脑片中单个神经元轴突、树突及树突棘的电压敏感染料记录

摘要

本文描述了一种用于监测膜电位变化的成像技术，其空间分辨率达到亚微米级，时间分辨率达到亚毫秒级。该技术基于激光激发电压敏感性染料，可对轴突及轴突侧支、终末树突分支以及单个树突棘中的信号进行测量。

摘要

了解单个神经元的生物物理特性及其功能组织，以及它们如何处理信息，是理解大脑工作原理的基础。任何神经细胞的主要功能都是处理电信号，这些信号通常来自多个来源。神经元过程的电学特性极为复杂、动态变化，在一般情况下，若无详细测量则无法预测。理想情况下，为了获得此类测量数据，人们希望能够同时在多个位点监测亚阈值事件，观察这些事件如何从神经元过程上的起源部位传播并在特定位置进行整合，从而影响动作电位的产生。由于使用电极进行测量存在技术局限性，这一目标在任何神经元中尚未完全实现。为克服这一缺陷，非常有必要将膜片钳电极技术与成像技术相结合，后者能够实现对神经元各个部分的大规模并行记录。在此，我们描述了一种此类技术——利用有机电压敏感染料进行膜电位瞬变的光学记录（V_m-成像），该技术具有亚毫秒级和亚微米级的空间与时间分辨率。我们的方法基于电压敏感分子探针领域的开创性研究²。几十年来，该技术的许多方面持续得到不断改进^{3, 5, 11}。此外，先前的研究已证实V_m-成像具备两个关键特性：第一，荧光信号在整个生理范围内（-100 mV 至 +100 mV）与膜电位呈线性关系^{10, 14, 16}；第二，使用本研究中的电压敏感染料（JPW 3028）对神经元染色不会产生可检测到的药理学效应。染色过程中观察到的动作电位展宽现象是完全可逆的^{4, 7}。此外，实验证据表明，在出现任何可检测的光毒性效应之前，可以获得大量（多达数百次）的记录^{4, 6, 12, 13}。目前，我们利用在接近最优波长下具有卓越亮度和稳定性的激光光源，以最大化V_m-成像技术的灵敏度。当前的灵敏度允许对神经元所有部分（包括轴突及轴突侧支、末端树突分支以及单个树突棘）的V_m瞬变进行多点光学记录。所获取的信号相互作用信息既可进行定量分析，也可直接以视频形式可视化呈现。

方案

1. 仪器设备设置

步骤 1.1. 成像设置

记录电压敏感染料信号的关键在于适当的设计实验装置。我们使用 upright 显微镜（BX51WI Olympus 或 Zeiss AxioExaminer），配备三台相机。该装置设计用于在脑切片中通过倒置荧光宽场显微成像模式，利用激发光照射单个神经元，所用物镜为 Nikon 60X/1.0 NA 或 Zeiss 63X/1.0 NA 水浸物镜。我们的显微镜固定在防震台上，并配有电动可移动载物台。每台显微镜配备三个相机接口。其中一个接口连接标准高空间分辨率 CCD 相机，用于红外微分干涉差视频显微成像（IR-1000, Dage MTI, USA）。第二个接口连接高速数据采集相机（帧率最高可达 20 kHz），其空间分辨率相对较低（80 x 80 像素），但具有出色的动态范围（14 位）和极低的读出噪声（NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA）。第三个接口连接高空间分辨率 CCD 相机（PixelFly, 1392x1024 像素；PCO AG, 德国），该相机安装在转盘共聚焦扫描仪（CSU-10, Yokogawa, 日本）上，用于采集共聚焦 z 轴图像堆栈，以实现对染色细胞的详细形态学重建。激发光源为频率倍增的二极管泵浦 Nd:YVO4 连续波激光器（532 nm，400 mW）（MLL-III/400 mW；CNI, 长春, 中国）。直径为 2 mm 的激光束经快门（LS6; Vincent Associates）控制后，导入通过单端口倒置荧光聚光镜（TILL Photonics GmbH, Gräfelfing, 德国）与显微镜耦合的导光管，以完全充满物镜后孔径，并在样品平面上实现近乎均匀的照明。使用该激光光源替代传统的氙弧灯，以最大限度提高 V_m 成像的灵敏度，具体体现在两个方面：（1）采用染料吸收光谱红移区域的单色激发光，以最大化染料的 V_m 灵敏度^9,10；（2）将激发光强度提升至超过弧灯所能达到的水平。激发光由中心波长为 560 nm 的二向色镜反射至样品，所采集的荧光信号则通过 610 nm 截断滤光片（Schott RG610）过滤。激发光强度的提高与接近最优单色激发波长的结合，使电压成像的灵敏度相比此前的测量提高了约 50 倍⁶。

步骤 1.2. 调整均匀照明

使用荧光玻片标准品（绿色激发/红色发射）。在激光光路中插入适当的中性密度滤光片，以确保CCD不发生饱和。将物镜聚焦在玻片表面。调整石英导光管接收端在激光发射器物镜前方的位置，并利用落射荧光聚光镜上的适当执行器，调节连接在显微镜上的导光管输出端的位置，以实现视场中心对齐且照明均匀。

步骤 1.3. 确定振动噪声

在荧光载玻片表面放置一个微小的黑色墨水标记。使用 NeuroCCD 以连续记录模式记录光强度。将物镜聚焦于黑色墨水标记的暗边处。以 2 kHz 的帧率记录约 100 毫秒的光强度。显示来自均匀照明区域约 20 个像素的光强度相对变化（ΔF/F）的空间平均迹线，以及沿墨水标记边缘约 20 个像素的相应迹线。高对比度边缘像素记录中的额外噪声反映了系统的振动噪声。

步骤 1.4. 振动隔离

必须使用隔振台将振动降低至低于实验记录条件下光强水平的散粒噪声水平。调节隔振台，直至图像中覆盖锐利边缘的像素所反映的光强振动噪声可忽略不计。任何带有运动部件的设备（如机械快门、风扇）均不得安装在隔振台上。安装在隔振台上的设备所连接的电缆，若连接至未进行隔振的其他组件，则必须保持松弛，以免将机械振动传递至显微镜。

2. 用于V的合适神经元的选择_m-成像

步骤 2.1. 神经元的选择

按照标准操作流程制备脑切片。使用在特定神经元中表达EGFP的小鼠品系。利用转盘共聚焦成像系统，在脑片中观察EGFP标记的神经元。选择具有完整树突和轴突结构、且其突起平行且靠近切片表面的神经元进行膜电位（V_m）成像。在野生型小鼠中无法实现此类选择，因为在微分干涉差（DIC）显微镜模式下，轴突和细小树突大多不可见。

3. 使用电压敏感性染料标记神经元

步骤 3.1. 填充膜片电极

从尖端开始用无染料的细胞内溶液填充玻璃膜片电极，施加负压约15秒，填充至电极锥形部分的约2/3处。尖端使用无染料溶液是必要的，以防止染料泄漏到脑片上，从而避免背景荧光增加并显著降低信噪比。随后用含有膜不通透性电压敏感染料JPW3028（溶于细胞内溶液，终浓度0.8 mM）的溶液反向填充电极。

JPW3028 是用于细胞内应用的最成功的电压探针，属于 ANEP 系列亲脂性苯乙烯基染料的双正电荷类似物，其水溶性仍足以用于显微注射。该染料的二乙基类似物具有几乎完全相同的特性（包括电压敏感性），并以商品名 JPW1114 市售（见表1）。我们以蒸馏 H₂O 配制 20 mM 的母液。母液以 50 μl 分装，于 -20 °C 冷冻保存。实验当天，将 2 μl 母液溶于 50 μl 细胞内溶液中，以获得 0.8 mM 的终浓度染料溶液。母液稳定，可在室温下保存数月。因此，我们留出一份 50 μl 分装样在室温下保存，直至用尽。

步骤 3.2. 快速建立吉欧密封

对先前选定的神经元进行膜片钳记录，在全细胞模式下使染料从胞体膜片电极自由扩散至胞体，持续20-45分钟。必须尽快形成封接，以尽量减少电极尖端中无染料溶液的体积。首先练习不加染料的电极快速封接操作。随后，练习使用含染料的电极进行封接并加载神经元，目标是尽可能减少电极尖端无染料溶液的使用量，同时避免污染周围组织。通过练习，可在1-2分钟内建立封接。

步骤 3.3. 监测染色程度

在全细胞构型下进行染料扩散时，通过在电流钳模式下记录诱发的动作电位来监测神经元的生理状态。此外，通过以2 kHz的帧率并使用中性密度滤光片调节至部分全光强度（我们采用400 mW激光器激光强度的0.04%）记录细胞胞体的静息光强度（RLI），以监测染色程度。持续进行染料加载，直至动作电位开始变宽，通常在20–40分钟后发生，具体时间取决于电极的大小和电阻。

峰电位的展宽是完全可逆的，最可能是由于染料在胞体膜中达到饱和浓度时的电容负载效应所致。当染料浓度在神经元内达到平衡后，峰电位的波形即可完全恢复。

步骤 3.4. 移除染料电极

染色结束后，在电压钳制模式下小心地将记录电极从细胞体上移开，确保在此过程中实现全细胞模式向胞外向外式记录模式的转换。

步骤 3.5。等待染料扩散

将切片在室温下继续孵育1.5-2小时，以使电压敏感性染料扩散至神经元突起中。当大量染料从胞体扩散至树突和轴突过程后，动作电位的波形将完全恢复。

4. 光学记录

步骤 4.1. 选择用于成像的细胞区室

在低光照荧光条件下找到染色神经元的胞体，并在微分干涉差（DIC）下使用标准（无染料）膜片电极重新封接该神经元。以10-40 Hz的帧率，在CCD电压成像的连续记录模式下观察神经元突起。使用中性密度滤光片将光照强度降低至仅能观察目标结构所需的最低水平。在定位染色神经元时，我们采用400 mW激光强度的0.01%。通过X-Y载物台，将感兴趣的神经元突起置于成像区域中央。利用显微镜部分关闭的视场光阑遮挡胞体，避免其受到激发光照射。遮蔽胞体以避免高强度激发光照射，可显著减少记录过程中的光动力损伤。

步骤 4.2 记录与膜电位瞬变相关的光学信号

记录与单个树突分支中逆向传播的动作电位（AP）相关的光学信号。记录与轴突中动作电位（AP）相关的光学信号。记录与树突棘中逆向传播的动作电位（AP）相关的光学信号。采用适合准确重建信号波形的帧率，并尽可能缩短记录时间和高强度激发光的暴露时间，以最大限度减少染料漂白和光动力损伤。例如，研究单个动作电位在轴突中启动和传播的序列时，需要5-10毫秒的记录时间。记录过程中的激发光强度需在信噪比与染料漂白及光动力损伤程度之间进行权衡。当使用400 mW激光照射直径为300 μm的区域以记录较长轴突段时，我们采用100%的激光强度。当激发光聚焦于直径为30 μm的区域用于树突棘成像时，我们使用10-25%的激光强度。记录所需的时间长度是决定最佳激发光强度的重要因素；较短的记录时间允许使用更高的光强度。最佳照明强度应根据每种样品和测量条件通过实验经验确定。

5. 数据分析

步骤 5.1. 对原始数据进行已知误差校正

数据的分析与显示采用 NeuroPlex 程序（RedShirtImaging）完成，该程序使用 IDL（ITT Visual Information Solutions，Boulder，Colorado）编写，并结合了自定义的 Visual Basic 例程。在低光照条件下，背景荧光成为影响 ΔF/F 信号大小的重要因素。原始数据首先通过减去从切片无染色区域测定的平均背景荧光强度来校正此效应。随后，使用信号对齐软件校正动作电位（AP）起始的时间抖动，以及在平均过程中可能发生的微小标本移动。在时间域上，通过将每次试验中电记录的动作电位与平均开始时获取的参考信号进行互相关分析，实现 AP 信号的对齐（图 1B）。在空间域上，通过图像互相关方法对图像进行二维离线对齐，以补偿标本可能发生的微小横向移动。每次单独试验前均会验证图像在 z 轴方向上的正确聚焦，通常需要进行微调。经过时空对齐的信号如 图 1B 所示进行平均。由于染料漂白引起的光强度缓慢变化，通过将数据除以从无刺激记录试验中获得的适当双指数函数进行校正（图 1B）。动作电位信号的波形通过立方样条插值法从一组数据点重建，该方法生成一条逐段连续并通过每个数据点的曲线。为了验证电压敏感染料信号在毫秒时间尺度上无明显失真地追踪膜电位，将胞体的电学动作电位信号与邻近轴突起始段的光学动作电位信号进行了比较，结果如 图 3B 所示。两个信号高度重合，仅存在光学记录中的散粒噪声差异。

图1. 数据分析（动画）。(A) 上图：处于记录位置的染色神经元的高分辨率共聚焦图像，示意图显示记录电极连接胞体，胞外刺激电极位于基底树突附近。通过胞外突触刺激诱发动作电位。下图：使用CCD获取的轴突低空间分辨率荧光图像，用于V_m成像。(B) 胞体电极记录（黑色轨迹）、轴突起始段光学记录（红色轨迹）以及郎飞结光学记录（绿色轨迹）。最上一排轨迹：9次试验的原始数据，显示动作电位起始的时间抖动。第二排轨迹：时间对齐后的信号。第三排轨迹：平均信号。第四排轨迹：漂白校正。最下排轨迹：经一次时间平滑处理的三次样条插值。

结果

成功的共聚焦显微镜观察应能够清晰识别出靠近脑片表面且位于同一焦平面内的完整神经元突起。在加载电压敏感性染料之前，选择适合进行电压成像的神经元至关重要。图2展示了皮层脑片中表达EGFP的L5锥体神经元的共聚焦图像（Crym转基因小鼠品系）。单个神经元的轴突清晰可见。选择那些在靠近脑片表面的同一焦平面内具有长而完整轴突的细胞（白色箭头所示）。

图 2. 用于轴突动作电位信号膜电位（V_m）成像的第5层皮层神经元筛选。同一脑片区域的低倍（左）和高倍（右）放大图像；使用 Yokogawa 转盘扫描仪，488 nm 激发。

讨论

本文介绍了一种电压敏感染料记录方法，可用于以亚微米级空间分辨率和亚毫秒级时间分辨率监测单个神经元的电活动。采用接近最优波长（就信号幅度而言）的激光激发，使记录灵敏度比以往方法提高了约50倍。当前的灵敏度可实现对单个神经元所有部位的电信号监测，包括树突、轴突、轴突侧支、轴突末梢以及单个树突棘。在现有灵敏度下，膜电位瞬变的记录帧率可达每秒20,000帧。通过适度的信号平均（4至25次试验），即可将信噪比表示的记录灵敏度进一步提高2至5倍。电压成像的主要局限在于，无法在绝对电压尺度上对来自多个位置的光学信号进行简单的校准。在某些实验条件下，可通过寻找在所有位置均具有已知幅度的膜电位信号来解决此问题。轴突以及某些完全可兴奋树突中的动作电位信号⁶可作为极佳的校准标准。

该方法应用中的关键步骤包括：

1. 通过将记录限制在急性脑切片表面附近（< 30 μm）的神经元，以最小化光散射效应。这需要优化切片程序，以在切片的上层获得较高比例的健康神经元¹。
2. 优化电极尖端透明溶液的用量，以...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
装置组件
直立显微镜	Olympus Inc.	BX51WI	配备三个相机接口
电动可移动载物台	Siskiyou	MXOPi.2
适用于 Olympus BX51 的落射荧光聚光镜	TILL Photonics	0000-560-11659
直立显微镜	Carl Zeiss, LLC	AxioExaminer D1	配备三个相机接口
电动顶板	Scientifica Limited	MMBP
适用于 Zeiss Axi–xaminer 的落射荧光聚光镜	TILL Photonics
数据采集相机	RedShirtImaging LLC	NeuroCCD-SM	高速、低读出噪声
用于红外微分干涉相衬（IR-DIC）的 CCD	Dage-MTI	IR-1000
转盘共聚焦扫描仪	Yokogawa	CSU-10
共聚焦扫描仪上的高空间分辨率 CCD	PCO AG	PixelFly	1392×1024 像素
DPSS 连续波激光器（532 nm）	CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd	MLL-III-532 400mW	激发光源
多模光纤耦合器	Siskiyou	SM-CFT
导光管	TILL Photonics	0000-515-11524
快门	Vincent Associates	LS6
隔振台	Minus k Technology	MK26
特定试剂
Di-2-ANEPEQ（JPW 1114）	Life Technologies	D-6923	电压敏感性染料
Crym-EGFP 小鼠品系	GENSAT（MMRRC）	STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd	在皮层第5层神经元中稀疏表达 EGFP