利用膜片钳电生理学和压力肌动图研究动脉平滑肌Kv7钾通道功能

摘要

同时采用膜片钳电生理技术记录分离动脉平滑肌细胞中Kv7（KCNQ）钾通道活性，并结合压力肌动图技术测量血管收缩/舒张反应，可揭示Kv7通道在血管平滑肌生理学和药理学中的重要作用。

摘要

阻力动脉管壁内平滑肌细胞的收缩或舒张决定了动脉的直径，从而控制血流通过血管，并影响全身血压。收缩过程主要受细胞质钙离子浓度（[Ca²⁺]_cyt）的调控，而钙离子浓度又受到多种离子转运蛋白和离子通道的调节。离子通道是血管活性激素激活信号转导通路中的常见中介，介导血管收缩或血管舒张效应。此外，许多治疗药物会以离子通道为靶点，这种作用可能是有意的（例如，使用钙通道阻滞剂诱导血管舒张并降低血压），也可能是无意的（例如，引发不良的心血管副作用）。

最近研究表明，Kv7（KCNQ）电压激活钾通道在调控平滑肌收缩的生理和治疗靶点中具有重要作用。为了阐明Kv7通道在生理信号转导以及治疗药物作用中的具体功能，我们需要在细胞水平上研究其活性的调节机制，同时评估其在完整动脉环境中的贡献。

大鼠肠系膜动脉提供了一个有用的研究模型系统。这些动脉易于分离，清除结缔组织后可用于制备分离的动脉平滑肌细胞，以进行膜片钳电生理实验；也可进行套管插管并加压，用于在相对生理条件下测定血管收缩剂/血管舒张剂的反应。本文介绍了上述两种测量方法，并举例说明如何整合实验设计，以更清晰地理解这些离子通道在血管张力调节中的作用。

方案

1. 小肠系膜血管弓的外科切除

1. 通过吸入给予异氟烷（4%），对一只体重300-400 g的Sprague-Dawley大鼠进行麻醉。
2. 行正中腹切口以暴露小肠系膜。小心地通过腹部切口将小肠和大肠外置，避免对暴露的肠管和系膜造成损伤。将系膜轻柔地展开铺在无菌纱布上。
3. 手术切除小肠及部分大肠（包括盲肠），沿边缘及肠系膜上动脉/静脉主支起源处仔细切断血管。
4. 将切除的组织转移至含有冰冷解剖液的烧杯中（表1）。
5. 在切除肠段后，应在麻醉状态下对大鼠实施人道安乐死。

2. 动脉的解剖与清洗

1. 将切除的肠段及肠系膜弓转移至冷却的解剖培养皿中（4-5 °C) 内含解剖液。该解剖室由一个直径100 mm的玻璃培养皿组成，底部为Sylgard 184弹性体，用于固定解剖针；培养皿置于冷却底座中，温度维持在4-5 °C 通过循环水浴。
2. 使用手术剪从整个肠道中截取一段长约10–12 cm的肠段。在肠段两端进行切割，保留其血管供应，随后将未使用的肠道从腔室中移除，仅保留带有附着血管（肠系膜弓）的肠段。
3. 将小肠节段固定，将肠系膜展开覆盖在腔室近侧，使肠系膜上动脉/静脉的主干位于中央，其各级分支由中心向外周呈放射状延伸（图1）。....

讨论

本文所述的方法和实验方案具有较强的稳健性，只要细致入微地操作，即可获得清晰且可重复的结果。良好的电生理记录以及动脉节段的收缩/舒张效果，分别依赖于细胞和动脉节段的健康状态。即使采用相同的实验流程，细胞制备的质量也可能因日而异。分离液最多可使用两周，但如果连续两天细胞制备质量均较低，则应重新配制新的分离液。我们发现，不同批次的酶活性存在差异，因此每次使用新批次的酶时，均需对孵育时间及酶浓度等分离条件进行优化。此外，我们还发现，本文针对大鼠肠系膜动脉所描述的细胞分离方案，并不适用于其他血管床或其他物种，因为后者可能具有不同组成或密度的细胞外基质成分。每种血管组织的制备均需独立优化，以确定能够获得最健康细胞的实验条件。我们在判断细胞健康状态时发现以下标准最为有用：1）细胞形态：在含有50 μM Ca²⁺的分离液中经吹打肠系膜动脉节段后，细胞应呈现表面光滑、细长但略有收缩的形态，并在转移至含2 mM Ca²⁺的外部溶液后仍保持该形态；并非所有细胞都能维持接近完全松弛的细长形状，但仅应选用接近完全松弛的肌细胞进行电生理记录；2）细胞应具有较高的光学密度，表明其细胞膜完整且未受损；3）用于记录钾电流或进行.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Sigma	S5886	解剖液：145 电生理学浴液*：140 电生理学实验用内液：10 用于分离心肌细胞的溶液*：140 压力肌动描记术灌流液：145 压力肌动图管腔溶液：145
氯化钾	Sigma	P5405	解剖液：4.7 电生理实验用灌流液*：5.36 电生理实验用内液：135 用于分离肌细胞的溶液*：5.36 压力血管造影浴液：4.7 压力血管造影用管腔液：4.7
钾-EGTA	Sigma	E4378	电生理实验用内液：0.05
HEPES	Sigma	H9136	电生理学浴液*：10 电生理实验用内液：10 心肌细胞分离液*：10
磷酸氢二钠	Sigma	S5136	用于心肌细胞分离的溶液*：0.34
磷酸氢二钾	Sigma	P5655	用于分离肌细胞的溶液*：0.44
氯化镁	Sigma	M2393	电生理实验用灌流液：1.2 电生理实验用内液：1 用于肌细胞分离的溶液*：1.2
氯化钙	Sigma	C7902	电生理实验用灌流液*：2 用于心肌细胞分离的溶液*：0.05
磷酸钠	Fisher Scientific	BP331-1	解剖液：1.2 压力肌动描记术灌流液：1.2 压力血管造影用管腔溶液：1.2
硫酸镁	Sigma	M2643	解剖液：1.17 压力肌动图浴液：1.17 压力肌动图的管腔溶液：1.17
MOPS	Fisher Scientific	BP308	解剖液：3 压力肌动图浴液：3 压力显微术用管腔溶液：3
丙酮酸	Sigma	P4562	解剖液：2 压力肌动描记术灌流液：2 压力肌动图的管腔溶液：2
EDTA 二水合物	研究有机物	9572E	解剖液：0.02 压力肌动图浴液：0.02 压力血管造影用管腔溶液：0.02
D-葡萄糖	Sigma	G7021	解剖液：5 电生理实验用灌流液*：10 电生理实验用内液：20 用于分离心肌细胞的分离液*：10 压力肌动描记术灌流液：5 压力肌动描记法管腔溶液：5
牛血清白蛋白	Sigma	A3912	解剖液：1% 压力血管成像用管腔溶液：1%
pH			解剖液：7.4 电生理学灌流液*：7.3 电生理实验用内液：7.2 心肌细胞分离液*：7.2 压力血管造影浴液：7.4 压力肌动描记法管腔液：7.4
渗透压			分离液：300 电生理实验用灌流液*：298 电生理实验内液：298 用于分离肌细胞的溶液*：298 压力肌动图浴液：300 压力血管造影用管腔溶液：300
*11
表1. 实验所用溶液的成分。