测量抗体乳鼠心肌细胞对细胞功能的影响

摘要

所提出的方法提供了一种方法扩张型心肌病的患者血浆中的检测功能有效的心性自体抗体，不论特异性抗原，通过分析隔离病人免疫球蛋白对大鼠离体心肌细胞的缩短及细胞内钙瞬变的影响。

摘要

扩张型心肌病（DCM）是在年轻的成年人¹心脏衰竭的主要原因之一。虽然遗传倾向和博览会的有毒物质被称为的起源DCM，约三分之一的患者对本病的原因，在很大程度上仍然不清楚。在这些患者中有相当多的，已经对心脏表位抗体检测和怀疑本病的发生和发展^2,3中发挥了举足轻重的作用。心脏自身抗体的重要性，强调消除自身抗体的免疫吸附^3-5后，在DCM患者血流动力学的改善。已经被确定各种特异性抗原^2,3和针对这些目标的抗体，可以通过免疫测定法检测。然而，这些方法不能区分刺激（及因此功能有效）和阻断自身抗体。有越来越多的evidenCE，这种区别是非常重要的^6,7。它也可以被假定，若干心性抗体的目标仍然是身份不明，因此不能检测由免疫测定法。因此，我们建立了功能活性的心性的抗体，独立的各自的抗原的检测方法。用于该方法的背景是通常观察到的功能区域心脏蛋白在哺乳动物^8,9之间的高同源性。这表明，心脏针对人的抗原的抗体与非人类的靶细胞，它允许测试从DCM患者对成年大鼠心肌细胞的IgG交叉反应。我们的方法包括3个步骤:第一，IgG抗体是从病人的血浆，使用琼脂糖凝胶偶联的抗-IgG抗体，从免疫吸附的列（德国，Teterow PlasmaSelect）得到分离。二，成人的心肌细胞分离胶原酶灌注在Langendorff灌流装置，使用AP议定修改以前的作品^10,11。将得到的心肌细胞的附着层粘连蛋白涂层的腔coverglasses和染色的Fura-2，钙的选择性荧光染料，该染料可以容易地进入细胞，观察细胞内钙（Ca ^{2 +）}含量^12。在最后一步中，病人的IgG的效果上的细胞缩短和Ca ^{2 +}瞬变字段刺激心肌在线监视使用市售的细胞钙和收缩监测系统（IonOptix，弥尔顿，MA，USA）连接到一个标准的逆荧光显微镜。

方案

1。抗体从患者标本分离

1. 准备迷你免疫吸附柱填充3毫升2毫升病人EDTA血浆抗IgG琼脂糖每到一个空的Econo豆列。 IgG抗体隔离需要至少2毫升的病人血浆中。
2. 将抗-IgG琼脂糖凝胶的顶部上的过滤器，剖开列的前端下部，并按下的过滤器可达到约1滴/秒的流速。让保存液用完的列。
3. 洗柱用3倍体积的0.9％NaCl中，每体积的血浆。
4. 移液器的血浆列。当等离子体已完全沉浸在抗-IgG琼脂糖凝胶，用相同体积0.9％NaCl溶液洗。
5. 吸取1，pH值为2.8的0.2M甘氨酸盐酸血浆体积上的列，并让沉浸到琼脂糖。添加另一个卷甘氨酸盐酸列上。收集的流量，通过在一个15毫升的试管中，将pH调节至7.3，用0.5M的Tris-HCl，pH值8.0。
6. 若要重新列，用3个血浆容量甘氨酸盐酸。用2倍体积的0.9％NaCl的最终洗涤后，这个字段可以被用于下一个血浆样品。可替代地，列可以填充与保存溶液，并存储在4 - 8℃下进行最多达4周。
7. 对于心肌细胞上使用，所收集的IgG级分透析实验缓冲液（EB）。对于制备的EB，添加0.6毫摩尔MgCl _2，117 mM氯化钠，2.8 mM KCl中，1.2毫摩尔KH ₂ PO _4，1.2毫摩尔的CaCl _2，10mM HEPES和20mM葡萄糖的1升蒸馏水，在磁力搅拌器上，并调整pH值7.3。
....

结果

两个例子为测量在该领域的蜂窝性收缩力刺激成人的心肌细胞（ 图2），使用下面给出的心肌细胞的Ca ^{2 +}和收缩记录系统， 图3给出了一个控制测量的印象，而在图4中的效果cardiodepressive抗体的病人，在DCM中所示。

在这两个例子中，初始细胞缩短和Ca ^{2 +}瞬态期间灌流与EB表现出非常明确和一贯的山峰，这是一个先决条件的分析。我们从经验中知道，细胞表现出初始H的BL％的峰值为7 - 14％，西装最适合我们的应用程序，而较低或较高的初始收缩的心肌细胞往往容易出现无端的变化，细胞收缩。应用程序的控制抗体后， 即 IgG的孤立性收缩力的心肌细胞保持健康对照组，ün变更在整个测量（ 图3A）。相反，灌流含有cardiodepressive抗体与IgG其次是由细胞缩短（ 图4A），减少了伴随通过还原的Ca ^{2 +}瞬变通常是不太.......

讨论

所提出的方法提供了一种合适的方法来检测自身抗体在DCM来源不明的患者的心脏功能有效。在与其他方法相比， 例如:对β1-肾上腺素能受体的功能活性的抗体的检测由他们影响cAMP水平^6，我们的方法是独立于一个特定的表位。当然也有其他的文献中描述的表位独立分析， 即计算跳动的乳鼠心肌细胞^13，在成人的心肌细胞钙电流测量膜片钳技术或孤立的浦肯野纤维的收缩率。优势，这些方法在这里介绍的是，该法耗时更少，并提供了增强的客观性由于标准化协议。此外，它允许在同一时间对收缩力和细胞内钙瞬变的检测的影响。

类似OT她在体外实验中，所提出的方法得到的结果可能会被质疑的人工条件下的细胞。新生大鼠心肌细胞报告附加优先与micropillars之间的距离为30微米或更小的比在平坦衬底上。连接到后者时，细胞被发现，显示肌动蛋白应力纤维和无序的肌纤维^15。然而，这里描述的收缩测定应力纤维的潜在影响可能是微不足道的，因为成年心肌只培养了很短的时间周期高达至6小时，这可能会降低形成的这样的纤维和细胞缩.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
的试剂/设备名称	公司	目录编号	评论
Immunosorba保护解决方案	费森尤斯医疗保健	903609211
型胶原酶2	电池系统	LS004176
BSA，无脂肪酸	Sigma-Aldrich公司	A6003
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich公司	L2020
的Fura-2 AM	Sigma-Aldrich公司	F0888	在DMSO中的1毫克/毫升
的Econo PAC色谱柱	BioRad公司	732-1010
SPECTRA / POR生物纤维素酯透析膜上Ë	Spectrumlabs	131417
4井腔室盖玻片	Nunc公司	155383
心肌细胞的钙和收缩录音系统	IonOptix
IonWizard 6.0分析软件	IonOptix