeiss	9770170
切片机冷却装置 CU 65（适用于 Hyrax V 50）	Zeiss	9920120
O2/CO2 培养箱，CB210-UL	Binder	0019389
超级胶水，Loctite 406TM	Henckel	142580
双头刮勺，勺形	Bochem	3182
微型刮勺，勺形	Bochem	3344
弹簧剪刀，Moria-Vannas-Wolff，7 mm 刀片	Fine Science Tools	15370-52
弹簧剪刀，Vannas，3 mm 刀片	Fine Science Tools	15000-00
Wagner 剪刀	Fine Science Tools	14071-12
医用镊子，Dumont 7b	Fine Science Tools	11270-20
大型矩形开放式浴槽（RC-27）	Warner Instruments	64-0238
共聚焦显微镜 BioRad Radiance 2100	Zeiss	n.a.