本方法通过分析分离自患者血浆的免疫球蛋白对分离大鼠心肌细胞细胞缩短及细胞内钙瞬变的影响，提供了一种检测扩张型心肌病患者血浆中功能性有效向心性自身抗体的方法，且该方法不依赖于特定抗原。
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摘要
摘要
扩张型心肌病（DCM）是年轻成人发生心力衰竭的主要病因之一1。尽管已知约三分之一患者的发病与遗传倾向或接触毒性物质有关，但大多数DCM病例的病因仍不明确。在相当一部分患者中，已检测到针对心脏表位的自身抗体，并怀疑其在疾病的发生和发展中起关键作用2,3。通过免疫吸附清除自身抗体后，DCM患者出现血流动力学改善，进一步突显了心脏自身抗体的重要性3-5。目前已鉴定出多种特异性抗原2,3，可通过免疫测定法检测针对这些靶点的抗体。然而，这些检测方法无法区分具有刺激作用（因而具有功能活性）的自身抗体与阻断性自身抗体。越来越多的证据表明，这种区分至关重要6,7。此外，可以推测，许多具有心脏趋向性的抗体其靶抗原尚未被识别，因此无法通过免疫测定法检测到。因此，我们建立了一种不依赖于特定抗原的功能性心脏趋向性抗体检测方法。该方法的理论基础在于哺乳动物之间心脏蛋白功能区域通常具有高度同源性8,9，提示针对人类抗原的心脏抗体可与非人类靶细胞发生交叉反应，从而允许将DCM患者来源的IgG在成年大鼠心肌细胞上进行检测。本方法包括三个步骤：首先，利用免疫吸附柱（PlasmaSelect，Teterow，德国）中获得的偶联在琼脂糖上的抗IgG抗体，从患者血浆中分离IgG；其次，采用经改良的既往方案10,11，在Langendorff灌流装置中通过胶原酶灌流法分离成年心肌细胞；所得心肌细胞被贴附于层粘连蛋白包被的腔室盖玻片上，并用Fura-2染色，后者是一种钙离子选择性荧光染料，易于进入细胞，可用于观察细胞内钙离子（Ca2+）浓度变化12；最后，使用商用的心肌细胞钙离子及收缩功能监测系统（IonOptix，美国马萨诸塞州米尔顿），连接标准倒置荧光显微镜，实时监测患者IgG对电场刺激心肌细胞的细胞缩短程度及Ca2+瞬变的影响。
方案
1. 从患者样本中分离 IgG
- 通过将每2 ml患者EDTA血浆加入3 ml抗IgG Sepharose，填充至空的Econo Pac层析柱中，制备微型免疫吸附柱。IgG分离至少需要2 ml患者血浆。
- 在抗IgG Sepharose上方放置一个滤膜，剪开层析柱底部尖端，并压紧滤膜，使流速达到约1滴/秒。让保存液流尽。
- 用每体积血浆3倍体积的0.9% NaCl洗涤层析柱。
- 将血浆上样至层析柱。当血浆完全渗入抗IgG Sepharose后，用相同体积的0.9% NaCl洗涤。
- 向层析柱中加入相当于一倍血浆体积的0.2 M甘氨酸盐酸缓冲液（pH 2.8），使其渗入Sepharose。再加入另一份体积的甘氨酸盐酸缓冲液。收集流出液至15 ml离心管中，并用0.5 M Tris-HCl（pH 8.0）调节pH至7.3。
- 为再生层析柱，用3倍血浆体积的甘氨酸盐酸缓冲液洗涤。最后用2倍体积的0.9% NaCl洗涤后，该柱可用于下一个血浆样本。或者，可将层析柱充满保存液，于4–8 °C保存，最多可使用4周。
- 若用于心肌细胞实验，所收集的IgG组分需对实验缓冲液（EB）进行透析。配制EB时，在磁力搅拌器上向1 L蒸馏水中加入117 mM NaCl、2.8 mM KCl、0.6 mM MgCl2、1.2 mM KH2PO4、1.2 mM CaCl2、10 mM HEPES和20 mM葡萄糖，并调节pH至7.3。
- 将IgG组分装入截留分子量为100 kDa的纤维素酯透析袋中，放入1 L EB中，在4 °C下用磁力搅拌器缓慢搅拌。8小时后，将透析袋转移至3 L新鲜EB中，继续在4 °C透析20小时。
- 透析完成后，将样品置于57 °C水浴中加热30分钟，以灭活补体成分。测定总IgG浓度，并分装成每份含330 μg IgG的等分试样。在将样品加入心肌细胞进行检测时（步骤4.3），用EB将每份试样补足至1 ml。未稀释的分装样品可于-20 °C保存，直至后续使用。
2. 大鼠心肌细胞的分离
- 配制无 Ca2+ 分离缓冲液（IB）时，将 110 mM NaCl、2.6 mM KCl、1.2 mM MgSO4、1.2 mM KH2PO4、20 mM HEPES 和 11 mM 葡萄糖加入 1 L 蒸馏水中，使用磁力搅拌器搅拌溶解。室温下调节 pH 至 7.4，并通过 0.2 μm 瓶顶滤器过滤以灭菌。
- 将 80 ml IB 加入恒温 Langendorff 灌流系统的上部储液槽中。调节恒温装置，使缓冲液温度维持在 37 °C，并用 95% O2/5% CO2 气体饱和 30 分钟。
- 称取约 10,000 - 12,000 U 的 II 型胶原酶、175 mg 无脂肪酸 BSA，溶于含有 22.5 μl 100 mM CaCl2 储存液的 20 ml IB 中。控制上部储液槽中分离缓冲液的 pH，必要时进行调节。
- 使用 375 μg/kg 体重剂量的硫喷妥钠对一只 175 - 200 g 的 Wistar 大鼠进行麻醉，并在硫喷妥钠溶液中加入 2500 IU 肝素。开胸后，小心完整地切除带有主动脉弓的心脏，迅速转移至冰冻的 0.9% NaCl 溶液中。清除心脏上的血液及周围组织，再转移至新鲜的 0.9% NaCl 溶液中。暴露主动脉，打开 Langendorff 系统的流速调节器，使液滴速度达到 2-3 滴/秒，将心脏连接至灌流插管。
- 以每秒 1 滴的流速灌流心脏最多 3 分钟，以冲洗残留血液。启动 Langendorff 系统中的 IB 循环。从上部储液槽中取出 20 ml 缓冲液，加入胶原酶溶液，并补充缓冲液至总体积为 80 ml。继续循环胶原酶溶液 27 分钟。应定期监测流速，并通过流速调节器维持在每秒 1 滴。
- 将心脏从插管上取下，去除心房和主动脉，将心室组织剪成小块。让胶原酶溶液流入下部储液槽，将体积浓缩至最多 40 ml，并在持续通入 95% O2/5% CO2 的条件下进一步消化剪碎的心室组织 10 - 15 分钟。随后，将细胞悬液通过孔径为 200 μm 的筛网过滤至 50 ml 离心管中。
- 分三步恢复细胞中的 Ca2+ 含量：在室温下以 43 × g 离心 2 分钟，弃上清，将细胞重悬于含 200 μM CaCl2 的 10 ml IB 中；再次离心后，将细胞重悬于含 500 μM CaCl2 的 10 ml IB 中；最后一次离心后，将心肌细胞重悬于无菌过滤的 EB 缓冲液中（见 1.8），细胞密度调整为 50,000 个细胞/ml。
3. 心肌细胞的 Fura-2 染色
- 用每孔 10 μg 的层粘连蛋白包被 4 孔板腔室盖玻片，待其完全干燥。
- 使用剪去尖端的移液枪头将 1 ml 心肌细胞悬液加入每个孔中，在室温下孵育 1 小时，使细胞贴壁。
- 将 10 μl 浓度为 1 mg/ml 的 Fura-2 AM 储存液溶于 5 ml EB 中进行稀释。染色液需避光保存。
- 从盖玻片上移除缓冲液和未贴壁细胞，每孔加入 0.5 ml 染色液，于轻度振荡条件下孵育 10 分钟。随后移除染色液，用 1 ml EB 洗涤细胞一次，最后每孔加入 0.5 ml EB。染色过程中应避免直接光照，染色后的细胞始终需避光保存。
4. 细胞缩短和Ca2+瞬变的记录
- 将带孔的盖玻片置于连接心肌细胞钙离子与收缩力记录系统的倒置荧光显微镜上。在第一个孔中放置自制电极，配备进出液管。以1 ml/min的速度向心肌细胞灌流EB，并启动电刺激（20 V，1 Hz，持续时间5 msec）。让细胞适应刺激约2分钟。
- 选择一个完整、呈杆状、横纹清晰且持续收缩的心肌细胞。将细胞置于视野中央，并打开相机通道。通过旋转细胞夹持装置并移动显微镜载物台，使细胞在视频区域内呈水平方向排列。
- 调整视频区域的边缘检测控制元件（图2），打开荧光通道，记录10至15次收缩，以获取初始的细胞缩短和Ca2+ 瞬时的
- 关闭显微镜光源通道，以避免荧光染料发生漂白。使用三通阀将灌流液从EB切换至样品旁路，并用1 ml患者IgG对心肌细胞进行灌流。在气泡到达培养孔之前停止泵送。
- 打开光通道，记录另外10至15次收缩，以获得细胞的急性反应。暂停记录，再次关闭光通道。分别在2分钟和5分钟后重复记录。
- 取出小室中的电极，用EB彻底清洗管路，然后继续处理腔室盖玻片中的下一个小室。
- 分析细胞缩短与Ca2+ 使用 IonWizard 软件，分别通过“Edge-Length/Length”和“fura 2-Numeric subtracted/Ratio”窗口进行瞬时变化分析。计算细胞初始缩短和 Ca 的百分比变化2+ 急性、2分钟和5分钟反应中相对于基线的峰高瞬变值（bl%peak h）。
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结果
以下提供了使用心肌细胞Ca2+和收缩力记录系统，在电场刺激的成年心肌细胞中测量细胞正性肌力作用的两个示例（图2）。图3展示了一次对照测量的结果，而图4则显示了一位扩张型心肌病（DCM）患者的心脏抑制性抗体的作用效果。
在两个示例中，初始的细胞缩短与 Ca2+ 在用EB灌流期间表现出短暂反应的细胞呈现出清晰且稳定的峰，这是进行分析的前提条件。根据经验，我们了解到初始收缩幅度峰值在7%至14%范围内的细胞最适合我们的应用，而初始收缩力过低或过高的心肌细胞往往容易出现自发性的细胞缩短变化。在施加对照IgG后， 即 健康对照受试者分离的IgG在整个测量过程中对心肌细胞的正性肌力作用保持不变图3A）。相比之下，用含有具有心肌抑制作用抗体的IgG进行灌流后，细胞缩短程度会降低（图 4A），伴随钙的减少2+ 瞬时现象，通常较不明显（
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讨论
所介绍的方法为检测病因不明的扩张型心肌病（DCM）患者体内具有功能活性的心脏自身抗体提供了一种适宜的途径。与其他方法相比， 例如 通过cAMP水平变化检测抗β1-肾上腺素受体的功能性活性抗体6，我们的方法不依赖于特定表位。当然，文献中也描述了其他一些不依赖表位的检测方法， 即 计数新生心肌细胞的搏动频率13，通过膜片钳技术测量成年心肌细胞的钙电流或分离的浦肯野纤维的收缩力14相较于这些方法，本文所述检测技术耗时更短，且由于采用标准化操作流程，结果更具客观性。此外，该方法可同时检测收缩力和细胞内钙瞬变的影响。
与其他相似 体外 检测方法，采用所述方法获得的结果可能因施加于细胞的人工条件而受到质疑。据报道，培养的新生大鼠心肌细胞更倾向于附着在间距为30 μm或更小的微柱之间，而非平坦基底上。当附着于后者时，细胞表现出肌动蛋白应力纤维和无序的肌纤维。15然而，此处所述收缩力测定中应力纤维的潜在影响可能微乎其微，因为成年心肌细胞的培养时间极短，最多...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）特别研究领域跨学科中心（Sonderforschungsbereich Transregio 19，SFB/TR19，C2）、德国联邦经济与技术部项目ZIM-KF 2727801MD0以及德国联邦教育与研究部创新竞争力中心——心血管疾病体液免疫反应（Zentrum für Innovationskompetenz - Humorale Immunantworten bei kardiovaskulären Erkrankungen, ZIK-HIKE，资助编号BMBF FKZ 03Z2CN12）资助。动物饲养和实验均依照德国实验动物科学学会（Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS）和欧洲实验动物科学联合会（Federation of European Laboratory Animal Science Association, FELASA）的建议进行。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 免疫吸附保存液 | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| II型胶原酶 | Cell System | LS004176 | |
| 无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| 层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml 溶于DMSO |
| Econo Pac 层析柱 | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por 生物技术纤维素酯透析膜 | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4孔腔室盖玻片 | Nunc | 155383 | |
| 心肌细胞钙信号与收缩功能记录系统 | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 分析软件 | IonOptix |
参考文献
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重印与许可
