从癌症患者血液中分离循环肿瘤细胞，且不造成细胞损伤。通过使用E-选择素的双分子层表面以及针对上皮标志物的抗体，实现肿瘤细胞的分离。纳米管涂层可特异性促进癌细胞黏附，从而获得较高的捕获纯度。
本文内容
摘要
摘要
循环肿瘤细胞（CTC）是指从原发性肿瘤脱落并扩散至循环系统的细胞，最终可在远端部位形成继发性肿瘤。根据血液中CTC浓度与疾病严重程度之间的相关性，CTC计数可用于监测疾病进展1。作为治疗研究工具，可在实验室中对CTC进行研究，以开发个体化治疗方案。为此，CTC的分离过程必须不造成细胞损伤，同时尽可能避免其他细胞类型（尤其是白细胞）的污染2。目前许多技术（包括唯一经美国FDA批准用于CTC计数的设备）在分离过程中会破坏CTC（更多信息参见参考文献2）。本文描述了一种用于捕获活体CTC的微流控装置，其表面经E-选择素糖蛋白及针对上皮标志物的抗体共同功能化修饰3。为提高装置性能，采用一种由埃洛石纳米管组成的纳米颗粒涂层，该纳米颗粒为从黏土中提取的铝硅酸盐纳米材料4。E-选择素分子能够捕获流经装置的快速移动CTC，相比其他微流控装置（需较长处理时间以使靶细胞有足够时间与表面相互作用）具有优势。针对上皮靶标的抗体则赋予装置对CTC的特异性，并提供一个易于调节的参数以优化分离效率。最后，埃洛石纳米管涂层通过促进快速移动细胞的捕获、增加蛋白吸附的表面积以及排斥污染性白细胞，显著提高了分离效率3,4。该装置采用现成材料通过简单工艺制备而成，已成功用于从转移性癌症患者血液中捕获癌细胞。分离后捕获的细胞在体外培养中可维持存活长达15天，且每个患者的样本通常包含>50%的活体原发性癌细胞。该装置已成功用于从稀释全血及血沉棕黄层样本中捕获活体CTC。最终，我们提出了一种具备临床应用功能的技术，可用于开发个体化癌症治疗方案。
方案
以下方案用于制备单个微管装置。
1. 埃洛石纳米管溶液的制备
- 将250 μL埃洛石纳米管溶液（水中6.6 wt%）以10–13 W（均方根值）超声处理30秒。用冷水冷却溶液后，再次超声处理一次。再次冷却。
- 将超声处理后的溶液吸入注射器，连接0.45 μm针头滤器，过滤至洁净的微量离心管中。间歇涡旋振荡溶液以保持均匀性。
2. 用埃洛石纳米管涂覆微管内表面
- 取一段长度为 50 cm 的 Micro-Renathane 微管（内径 300 μm，内体积 35.3 μL）。将微管一端斜向剪切，插入小型 IDEX 适配器中。将 3/10 cc 29G 注射器的针头插入微管的另一端。
- 为清洗微管，将微管的开口端（带适配器的一端）浸入 70% 乙醇中，用注射器吸取约 50 μL 乙醇，使微管完全充满。
- 用注射器吸入足量蒸馏水，冲洗微管中的乙醇。
- 将注射器从微管上拆下，排空注射器后，重新连接至微管。
- 配制 0.02% w/v 的聚-L-赖氨酸水溶液。用注射器吸取 50 μL 该溶液进入微管，室温（RT）静置 5 分钟。
- 用注射器吸取 100 μL 过滤后的纳米管溶液进入微管，室温（RT）孵育 3 分钟。
- 用注射器将 100 μL 水通过微管，冲洗出纳米管溶液。将已包被的微管充满水后，室温（RT）静置过夜。
3. 细胞分离用微量离心管的准备
- 配制含10 μg/mL蛋白G的1×杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0 - 7.2）溶液。先将50 μL PBS通过微管，随后吸入50 μL蛋白G溶液，并在室温下孵育1.5小时。
- 配制含5 μg/mL E-选择素-IgG和50 μg/mL抗体（大多数癌样本使用抗EpCAM抗体，前列腺癌样本使用抗PSMA抗体）的PBS溶液。将50 μL E-选择素与抗体混合溶液吸入微管中，并在室温下孵育2小时。
- 使用5%脱脂奶粉封闭非特异性细胞黏附。配制5%（w/v）脱脂奶粉的PBS溶液。将50 μL脱脂奶粉溶液吸入微管中，并在室温下孵育1小时。
- 向微管中加入50 μL PBS，并在室温下放置，直至血液或血沉棕黄层样本准备就绪用于后续处理。
- 在使用微管进行分离前10分钟，吸入50 μL已用Ca2+饱和的PBS（“PBS+”），以激活选择素分子。
4. 细胞分离样品的制备
- 从患者体内抽取或采集10 mL血液至肝素化试管中。
- 将10 mL Ficoll-Paque淋巴细胞分离液加入50 mL离心管中。轻轻将10 mL全血叠加于Ficoll液上方，避免血液与Ficoll混合。
- 在4 °C条件下以2000x g离心15分钟，减速过程尽量轻微。
- 取出白膜层，并转移至新试管中。
- 用PBS洗涤白膜层（以230x g离心10分钟，弃去上清液）。
- 用1 mL红细胞裂解缓冲液轻轻重悬细胞，在室温下孵育10分钟以裂解红细胞。
- 加入10 mL PBS，轻轻混匀，以230x g离心10分钟。弃去上清液，将沉淀物轻轻重悬于3至4 mL PBS+中。
5. 细胞分离
- 使用 IDEX 接头将一端功能化的微管连接到 5 mL 注射器上。
- 将注射器安装到注射泵上。
- 将功能化微管的开口端浸入细胞悬液中。
- 以 1 至 4 mL/h 的流速使细胞悬液通过微管。
- 将微管的开口端转移至含有 PBS+ 的离心管中，以 0.016 mL/min 的速度抽取 300 μL PBS+ 进入注射器，以去除微管中未结合及松散结合的细胞。
- 将微管的开口端放入一个干净的离心管中。将注射器与微管断开，并连接预先装满 Accutase 的注射器。轻柔灌注足量 Accutase 以充满微管（约 50 μL），并在室温下孵育 10 分钟。
- 连接一个预先装有 1 mL 培养基（79% RPMI、20% FBS、1% 青霉素-链霉素）的注射器，将培养基灌注入微管，并将流出液收集至组织培养处理过的孔板中。
- 在 37 °C、5% CO2 及湿润条件下培养细胞。
6. 代表性结果
该技术的目标是从癌症患者血液中分离出有活力的癌细胞。目前存在多种方法用于鉴定培养中的癌细胞，这是验证设备成功与否的必要步骤。我们选择使用针对上皮成分的抗体对培养细胞进行染色，例如抗EpCAM（上皮细胞黏附分子）或抗PSMA（前列腺特异性膜抗原）抗体，同时使用DAPI染色以识别完整的细胞核 （图 2 和 3）使用该技术捕获的癌细胞数量必然取决于起始样本中循环肿瘤细胞（CTC）的数量，而不同患者之间的差异可能较大。在处理来自Ⅳ期癌症患者样本时，我们通常每管血液中可捕获100至500个癌细胞，纯度达到 >50%。在分离后立即检测时，可能会存在较多的污染性白细胞，但这些细胞的数量在培养基中孵育长达5天后将减少。
图1. 循环肿瘤细胞（CTC）分离用功能化微管的示意图，显示由选择素介导的滚动黏附，随后由抗体介导的静态黏附。
图 2. 从乳腺癌患者和肺癌患者血液样本中分离循环肿瘤细胞（CTC）的代表性数据。实心柱表示根据EpCAM染色结果被明确鉴定为CTC的活细胞数量，对应左侧纵坐标；空心柱表示CTC占捕获细胞总数的百分比，对应右侧纵坐标。结果为培养五天后所得。
图 3. 来自不同供体（A 和 B）的循环肿瘤细胞（CTC）在从癌症患者血液样本中分离后体外培养 5 天的代表性显微图像。细胞经 AlexaFluor 488（绿色）荧光标记 EpCAM，同时用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色以显示细胞核（蓝色）。
讨论
在发现新型癌症治疗方法的早期阶段，通常会使用癌症细胞系，尽管这些细胞系与原发性癌细胞的相似性存疑，但由于其在实验室中易于操作，仍被广泛使用。如果在新型研究的早期阶段即采用原发性人类癌细胞，将有助于加快癌症治疗药物的研发进程。循环肿瘤细胞（CTC）是获取最为便捷的一类癌细胞，因其存在于血液中，可通过常规抽血获得。此外，循环肿瘤细胞在转移过程中扮演着必不可少的环节5,6，因此它们在疾病中的相关性及作为新药靶向目标的价值显而易见。从血液中分离CTC 体外 由于其浓度极低，约为每百万个白细胞中一个或每十亿个红细胞中一个，使得研究变得复杂7目前用于检测血液中循环肿瘤细胞（CTC）的大多数方法，包括唯一获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的技术CellSearch（Veridex），在检测过程中会损伤或破坏细胞，因而无法用于计数以外的其他用途。上述方法不损害细胞活性，因此为未来癌症的临床研究开辟了可能。由于该技术的目标是回收完整的活细胞，因此在整个操作过程中，尤其是血液分离步骤中，必须谨慎处理细胞。
该系统中存在多个可调节的参数，可根据癌症类型等关键特征进行调整，以提高捕获效率。在上述步骤中，我们选择使用EpCAM作为除前列腺癌样本外所有癌症类型的循环肿瘤细胞（CTC）特异性抗体；在处理前列腺癌样本时，则使用抗PSMA抗体。此外，还可根据患者个体情况选用其他癌症特异性抗体，以进一步优化捕获性能。同时，也可调整selectin和抗体的浓度以增强捕获效果8。
该装置的一个关键特征是将E-选择素分子固定在表面。E-选择素通常表达于内皮细胞的管腔表面，其功能是募集快速移动的白细胞至炎症部位。流动的白细胞与选择素分子发生短暂结合，从而表现出较慢的滚动行为，这有助于细胞通过整合素与内皮细胞实现更缓慢而牢固的黏附。已有充分的实验证据表明，循环肿瘤细胞（CTC）可能通过类似的机制实现血管外渗9,10。引入选择素还使得该装置可在更高的流速下运行，而在该流速下，细胞原本无法有效结合抗体11。因此，本装置通过模拟微静脉的生理环境，以生物仿生的方式捕获流动中的CTC，同时避免对细胞造成损伤。
设备性能的提升可归因于在装置管腔表面添加了埃洛石纳米管涂层。先前的研究表明，该纳米管涂层具有三个主要组分，可实现更优的功能。首先，纳米管涂层增加了表面积，从而促进更多蛋白质在表面沉积4。其次，通过原子力显微镜对纳米管涂层进行分析后发现，单个纳米管会从表面突出并伸入流体中，这使得选择素分子可被呈现在表面以上约一微米的位置，从而使细胞在其流经管道的轨迹中更早地被捕获并招募至表面4。最后，埃洛石纳米管涂层能够抑制白细胞在表面的黏附与铺展，从而减少与循环肿瘤细胞（CTC）共同被捕获的白细胞数量，进而提高后续CTC的纯度3。
披露
M.R.K. 是 CellTraffix, Inc.（纽约州罗切斯特）的科学顾问。
致谢
本研究工作由康奈尔大学微环境与转移中心通过美国国家癌症研究所资助编号U54CA143876提供支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国家癌症研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。此项工作还部分得到了美国国家科学基金会研究生研究奖学金（A.D.H）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 300 微米内径管 | Braintree Scientific, Inc. | MRE025 | |
| 用于连接注射器的较粗管路 | IDEX Health Science | 1507L | |
| 用于泵的 5 mL 注射器 | BD Biosciences | 309603 | |
| 小管径至大管径连接器 | IDEX Health Science | P-770 | |
| 大管径管路至注射器连接器 | IDEX Health Science | F-120 和 P-659 | |
| 用于微量管的注射器（3/10 cc 胰岛素注射器，U-100，29G，1/2 英寸） | BD Biosciences | 309301 | |
| Accutase | MP Biomedicals LLC | 1000449 | |
| Ficol-Paque Plus | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| 红细胞裂解缓冲液（Buffer EL，1000 mL） | Qiagen | 1014614 | |
| Protein G，5 mg | CalBiochem (calbiochem.com) | 539303 | |
| 人 EpCAM/TROP-1 抗体 | R&D Systems | MAB960 | |
| PSMA 抗体（GCP-04） | Abcam | ab66911 | |
| 96 孔板（Microtest 96） | BD Biosciences | 35-3072 | |
| 印迹级阻断剂，脱脂干奶粉，300 g | Bio-Rad | 216005508 | |
| 埃洛石纳米管 | NaturalNano | NN-HNT200 | |
| 碳酸钙，5 g | Aldrich Chemistry | 481807 | |
| rhE-选择素/Fc 融合蛋白，100 µg | R&D Systems | 724-ES | |
| RPMI 1640 培养基 | GIBCO, by Life Technologies | 22400-089 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-095 | |
| 聚-L-赖氨酸，0.1% w/v 水溶液 | Sigma-Aldrich | P8920-100ML | |
| 超声破碎仪 | Fisher Scientific | Model 100 | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biochemicals | S11056H | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma Life Sciences | P0781 |
参考文献
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