细胞特异性分析 拟南芥 使用荧光激活细胞分选法分离叶片细胞

摘要

一种用于制备的方法 拟南芥 适用于荧光激活细胞分选（FACS）的叶片原生质体，可用于特定细胞群体的研究。该方法适用于任何 拟南芥 在部分细胞中表达GFP的细胞系。

摘要

叶片原基启动后，叶片的生物量积累主要受细胞增殖和细胞扩展的调控¹。然而，拟南芥（Arabidopsis）的叶片是一种复杂的器官，由多种不同类型的细胞和多个结构组成。同时，正在生长的叶片中包含处于不同发育阶段的细胞，其中距离叶柄最远的细胞最先停止扩展并进入衰老阶段¹。因此，在任一时刻，叶片内的不同细胞可能正在进行分裂、伸长或分化；处于活跃、应激或死亡状态；或仅在特定细胞类型的亚群中对刺激作出响应。这使得对叶片进行基因组学研究具有挑战性：例如，在分析整片叶片的表达数据时，来自不同细胞响应区域或细胞类型中独立遗传调控网络的信号会相互混杂，从而导致生成不准确的表达谱。

为解决这一问题，已有多种方法被提出，可用于研究特定细胞的基因表达。这些方法包括激光显微切割（LCM）²，利用表达GFP的植物材料制备原生质体并进行后续的荧光激活细胞分选（FACS）^3,4，近期报道的用于细胞核沉淀的INTACT系统⁵，以及多聚核糖体的免疫沉淀技术⁶。

FACS 已成功应用于多项研究，包括证明细胞身份及与根尖的距离对大量基因的表达谱具有显著影响^3,7利用GFP品系的流式细胞术（FACS）也已用于揭示根部氮响应及侧根发育过程中的细胞特异性转录调控。⁸盐胁迫⁹ 根中的生长素分布¹⁰ 并创建基因表达图谱 拟南芥 茎尖分生组织¹¹尽管FACS此前已被用于分选 拟南芥 基于自发荧光的叶片来源原生质体^12,13，迄今为止在FACS上的应用 拟南芥 在叶片中表达GFP的株系非常有限⁴在以下方案中，我们描述了一种获取 拟南芥 适用于FACS的叶肉原生质体，同时尽量减少原生质体制备过程的影响。我们以KC464为例演示该方法 拟南芥 在近轴表皮中表达GFP的品系¹⁴，KC274品系，其在维管组织中表达GFP¹⁴ 和 TP382 拟南芥 细胞系，在保卫细胞中表达与核定位信号相连的双GFP构建体（数据未显示； 图2我们目前正在利用该方法研究发育和胁迫过程中细胞类型特异性的基因表达，以及不同衰老阶段的异质性细胞群体。

方案

1. 原生质体的制备

1. 用剃刀将叶片材料切割成1 mm宽的条状（图1）。对于包含多个叶片的样品，最多可将15片叶片叠放后一起切割。
2. 立即将叶条转移至一个直径9 cm的圆形培养皿中，培养皿内含20 ml 溶液A（400 mM 甘露醇，20 mM MES水合物，20 mM KCl，10 mM CaCl₂，2 mM MgCl₂，0.1% BSA 和 2.5 mM β-巯基乙醇，pH 5.7），并加入原生质体酶解酶（1.2% 纤维素酶R-10，0.6% 纤维素酶RS 和 0.4% 离析酶R-10）以及RNase和转录抑制剂（1×ProtectRNA 和 10 μg/ml 放线菌素D）；轻轻分散叶条，并进行两次、每次5分钟的真空渗透。
3. 将培养皿置于摇床上，设置转速为90 rpm，在室温下酶解3–4小时。
   1. 在孵育过程中，应每隔30分钟使用一对平头镊子轻轻将叶条彼此分离。
4. 将一个70 μm细胞滤网（Fisher Scientific）放入50 ml离心管中，轻轻将酶解液过滤通过滤网。叶条将被滤网截留，而原生质体则通过滤网进入管中。
5. 用4 ml 溶液A冲洗滤网上的叶条，并轻轻通过同一滤网过滤。
6. 将原生质体转移至圆底离心管中，在300 × g条件下离心5分钟，以沉淀原生质体。
7. 小心吸除尽可能多的上清液，注意不要扰动原生质体沉淀。
8. 用5 ml 溶液A重悬原生质体，并在300 × g条件下离心5分钟，随后去除上清液。
9. 使用巴斯德移液管或截头的P1000枪头，将原生质体重悬于适当体积的溶液A中。

2. 叶片原生质体的流式细胞术分析

1. 分选前立即使用未剪切的P1000枪头重悬原生质体，以防止原生质体聚集。
2. 将原生质体通过50 μm滤网（BD Biosciences）转移至分选管中，并根据需要适当稀释，以避免堵塞细胞分选仪的喷嘴。使用100 μm喷嘴进行原生质体分选，压力设置为20 psi（鞘流）和21–21.5 psi（样品），频率为39.2 kHz，事件速率为<4000（这些参数在BD Influx细胞分选仪（BD Biosciences）上为最优设置；其他细胞分选设备可能需要调整这些参数）。
3. 使用488 nm氩激光器识别GFP阳性原生质体，并以580/30带通滤光片（橙色）对530/40带通滤光片（绿色）作图。GFP阳性原生质体位于高530/低580群体中，非GFP原生质体位于低530/低580群体中，而死亡或濒死的原生质体及碎片则位于高580群体中（图2）。
   1. 当分选用于RNA提取的原生质体时，应将原生质体直接分选至至少4倍体积的含有还原剂（例如 β-巯基乙醇）的裂解缓冲液中。此外，单个样品的分选时间应限制在20–30分钟内，且每次最多同时处理两到三个样品。
   2. 为观察分选后的原生质体，应将原生质体直接分选至至少8倍体积的溶液A中，随后通过离心浓缩原生质体。

3. 代表性结果

本方案描述了一种从拟南芥（Arabidopsis）叶片中制备原生质体的方法，所获得的原生质体用于荧光激活细胞分选（图1）。在核糖核酸酶（RNase）和转录抑制剂存在条件下生成原生质体，可防止细胞启动转录应答。然而，这种方法会导致大量原生质体死亡或处于濒死状态，这些细胞具有显著的自发荧光。因此，在对采用本方法制备的原生质体进行分选时，通常会在用于分选的580 nm与530 nm荧光图谱中观察到多个明显不同的细胞群。此类情况示例以及本方案所用的分选门控设置如图3所示。

可将原生质体分选至8份溶液A中，并收集用于成像，以验证富集效果。图2G展示了使用TP382品系的示例，该品系在保卫细胞中表达GFP。

使用该方法获得的产量示例（扩增前和扩增后）见表1。所获得的量足以用于Ovation Pico WTA系统（500 pg-50 ng）进行扩增，因此可进一步通过qPCR（图4）、下一代测序或微阵列进行分析。

图 1. 实验的整体工作流程。1) 从表达 GFP 的 Arabidopsis 品系中采集目标叶片。2) 快速切成约 1 mm 宽的条状，并立即转移至原生质体分离溶液中进行真空渗透。3) 孵育 3–4 小时。4) 用 70 μm 滤网轻轻过滤原生质体溶液，转移至圆底离心管中，通过离心收集原生质体沉淀。5) 分选前立即重悬原生质体，并通过 50 μm 滤网转移至分选管中。6) 分选具有活性的 GFP 阳性与 GFP 阴性原生质体。7) 此时可对原生质体进行直观分析，或采用 qPCR、下一代测序或微阵列等技术进行分析。

图 2. 本研究所使用的 KC464、KC274 和 TP382 菌株。A) KC464 叶片横切面，显示背轴表皮中 GFP 的表达。B) 来自 KC464 叶片的原生质体。C) KC274 叶片横切面，显示维管组织中 GFP 的表达。D) 来自 KC274 叶片的原生质体。E) TP382 叶片显示保卫细胞中 GFP 的表达。F) 来自 TP382 叶片的原生质体。G) 在叶片细胞复杂背景下，通过 FACS 富集表达 GFP 的保卫细胞的示例，显示来自 TP382 叶片原生质体中高 530/低 580 群体的含 GFP 原生质体。A–F：共聚焦显微镜图像；G：荧光显微镜图像。图像中的比例尺为 50 μm。

图 3. 来自BD Influx细胞分选仪580/30 nm（橙色）与530/40 nm（绿色）带通滤光片输出的典型FACS获取点图。所示分选门为分选过程中常用的设置。A) 未添加抑制剂条件下制备的Col-4叶片原生质体点图，显示单一的低530/低580荧光群体。B) 在抑制剂存在下制备的野生型Col-4叶片原生质体点图，显示由于应激及抑制剂着色导致580荧光信号发生偏移。C-E) 分别为在抑制剂存在下制备的KC74、KC464和TP382品系叶片原生质体点图，显示含有GFP的细胞群位于高530/低580荧光区域。图中给出了GFP（高530/低580）细胞群所占事件百分比。 点击此处查看大图。

图4. 如图3所示代表性门控群体组分中的GFP表达。每种组分类型获得两个生物学重复，使用Ovation Pico WTA系统扩增后，采用GFP特异性引物进行qPCR分析（表2）。图中显示的数值为最高值（红色）、最低值（绿色）和平均相对值。本实验中，“高580”群体进一步分为两部分：低530/低580和高530/低580，这两组仅使用了一个生物学重复，因此仅显示单个数值。所有样品均以ACT2（At3g18780）作为内参。Leaf：整片叶片；Unsorted：未分选的原生质体；GFP1：高530/低580，Rest1：低530/低580；GFP2：高530/高580，Rest2：低530/高580，具体定义见图3及插图说明。该结果验证了分选组分中GFP细胞含量的光学评估结果（例如 图2G）。 点击此处查看高清大图。

样品	叶片数量	细胞数量	RNA 产量 (ng)	RNA 产量 (扩增后; ng)
完整叶片 A 完整叶片 B	1 1	- -	8001 10525	4623*** 4572***
未分选原生质体 A 未分选原生质体 B	5 5	- -	2433 2625	1152*** 3321***
GFP1 A Rest1 A	15	6039 (0.39%*) 55389 (6.40%*)	-** -**	861 489
GFP1 B Rest1 B	15	10783 (0.63%*) 57040 (7.49%*)	-** -**	537 420
GFP2 Rest2	15	18337 (1.49%*) 62405 (73.49%*)	-** -**	360 411

表1. 使用FACS收集的样品，并通过qPCR分析以确定哪个组分含有活的表达GFP的原生质体。本表还列出了使用Ovation Pico WTA系统（NuGen）扩增前后总RNA的产量（单位：ng）。GFP1、GFP2、Rest1和Rest2组分如图4插图所示。*括号中列出的数值为该组分细胞数占总细胞分选运行数的百分比。由于Rest组分收集到的细胞数量远多于GFP组分，因此其FACS分选运行提前终止，各样品之间的这些百分比数值不可相互比较。**根据制造商的操作说明，扩增反应输入量为50 ng。

引物	序列
mGFP5-ER.fw	GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA
mGFP5-ER.rv	TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT
ACT2.fw	GCCATCCAAGCTGTTCTCTC
ACT2.rv	GCCATCCAAGCTGTTCTCTC

表2. qPCR 引物。

讨论

我们描述了一种方法，该方法可利用叶片中表达GFP的拟南芥（Arabidopsis）植株进行原生质体的制备，并通过FACS进行后续的细胞分选。该方法能够获得足量的RNA，可用于扩增，并进一步进行qPCR或微阵列分析。经分选的组分中富含含GFP的细胞，qPCR结果已证实了这一点（图2）。

为了获得高产量的活原生质体，在实验操作的初始步骤中必须迅速进行，直至叶片条段被含有抑制剂的原生质体溶液真空渗透完成。此外，在制备1 mm叶片条段时，非常关键的是应通过切片或切割的方式处理叶片，而不是“剁碎”或压碎，因为后者会造成过度损伤，从而降低原生质体的产量。

本方法与其他已发表方法的一个关键区别在于使用了RNase抑制剂和转录抑制剂。大多数方法是针对拟南芥（Arabidopsis）根部开发的，其原生质体更容易制备。然而，在处理叶片组织时（除叶肉细胞外），有必要延长原生质体制备时间。因此，加入这些抑制剂至关重要，可防止因原生质体制备处理本身引起的基因表达变化（数据未显示）。然而，抑制剂的存在会导致原生质体无法启动转录响应，无论是基因的激活还是抑制，这可能会使原生质体更加脆弱，因为这会导致其失去应对原生质体制备过程中所受应激所需的可塑性。

我们已成功地将此处描述的方法应用于多种表达GFP的Arabidopsis品系。重要的是，我们已将该方法用于GFP在细胞核中强表达，或以非定位性/弥散性方式在细胞质中弱表达的GFP品系，例如本研究中使用的KC464和KC274品系。这两类品系均适用于该方法，并可获得高度富集的表达GFP的原生质体（图2和图3）。该方法可轻松适配于其他荧光染料，但所选荧光染料的荧光信号必须与死亡或濒死细胞的自发荧光显著不同，以确保能够筛选出活细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
纤维素酶 R-10	Melford	C8001
纤维素酶 RS	Melford	C8003
离析酶 R-10	Melford	M8002
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A3912
ProtectRNA	Sigma-Aldrich	R7397
放线菌素 D	Sigma-Aldrich	A1410
70 μm 细胞筛	Fisher	FB35181
50 μm 菲尔康杯型滤器	BD Biosciences	340630