工程化肌肉组织在再生医学、疾病模型以及作为肉类的替代来源方面具有巨大潜力。本文介绍了由小鼠成肌祖细胞构建肌肉组织的方法，并采用电脉冲对其进行刺激。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
工程化肌肉组织可用于多种不同目的，包括作为疾病模型的组织制备 体外, 例如 用于研究压力性溃疡、再生医学以及作为肉类替代品 1最早的3D肌肉构建体早在多年前已有报道，该领域的先驱是Vandenburgh及其同事 2,3肌肉组织工程领域的进展不仅源于对生化因子、干细胞和前体细胞知识的极大丰富，更尤其基于研究人员所获得的深刻认识：物理因素在调控细胞行为和组织发育过程中发挥着至关重要的作用。目前最先进的工程化肌肉构建物通常由细胞接种的水凝胶结构组成。在我们的实验室中，这类构建物通常包含从小鼠后肢肌肉中分离的成肌前体细胞，或小鼠成肌细胞系C2C12，与胶原蛋白/Matrigel混合后，接种于两个固定锚点之间，以模拟肌肉韧带的结构。此外，也可考虑使用其他类型的细胞。 例如 替代性细胞系，例如 L6 大鼠成肌细胞 4，新生儿肌肉来源的祖细胞 5，来自其他物种（如人类）成年肌肉组织的细胞 6 或诱导性多能干细胞（iPS细胞） 7细胞收缩力导致细胞沿构建体的长轴方向排列 8,9 培养约一周后，肌肉前体细胞的分化情况。此外，施加电刺激可在一定程度上促进分化过程 8由于其尺寸较小（8 x 2 x 0.5 mm），可利用共聚焦显微镜对整个组织进行分析，以监测 例如 活力、分化和细胞排列。根据具体应用，工程化肌肉组织的要求会有所不同； 例如 用于再生医学时，需要扩大组织规模并实现血管化，而作为肉类替代品则需将其技术转化应用于其他物种。
方案
1. 小鼠成肌祖细胞或C2C12细胞的培养
- 根据 Shefer 及同事最初发表的方案分离细胞 10 随后由 Collins 改良 等 11 和 Boonen 等 12 并将其储存在液氮中。这需要小鼠， 例如 C57Bl/6。其他实验室采用不同的方法， 例如 李 Y 在《视觉化实验杂志》上发表的一种方法 等 13有关试剂和设备，请参见第7页和第8页的表格。从一只小鼠的肌肉组织中通常可获得足够细胞，用于在液氮中冻存约20管。接下来，我们开始从液氮储存中复苏细胞的实验步骤。
- 将1个小瓶中的细胞放入25 cm²培养瓶中2 Matrigel（1 mg/ml）包被的组织培养瓶中加入生长培养基（GM），生长培养基由以下成分组成：335 ml DMEM 高级培养基、100 ml 胎牛血清（FBS）、50 ml HS、5 ml 青霉素/链霉素、5 ml L-谷氨酰胺、5 ml 鸡胚提取物（CEE）。
注意：在室温下包被 2 小时，然后通过抽吸去除 Matrigel。
- 每3天将细胞以约1:3的比例进行传代培养。
具体操作如下：第3天，将一个25 cm2 培养瓶中的细胞传代至一个75 cm2 培养瓶中；第6天，将一个75 cm2 培养瓶中的细胞传代至两个150 cm2 培养瓶中（需在未包被的培养瓶中预贴壁30分钟）；第9天，将一个150 cm2 培养瓶中的细胞转移至一个三联150 cm2 培养瓶中，或若无此容器，则转移至三个150 cm2 培养瓶中（根据细胞表型需要，可再次进行预贴壁）；第12天，细胞即可用于接种至肌肉构建体中。
注意事项： - 每个150 cm2培养瓶的细胞数量约为4.5 × 106个细胞。
- 使用不同分离批次的冻存管混合细胞，以在接种时获得混合细胞群体。
注意：如果选择不使用原代细胞，C2C12 成肌细胞是一个良好的替代方案。
2. 工程化骨骼肌组织
- 通过将“弹性体”与“固化剂”按10:1的比例混合来制备硅胶。将魔术贴剪成带有一个三角形边的约±5 mm的方形片段（类似房屋形状；图1）。将魔术贴粘贴到6孔培养板的孔中，各方形之间间距约为12 mm。
注意事项： - 仅使用魔术贴的柔软面，并将此面朝上放置。
- 确保屋顶状结构彼此相对。
- 仅在魔术贴上涂抹硅胶，不要将胶水扩散至整个孔内。
- 后续进行电刺激时，需将构建物沿培养板孔的垂直方向（长轴方向）对齐排列。
- 置于未加热的真空烘箱中过夜干燥，主要目的是去除气泡。通过向孔中加入70%乙醇孵育15分钟进行灭菌。用PBS冲洗3次，然后置于紫外线下照射15分钟。移除孔内及魔术贴上的所有PBS，并将材料放入培养箱中备用。
- 在冰箱中解冻Matrigel溶液，并在制备3D结构前立即配制所需浓度的胶原蛋白溶液。用无菌的0.02%乙酸稀释胶原蛋白原液（终浓度为3.2 mg/ml）。
注意：所有物品均需置于冰上。
- 用胰酶消化细胞，重悬于生长培养基（GM）中并计数。将细胞置于离心管中，放入培养箱内孵育。
- 根据所需构建体的数量，向离心管中加入适量的胶原蛋白（Collagen）储备液（参见表1），然后逐滴加入0.5 M NaOH，直至溶液呈现淡粉色，表明pH值达到7.5。通过移液轻轻吹打混匀，避免产生气泡。随后加入Matrigel，并非常轻柔但充分地混匀。最后，将生长培养基（GM）加入胶原蛋白/Matrigel混合液中（具体体积参见表1）。
注意事项： - 每一步操作均需在冰上进行！Matrigel 和胶原蛋白在温度升高时会迅速凝胶化。
- 注意颜色确实为粉红色！pH 升高也会引起快速凝胶化。
- 胶原蛋白的终浓度：1.6 mg/ml。
- 以1,000 rpm离心所需数量的细胞5分钟，并移除上清液。
注意： - 根据细胞的活性，每个构建体所需的细胞数量需要进行调整。通常，每个构建体的细胞数量在 750,000 至 1,250,000 个之间。
- 取部分凝胶混合物重悬细胞沉淀，将细胞转移至剩余的混合物中，充分混匀，但避免引入气泡。
- 从培养箱中取出预热的多孔板，用移液器将 0.35–0.4 ml 细胞-凝胶混合物先加入 Velcro 区域。然后从附着位点之间的中心开始移液，逐步延伸至 Velcro 区域。最后，用剩余的凝胶填充两个 Velcro 锚定点之间的间隙，并在 Velcro 片段周围进行移液。
- 5–10 分钟后仔细检查凝胶是否已充分凝固以进行转移，i.e. 轻轻敲击培养皿，目视观察凝胶是否已变坚硬。若已凝固，小心将培养皿放入培养箱中。通常十分钟后即可移动。随后，1–2 小时后，轻轻在每块凝胶上覆盖 4 ml 温热的生长培养基（GM）。
注意： 处理培养皿时，切勿进行剧烈操作。
- 24小时后，用分化培养基（不含鸡胚提取物的生长培养基）替换GM，每2-3天更换一次新鲜培养基。到第7天时，应已形成成熟的定向肌纤维，可通过染色观察融合肌纤维中横纹结构的发育情况来评估。
3. 电刺激
- 使用前，用70%乙醇对Ionoptix板上的电极（参见试剂与设备表）进行灭菌，随后在生物安全柜中用紫外线照射干燥。将带电极的板放置在含有构建物的培养板上，并用培养板的盖子盖好，转移至培养箱中。使用适当的电缆连接Ionoptix C-pacer。
注意：电极应平行放置于肌肉构建物的两侧（图2）。
- 按照预期应用刺激方案。
注意：我们通常使用 4 V/CM、6ms 的脉冲，频率为 2Hz。在刺激期间每 24 小时更换一次培养基。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
最终产物将是如图3所示的肌肉构建物。组织的尺寸约为8 mm长、2 mm宽、0.5 mm厚。在分化过程中施加电刺激会改变肌球蛋白重链同工型的表达，但并不会显著增强由分化培养基所诱导的分化过程8；然而，可在培养过程结束时施加电刺激以检测肌肉的功能性，因为具有完全发育肌节的肌肉在受到电脉冲刺激时能够发生收缩。
还可通过定量 PCR 分析基因表达，以及通过染色检测肌肉成熟标志物或横纹发育情况，来评估分化与成熟过程（例如 对组织切片或整体染色的组织样本进行α-肌动蛋白（alpha actinin）染色。与肌肉成熟和分化相关的基因以及肌球蛋白重链的表达包括 例如 MyoD、myogenin、MFR4 和 MLP，以及 MYH 1、2、4 和 8 8已有研究通过基因表达分析、免疫组织化学染色以及电刺激诱导收缩等方法，证实所形成的组织确为肌肉组织，并已发表于先前文献中。 8 以及本文中由成肌细胞前体细胞和C2C12细胞制备的肌肉组织染色横切面图显示于 图4
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
肌肉组织的工程化在疾病模型构建、药物筛选、再生医学以及肉类生产方面具有巨大潜力。然而，这些应用的具体需求各不相同。我们选择使用胶原蛋白与Matrigel的组合，因为胶原蛋白有助于细胞排列，且前期二维研究已证实，成肌祖细胞需要基底膜来源蛋白的存在。 12此外，我们在实验室中测试了纤维蛋白凝胶，发现其对C2C12细胞和成肌祖细胞的支持作用不如胶原蛋白与Matrigel™混合物，尤其无法诱导组织收缩。 14该模型如本文所述，已用于基于细胞系的压力性溃疡损伤研究。 15在再生医学应用中，向人类卫星细胞的转化最近已实现 6,16此外，作为一种替代性的肉类消费来源，该技术具有巨大潜力 1然而，我们认为当前的技术需要进一步发展到下一阶段，以扩大其在临床应用和消费领域的使用。例如，目前的分化仅停留在新生儿阶段左右，且产生的力量远低于正常肌肉的收缩力 体内此外，尽管小鼠、大鼠和人类干细胞已可应用于三维结构中，但家畜来源的肌肉干细胞的分离，尤其是其分化与成熟，尚未发展到同等水平1此外，必须避免使用Matrig...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Yabin Wu培养了图2中所示的组织，图片由Bart van Overbeeke拍摄。本工作由SenterNovem提供资金支持，项目编号ISO 42022。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 基质胶-生长因子减少型 | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM（高糖）* | Gibco | 42430 | |
| 高级DMEM | Gibco | 12491 | |
| 马血清 | Gibco | 65050-122 | |
| 胎牛血清 | Greiner | 758075 | |
| 0.45 和 0.22 μm 注射器滤器* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030024 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 10378016 | |
| 两性霉素 | Gibco | 15290-018 | |
| 细胞培养塑料器皿 | Greiner | 包括培养瓶和移液管 | |
| 鸡胚提取物 | United States Biological | C3999 | |
| 巴斯德吸管* | Hilgenberg | 带缩颈、带棉塞、敞口尖端的巴斯德吸管，长度：230 mm，尖端直径：0.9 - 1.1 mm | |
| 巴斯德吸管* | Hilgenberg | 带缩颈、带棉塞、敞口尖端的巴斯德吸管，长度：230 mm，尖端直径：1.4 - 1.6 mm | |
| 巴斯德吸管 | VWR | 612-1702 | |
| I型胶原酶* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm 细胞筛 | BD Falcon | 352340 | |
| 19G 针头 | |||
| 弹性体 | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| 固化剂 | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| 魔术贴 | 普通商店 | 可在普通商店购买，仅使用柔软面 | |
| Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源 | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP 培养起搏器 | Ionoptix | ||
| 用于电刺激的6孔培养皿 | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish 培养皿电极 | Ionoptix | ||
| * 用于细胞分离（步骤1.1） # 包含在同一试剂盒中 |
参考文献
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle. Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).
- Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).
- Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells. Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).
- van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway. J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).
- Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).
- Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011(2010).
- Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering. J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).
- Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).
- Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC. , In revision (2013).
- Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
- Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
