本文描述了一种用于监测膜电位变化的成像技术，其空间分辨率达到亚微米级，时间分辨率达到亚毫秒级。该技术基于激光激发电压敏感性染料，可对轴突及轴突侧支、终末树突分支以及单个树突棘中的信号进行测量。
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本文内容
摘要
摘要
了解单个神经元的生物物理特性及其功能组织，以及它们如何处理信息，是理解大脑工作原理的基础。任何神经细胞的主要功能都是处理电信号，这些信号通常来自多个来源。神经元过程的电学特性极为复杂、动态变化，在一般情况下，若无详细测量则无法预测。理想情况下，为了获得此类测量数据，人们希望能够同时在多个位点监测亚阈值事件，观察这些事件如何从神经元过程上的起源部位传播并在特定位置进行整合，从而影响动作电位的产生。由于使用电极进行测量存在技术局限性，这一目标在任何神经元中尚未完全实现。为克服这一缺陷，非常有必要将膜片钳电极技术与成像技术相结合，后者能够实现对神经元各个部分的大规模并行记录。在此，我们描述了一种此类技术——利用有机电压敏感染料进行膜电位瞬变的光学记录（Vm-成像），该技术具有亚毫秒级和亚微米级的空间与时间分辨率。我们的方法基于电压敏感分子探针领域的开创性研究2。几十年来，该技术的许多方面持续得到不断改进3, 5, 11。此外，先前的研究已证实Vm-成像具备两个关键特性：第一，荧光信号在整个生理范围内（-100 mV 至 +100 mV）与膜电位呈线性关系10, 14, 16；第二，使用本研究中的电压敏感染料（JPW 3028）对神经元染色不会产生可检测到的药理学效应。染色过程中观察到的动作电位展宽现象是完全可逆的4, 7。此外，实验证据表明，在出现任何可检测的光毒性效应之前，可以获得大量（多达数百次）的记录4, 6, 12, 13。目前，我们利用在接近最优波长下具有卓越亮度和稳定性的激光光源，以最大化Vm-成像技术的灵敏度。当前的灵敏度允许对神经元所有部分（包括轴突及轴突侧支、末端树突分支以及单个树突棘）的Vm瞬变进行多点光学记录。所获取的信号相互作用信息既可进行定量分析，也可直接以视频形式可视化呈现。
方案
1. 仪器设置
步骤 1.1. 成像装置设置
记录电压敏感染料信号的关键在于合理的装置设计。我们使用配备三个相机的 upright 显微镜（BX51WI Olympus 或 Zeiss AxioExaminer）。该装置设计用于在脑切片中通过倒置荧光宽场显微成像模式，利用 Nikon 60X/1.0 NA 或 Zeiss 63X/1.0 NA 水浸物镜，对单个神经元进行激发光照明。我们的显微镜固定在防震台上，并配备电动可移动载物台。每台显微镜均配有三个相机接口。其中一个接口连接标准高空间分辨率 CCD 相机，用于红外微分干涉差视频显微成像（IR-1000, Dage MTI, USA）。第二个接口连接高速数据采集相机（最高帧速达 20 kHz），其空间分辨率相对较低（80 x 80 像素），但具有出色的动态范围（14 位）和极低的读出噪声（NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA）。第三个接口连接高空间分辨率 CCD 相机（PixelFly, 1392x1024 像素；PCO AG, Germany），该相机安装在转盘共聚焦扫描仪（CSU-10, Yokogawa, Japan）上，用于采集共聚焦 z 轴层扫图像，以实现对染色细胞的精细形态重建。激发光源为波长 532 nm 的倍频二极管泵浦 Nd:YVO4 连续波激光器（400 mW）（MLL-III/400 mW; CNI, C....
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结果
成功的共聚焦显微镜观察应能够清晰识别出靠近脑片表面且位于同一焦平面内的完整神经元突起。在加载电压敏感性染料之前，选择适合进行电压成像的神经元至关重要。图2展示了皮层脑片中表达EGFP的L5锥体神经元的共聚焦图像（Crym转基因小鼠品系）。单个神经元的轴突清晰可见。选择那些在靠近脑片表面的同一焦平面内具有长而完整轴突的细胞（白色箭头所示）。
图 2. 用于轴突动作电位信号膜电位（Vm）成像的第5层皮层神经元筛选。同一脑片区域的低倍（左）和高倍（右）放大图像；使用Yokogawa转盘扫描仪，488 nm激发光。
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讨论
本文介绍了一种电压敏感染料记录方法，可用于以亚微米级空间分辨率和亚毫秒级时间分辨率监测单个神经元的电活动。采用接近最优波长（就信号幅度而言）的激光激发，使记录灵敏度比以往方法提高了约50倍。当前的灵敏度可实现对单个神经元所有部位的电信号监测，包括树突、轴突、轴突侧支、轴突末梢以及单个树突棘。在现有灵敏度下，膜电位瞬变的记录帧率可达每秒20,000帧。通过适度的信号平均（4至25次试验），即可将信噪比表示的记录灵敏度进一步提高2至5倍。电压成像的主要局限在于，无法在绝对电压尺度上对来自多个位置的光学信号进行简单的校准。在某些实验条件下，可通过寻找在所有位置均具有已知幅度的膜电位信号来解决此问题。轴突以及某些完全可兴奋树突中的动作电位信号6可作为极佳的校准标准。
该方法应用中的关键步骤包括：
- 通过将记录限制在急性脑切片表面附近（< 30 μm）的神经元，以最小化光散射效应。这需要优化切片程序，以在切片的上层获得较高比例的健康神经元1。
- 优化电极尖端透明溶液的用量，以.......
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披露
Dejan Zecevic 宣布他是 RedShirtImaging LLC. 的共同所有人，该公司专门生产用于电压敏感染料记录的高速、低噪声 CCD 相机。其他所有作者均声明在本研究中不存在经济利益或潜在的利益冲突。
致谢
我们感谢 Knut Holthoff、Arthur Konnerth 和 Marco Canepari 参与了本技术的初步开发工作，同时感谢 Leslie M. Loew 慷慨提供染料。本研究得到美国国家科学基金会（NSF）资助项目 IOS-0817969、美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 NS068407 和 M136043，以及耶鲁大学卡夫利神经科学研究所的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 装置组件 | |||
| 直立显微镜 | Olympus Inc. | BX51WI | 配备三个相机接口 |
| 电动可移动载物台 | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| 适用于 Olympus BX51 的落射荧光聚光镜 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| 直立显微镜 | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | 配备三个相机接口 |
| 电动顶板 | Scientifica Limited | MMBP | |
| 适用于 Zeiss Axi–xaminer 的落射荧光聚光镜 | TILL Photonics | ||
| 数据采集相机 | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | 高速、低读出噪声 |
| 用于红外微分干涉相衬（IR-DIC）的 CCD | Dage-MTI | IR-1000 | |
| 转盘共聚焦扫描仪 | Yokogawa | CSU-10 | |
| 共聚焦扫描仪上的高空间分辨率 CCD | PCO AG | PixelFly | 1392×1024 像素 |
| DPSS 连续波激光器（532 nm） | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | 激发光源 |
| 多模光纤耦合器 | Siskiyou | SM-CFT | |
| 导光管 | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| 快门 | Vincent Associates | LS6 | |
| 隔振台 | Minus k Technology | MK26 | |
| 特定试剂 | |||
| Di-2-ANEPEQ（JPW 1114） | Life Technologies | D-6923 | 电压敏感性染料 |
| Crym-EGFP 小鼠品系 | GENSAT（MMRRC） | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | 在皮层第5层神经元中稀疏表达 EGFP |
参考文献
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Cohen, L. B., Salzberg, B. M. Optical measurement of membrane potential. Ann. Rev. Neurosci. 1
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