利用膜片钳电生理学和压力肌动图研究动脉平滑肌Kv7钾通道功能

摘要

同时采用膜片钳电生理技术记录分离动脉平滑肌细胞中Kv7（KCNQ）钾通道活性，并结合压力肌动图技术测量血管收缩/舒张反应，可揭示Kv7通道在血管平滑肌生理学和药理学中的重要作用。

摘要

阻力动脉管壁内平滑肌细胞的收缩或舒张决定了动脉的直径，从而控制血流通过血管，并影响全身血压。收缩过程主要受细胞质钙离子浓度（[Ca²⁺]_cyt）的调控，而钙离子浓度又受到多种离子转运蛋白和离子通道的调节。离子通道是血管活性激素激活信号转导通路中的常见中介，介导血管收缩或血管舒张效应。此外，许多治疗药物会以离子通道为靶点，这种作用可能是有意的（例如，使用钙通道阻滞剂诱导血管舒张并降低血压），也可能是无意的（例如，引发不良的心血管副作用）。

最近研究表明，Kv7（KCNQ）电压激活钾通道在调控平滑肌收缩的生理和治疗靶点中具有重要作用。为了阐明Kv7通道在生理信号转导以及治疗药物作用中的具体功能，我们需要在细胞水平上研究其活性的调节机制，同时评估其在完整动脉环境中的贡献。

大鼠肠系膜动脉提供了一个有用的研究模型系统。这些动脉易于分离，清除结缔组织后可用于制备分离的动脉平滑肌细胞，以进行膜片钳电生理实验；也可进行套管插管并加压，用于在相对生理条件下测定血管收缩剂/血管舒张剂的反应。本文介绍了上述两种测量方法，并举例说明如何整合实验设计，以更清晰地理解这些离子通道在血管张力调节中的作用。

方案

1. 小肠系膜血管弓的外科切除

1. 通过吸入给予异氟烷（4%），对一只体重300-400 g的Sprague-Dawley大鼠进行麻醉。
2. 行正中腹切口以暴露小肠系膜。小心地通过腹部切口将小肠和大肠外置，避免对暴露的肠管和系膜造成损伤。将系膜轻柔地展开铺在无菌纱布上。
3. 手术切除小肠及部分大肠（包括盲肠），沿边缘及肠系膜上动脉/静脉主支起源处仔细切断血管。
4. 将切除的组织转移至含有冰冷解剖液的烧杯中（表1）。
5. 在切除肠段后，应在麻醉状态下对大鼠实施人道安乐死。

2. 动脉的解剖与清洗

1. 将切除的肠段及肠系膜弓转移至冷却的解剖培养皿中（4-5 °C) 内含解剖液。该解剖室由一个直径100 mm的玻璃培养皿组成，底部为Sylgard 184弹性体，用于固定解剖针；培养皿置于冷却底座中，温度维持在4-5 °C 通过循环水浴。
2. 使用手术剪从整个肠道中截取一段长约10–12 cm的肠段。在肠段两端进行切割，保留其血管供应，随后将未使用的肠道从腔室中移除，仅保留带有附着血管（肠系膜弓）的肠段。
3. 将小肠节段固定，将肠系膜展开覆盖在腔室近侧，使肠系膜上动脉/静脉的主干位于中央，其各级分支由中心向外周呈放射状延伸（图1）。仅将针固定在肠段上（不要固定在血管上）。
4. 通过相对较亮的红色、较厚的管壁以及特征性的V形分支来区分动脉与静脉，而静脉则表现为U形分支。
5. 通过透射照明解剖显微镜观察，仔细清除围绕的脂肪组织和结缔组织^nd- 4^th 靠近肠道的动脉顺序（虚线圆圈内） 图1使用显微镊子和剪刀进行操作。握住邻近的静脉有助于清除脂肪组织和结缔组织。避免对动脉进行不必要的牵拉。
6. 清除结缔组织后，可分离出肠系膜动脉节段，用于细胞分离（用于单细胞膜片钳研究，第3-4节）或进行套管处理以开展压力肌动图检测（第5节）。在分支点之间截取动脉节段，通常长度不超过1 cm。

3. 用于膜片钳研究的细胞分离

1. 制备 0.5 L 分离液（表1）并将其分为两份后再调节pH值。第一份（通常为100 ml）应加热至 37 °C pH 应调节至 7.2 37 °C (37 °C 分离溶液）。第二部分分离溶液应冷却至 4 °C pH 应调整至 7.2 4 °C （冰冻分离溶液）。pH值调节后，需通过加入适量D-葡萄糖或H₂O调整两种溶液的渗透压至298 mOsm。₂O.
2. 转移 2 ml 的 37 °C 将分离液加入玻璃小瓶中，并在 37 °C 用于步骤 3.4。将 20 mg 牛血清白蛋白（BSA）加入 10 ml 中 37 °C 分离液，溶解，重新温育至 37 °C 并调节pH至7.2。取2 ml该溶液，加入4 mg VIII型胶原酶（Sigma，批号089K8612：胶原酶活性633单位/mg，酪蛋白酶活性285单位/mg，梭菌蛋白酶活性1.6单位/mg）和0.64 mg IV型弹性蛋白酶（Sigma，批号110M7025V，5.9单位/mg；加入 40 μl 16 mg/ml 储存液（用……配制） 37 °C 分离溶液）和 2 μl 1 M DL-二硫苏糖醇（DTT Sigma）；将此酶溶液预热至 37 °C 为步骤 3.5 做准备。
3. 将肠系膜动脉的2-3段转移至一个含有2 ml冰冻分离液的35 mm组织培养皿中，并将培养皿置于冰上。将肠系膜动脉段切成3-4 mm长的小段。
4. 使用经过火焰抛光尖端的巴斯德吸管（以防止损伤动脉），将动脉节段转移至含有2 ml预温的玻璃小瓶（15 × 45 mm，1 dram）中 37 °C 分离液中孵育30分钟 37 °C.
5. 30分钟后，小心吸除 37 °C 使用巴斯德吸管加入2 ml温热的酶解溶液，于35 min内孵育 37 °C.
6. 在酶溶液中孵育35分钟后，立即将小管置于冰上，吸除酶溶液，加入2 ml冰冻分离溶液（重复吸除并加入新鲜冰冻分离溶液4次）。然后，在1 ml冰冻分离溶液中， 轻柔地 用抛光的巴斯德吸管将动脉节段吹打10-20次，以分离出单个肠系膜动脉平滑肌细胞（MASMCs）。
7. 定期取一滴细胞悬液置于35 mm培养皿中，在显微镜下观察心肌细胞形态。健康的大动脉平滑肌细胞应呈光滑的长梭形。并非动脉壁中的所有细胞都会被释放出来。细胞悬液应保持在冰上。
8. 评估MASMC健康状况的另一个有用指标是其对生理浓度Ca的耐受性²⁺ 浓度。用含有 2 mM CaCl 的浴液填充记录室（Bioscience Tools，#CSC-25L）₂ （室温下 pH 7.3，成分见 表1）并将琼脂桥（内含2 M KCl中2%琼脂的弯头玻璃毛细管，插入参比电极（Warner Instrument, REF-3L）中）置于腔室内。使用抛光的巴斯德移液管，转移约100-200 μl 将细胞悬液加入记录室，静置15分钟使细胞贴壁。在2 mM CaCl₂条件下，未受损细胞不应出现明显收缩。₂含溶液（细胞应呈拉长或杆状，而非圆缩成球形）。
9. 加入第一份细胞悬液至记录槽后，加入0.25 ml含有2 mM CaCl₂的灌流液₂ 应将剩余体积的细胞悬液加入其中。该细胞悬液可在冰上以此溶液保存，并用于膜片钳记录，最长可达6小时。

4. 使用全细胞膜片钳技术测量 Kv7 钾电流或膜电位

1. 心肌细胞贴附于记录室的玻璃底面（25 mm，No. 1 圆形盖玻片，Warner Instruments）后，开始持续灌注浴液（表 1）。若需单独记录 Kv7 电流，避免 Kv1 和 Kv2 家族延迟整流钾电流的干扰，浴液中应添加 100 μM GdCl₃。
2. 使用拉管仪和微电极抛光仪将硼硅酸盐玻璃管（Kimax-51，Kimble Chase）拉制成膜片钳电极，当电极内填充内液（表 1）时，其电阻应为 4–5 MΩ。将电极尖端上方约 1–2 mm 处（即下部 ¹/₃ 区域）涂覆 SYLGARD 184。
3. 记录 MASMCs 中的 Kv7 电流时，应采用穿孔膜片钳全细胞电压钳技术。使用穿孔膜片钳构型有助于防止膜磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸（PIP₂）的耗竭，从而避免在常规破膜膜片钳构型中常见的 Kv7 电流快速（通常在 5 分钟内）衰减。在内液（表 1）中加入 120 μg/ml 两性霉素 B：取 3 μl 浓度为 2 mg/ml 的两性霉素 B 储存液（以 DMSO 配制，分装后避光冷冻保存），加入 0.5 ml 内液中。通过将电极尖端浸入不含两性霉素 B 的内液，并在另一端连接一段导管（Tygon R-3603）后使用 10 ml 注射器施加负压，使电极尖端填充不含两性霉素 B 的内液。然后从上方使用 Eppendorf Microloader 移液吸头加入含两性霉素 B 的电极液，直至电极约一半充满溶液。轻轻敲击电极以去除气泡。电极制备完成后应立即使用。
4. 将电极插入电极夹持器，并使用显微操作器将其缓慢下降至细长形心肌细胞表面（靠近细胞核但不位于其正上方，图 2）。当电极电阻升至 6–10 MΩ 时，施加负压以形成吉欧封接（>10 GΩ）。
5. 在等待膜穿孔期间，将钳制电压设为 0 mV。施加 100 ms 的电压阶跃至 +10 mV，随后至 -10 mV，并利用放大器补偿快速的电极电容瞬变。随着全细胞电容瞬变的出现，若观察到微小而持续的正向电流（通常为 2–10 pA），则提示存在功能性的 Kv7 通道。
6. 成功利用两性霉素 B 实现膜穿孔后，通路电阻应降至 35 MΩ 或更低。此时可使用从 -4 mV 钳制电压开始的 5 秒电压阶跃方案启动电流记录。我们采用 -4 mV 钳制电压，以实现对其他类型延迟整流钾电流（主要由 Kv1 和 Kv2 通道介导）接近最大程度的失活，从而避免这些电流干扰相对较小且不发生失活的 Kv7 电流记录。采用较长（5 秒）的电压阶跃方案是必要的，因为 Kv7 通道具有缓慢的电压依赖性激活与去激活特性，需较长时间达到稳态。Kv7 电流在持续电压阶跃期间不发生失活。
7. 为记录 Kv7 电流-电压（I-V）关系，施加 5 秒的电压阶跃，测试电压范围从 -84 mV（此时 Kv7 通道开放概率最低）至 +16 mV（此时 Kv7 通道开放概率达到平台期）；在每个测试电压维持 5 秒后，返回钳制电压（-4 mV）持续 10 秒。完成整套测试脉冲序列约需 3.5 分钟（图 3A）。进行 2–3 次对照 I-V 记录，以确保记录的电流随时间保持稳定。绘制末段脉冲电流平均值（最后 1 秒记录的平均电流）与电压的关系曲线，生成 I-V 曲线（图 3D）。若电流稳定，对照 I-V 曲线应基本重叠。
8. 在施加任何药理学试剂前，启动一个在 -20 mV 持续记录电流的时间进程方案。确保在给药前电流稳定记录至少 5 分钟。施加药理学试剂 5–15 分钟，或直至达到稳态（图 3C）；随后终止时间进程记录，并使用电压阶跃方案记录两条 I-V 曲线。洗脱药物后，记录药物洗脱过程的时间进程，再记录两条额外的 I-V 曲线。
9. 实验结束时，施加 10 μM 林泊利定（linopirdine）或 10 μM XE991——这两种均为 Kv7 通道的不可逆抑制剂；这些药物应能完全抑制在负于 -20 mV 电压下记录到的电流（图 3D）。
10. 每次实验结束后，使用洗涤剂、乙醇和热水清洗记录室及灌流系统，以彻底清除所用药物的残留痕迹。

5. 使用完整动脉节段进行压力肌动图分析

1. 使用购自丹麦 Myo Technology 公司（DMT A/S，丹麦，型号 110P）的压力肌动描记系统进行压力肌动描记实验。将动脉节段安装至不锈钢腔室中，通过将水平固定的左侧玻璃套管插入一端，可移动的右侧玻璃套管插入另一端完成固定。系统内置两个压力传感器（右侧为 P1，左侧为 P2），用于监测动脉管腔内的压力。通过右侧玻璃套管内的液体调节动脉内部压力至接近生理水平。实验开始前，先用管腔溶液预充满一支开放的 10 ml 注射器（作为重力供液压力柱），表1）。将注射器抬高，通过聚乙烯管将溶液推入右侧玻璃套管，注意避免管路或套管中产生气泡。左侧套管应预先用1 ml注射器注入管腔溶液。向压力肌动图腔室中加入10 ml血管浴槽溶液（表1在玻璃插管两侧附近松散地悬挂两根预先制备好的细尼龙缝合线。
2. 小心转移解剖出的肠系膜动脉段（通常为3^rd 或 4^th 约200的片段顺序 350 μm 直径；从步骤2.6）中，用显微镊子夹住血管段的一端，将其从解剖室转移至压力肌动图室。
3. 在透射光源解剖显微镜下观察，手持动脉节段一端，轻轻将其套入左侧玻璃套管，并用尼龙缝线固定。通过已安装的血管轻柔冲洗管腔液体，以清除血管内的血液和碎片。随后关闭左侧注射器的阀门，使该侧形成静止的液柱，以便从右侧调节压力。
4. 使用显微操作器将可移动的右侧玻璃套管靠近动脉段，并将动脉段的右端套入套管，最后用尼龙缝线固定。剪除多余的缝线。
5. 将压力肌动图仪装置安装在压力肌动图显微镜的载物台上。将盖子盖在压力肌动图仪腔室上方。腔室盖子上设有灌流入口和连接的吸液管。将灌流入口连接至分流装置，以便通过重力作用将室温浴液或60 mM KCl溶液灌流至压力肌动图仪腔室中。测试物质（如通过膜片钳实验发现可影响Kv7通道功能的药物或激素）通常直接加入浴液中，而非通过浴液灌流或管腔内溶液施加。浴液灌流将用于清除腔室中的KCl溶液。将吸液管连接至真空系统，以移除多余的灌流液。通过肌动图仪腔室盖子上的开口，将温度传感器插入浴液中。
6. 将压力肌动描记仪单元连接至肌动描记接口系统（myo-interface system），该硬件可实现肌动描记仪单元与myoview软件（DMT）之间的通信。
7. 打开计算机中的 myoview 软件。在参数窗口中，将目标温度设置为 35 °C 温度耐受性为 1 °C，目标流入压为80 mmHg，目标流出压为80 mmHg。加载校准文件，并校准血管外径，以准确记录动脉直径以微米为单位的变化。根据需要调整对比度，以便清晰观察固定段与背景之间的界限。有关软件使用的详细说明，请参阅DMT用户手册。
8. 在15分钟内逐渐升高10 ml注射器（作为重力灌注压力柱），直至P1压力传感器读数达到80 mmHg。在升高压力柱的过程中，检查血管是否存在任何泄漏。若发现泄漏，应丢弃该血管段并更换另一段动脉（重复步骤5.2起的操作）。必要时调整两根套管之间的距离，调整至加压后的动脉段大致呈直线（但未被拉伸），并在结扎处形成类似肩部的结构。图 4A).
9. 通过肌动描记系统（myo-interface system）的控制装置开启压力肌动描记室（pressure myograph chamber）的加热功能。使浴槽溶液逐渐升温，直至达到36-37 °C.
10. 必要时使用 DMT 显微镜物镜的 XYZ 调节功能，以保持血管聚焦，并准确追踪血管外径的变化。
11. 通过短暂灌流（约30秒）60 mM KCl检测安装血管的活性。活性良好的血管在加入KCl后会迅速收缩，并在洗脱60 mM KCl时立即舒张（用约60 ml浴液冲洗以彻底清除KCl）。完成此测试后，将浴液体积重新调整至恰好10 ml。由于KCl溶液及冲洗液均为室温，测试及洗脱过程中浴液温度会有所下降，但腔室加热器将逐步恢复温度至36–37 °C 几分钟内。
12. 让动脉平衡至少30分钟（在此期间，血管直径应在最后至少10分钟内保持稳定）。将浓缩的待测物质直接加入浴槽溶液中，并在腔室边缘轻轻吹打混匀，使待测物质均匀分散于浴液中，达到10 ml腔室体积所需的终浓度。添加待测物质后，血管直径的变化可在实验进行过程中通过实时视频图像进行监测，同时在图像分析窗口中绘制曲线记录。
13. 实验结束后，可将存储的数据文件（*.myo）作为电子表格文件打开，以便进行进一步分析。

6. 代表性结果

所示结果 图3 使用电压阶跃方案记录肠系膜动脉平滑肌细胞中Kv7电流的典型结果（给药前）图3A、B 黑色痕迹）以及使用 Kv7 通道激活剂 Zn 吡硫酮（ZnPyr，100 nM； 图3A,B 红色痕迹）。来自3个细胞的类似电压阶跃数据被平均，以绘制所示的电流-电压（I-V）曲线 图3D. 在使用 100 nM Zn pyrithione 处理期间，电流幅度增强的代表性时间过程（通过在 -20 mV 下持续电压钳制测量）如图所示 图 3C. 图4B 展示了使用压力肌动图测量的ZnPyr对肠系膜动脉外径作用的时间过程；在加入100 nM ZnPyr之前，血管已预先用100 pM精氨酸加压素（AVP）收缩。图中显示了ZnPyr诱导肠系膜动脉舒张的平均剂量-反应数据 图4C.

图1. 解剖室内肠系膜弓的图像。

图 2. 表面带有膜片钳移液管的心肌细胞图像。

图3. Kv7电流的原始记录、药物作用的时间进程及电流-电压（I-V）曲线。A. 在单个MASMC细胞中，给药前（对照，黑色）和加入100 nM ZnPyr并达到稳定后（红色）记录的连续电流响应家族曲线（下图），对应于电压阶跃刺激（上图）。B. A图中所示的代表性电流迹线（由箭头指示），分别为对照（黑色）和100 nM ZnPyr处理后（红色）。灰色条表示用于测量平均电流幅值以绘制电流-电压（I-V）曲线的时间区间。右侧箭头指示各阶跃电压。C. 在-20 mV持续电压钳制条件下测量的100 nM ZnPyr对Kv7电流增强作用的时间进程（条形图表示给药时段）。D. 平均I-V曲线（n=3），数据来源于给药前（对照，实心圆）、100 nM ZnPyr处理期间（空心圆）以及10 μM XE991处理期间（实心三角）记录的Kv7电流密度。非特异性漏电流已按Passmore et al. ¹所述方法扣除。

图 4. 吡啶硫酮锌（ZnPyr）诱导由100 pM 血管加压素（AVP）预收缩的肠系膜动脉舒张。A. 肠系膜动脉在压力肌动图装置中安装后的照片。B. 血管外径随时间变化的过程，依次施加100 pM AVP（空心条）和100 nM ZnPyr（实心条）。C. 柱状图总结了100 nM ZnPyr诱导血管舒张的实验结果。

讨论

本文所述的方法和实验方案具有较强的稳健性，只要细致入微地操作，即可获得清晰且可重复的结果。良好的电生理记录以及动脉节段的收缩/舒张效果，分别依赖于细胞和动脉节段的健康状态。即使采用相同的实验流程，细胞制备的质量也可能因日而异。分离液最多可使用两周，但如果连续两天细胞制备质量均较低，则应重新配制新的分离液。我们发现，不同批次的酶活性存在差异，因此每次使用新批次的酶时，均需对孵育时间及酶浓度等分离条件进行优化。此外，我们还发现，本文针对大鼠肠系膜动脉所描述的细胞分离方案，并不适用于其他血管床或其他物种，因为后者可能具有不同组成或密度的细胞外基质成分。每种血管组织的制备均需独立优化，以确定能够获得最健康细胞的实验条件。我们在判断细胞健康状态时发现以下标准最为有用：1）细胞形态：在含有50 μM Ca²⁺的分离液中经吹打肠系膜动脉节段后，细胞应呈现表面光滑、细长但略有收缩的形态，并在转移至含2 mM Ca²⁺的外部溶液后仍保持该形态；并非所有细胞都能维持接近完全松弛的细长形状，但仅应选用接近完全松弛的肌细胞进行电生理记录；2）细胞应具有较高的光学密度，表明其细胞膜完整且未受损；3）用于记录钾电流或进行...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Sigma	S5886	解剖液：145 电生理学浴液*：140 电生理学实验用内液：10 用于分离心肌细胞的溶液*：140 压力肌动描记术灌流液：145 压力肌动图管腔溶液：145
氯化钾	Sigma	P5405	解剖液：4.7 电生理实验用灌流液*：5.36 电生理实验用内液：135 用于分离肌细胞的溶液*：5.36 压力血管造影浴液：4.7 压力血管造影用管腔液：4.7
钾-EGTA	Sigma	E4378	电生理实验用内液：0.05
HEPES	Sigma	H9136	电生理学浴液*：10 电生理实验用内液：10 心肌细胞分离液*：10
磷酸氢二钠	Sigma	S5136	用于心肌细胞分离的溶液*：0.34
磷酸氢二钾	Sigma	P5655	用于分离肌细胞的溶液*：0.44
氯化镁	Sigma	M2393	电生理实验用灌流液：1.2 电生理实验用内液：1 用于肌细胞分离的溶液*：1.2
氯化钙	Sigma	C7902	电生理实验用灌流液*：2 用于心肌细胞分离的溶液*：0.05
磷酸钠	Fisher Scientific	BP331-1	解剖液：1.2 压力肌动描记术灌流液：1.2 压力血管造影用管腔溶液：1.2
硫酸镁	Sigma	M2643	解剖液：1.17 压力肌动图浴液：1.17 压力肌动图的管腔溶液：1.17
MOPS	Fisher Scientific	BP308	解剖液：3 压力肌动图浴液：3 压力显微术用管腔溶液：3
丙酮酸	Sigma	P4562	解剖液：2 压力肌动描记术灌流液：2 压力肌动图的管腔溶液：2
EDTA 二水合物	研究有机物	9572E	解剖液：0.02 压力肌动图浴液：0.02 压力血管造影用管腔溶液：0.02
D-葡萄糖	Sigma	G7021	解剖液：5 电生理实验用灌流液*：10 电生理实验用内液：20 用于分离心肌细胞的分离液*：10 压力肌动描记术灌流液：5 压力肌动描记法管腔溶液：5
牛血清白蛋白	Sigma	A3912	解剖液：1% 压力血管成像用管腔溶液：1%
pH			解剖液：7.4 电生理学灌流液*：7.3 电生理实验用内液：7.2 心肌细胞分离液*：7.2 压力血管造影浴液：7.4 压力肌动描记法管腔液：7.4
渗透压			分离液：300 电生理实验用灌流液*：298 电生理实验内液：298 用于分离肌细胞的溶液*：298 压力肌动图浴液：300 压力血管造影用管腔溶液：300
*11
表1. 实验所用溶液的成分。