斑马鱼内耳毛细胞的膜片钳记录

摘要

本视频的目的是演示从成年斑马鱼内耳器官中获取健康且完整的毛细胞的操作步骤，并进一步利用这些毛细胞进行膜片钳研究，以表征其电压门控离子通道的生物物理特性。

摘要

已有文献报道过对多种物种分离出的感觉毛细胞中电压门控通道进行的膜片钳分析^1-4，但本视频首次将这些技术应用于斑马鱼的毛细胞。本文演示了一种从内耳所有终器——包括球囊、椭圆囊、耳石器和半规管——中分离健康且完整毛细胞的方法。此外，我们展示了毛细胞在大小和形态上的多样性，并举例说明了可获得的膜片钳记录类型。与其他模型系统相比，斑马鱼模型系统的优势在于存在大量影响听觉和平衡功能的斑马鱼突变体。结合转基因品系以及基于遗传分析和操作的其他技术，本文所介绍的细胞分离与电生理学方法将有助于更深入地理解毛细胞在介导这些感觉功能中所起的作用。

方案

1. 实验前准备

1. 配制六种溶液（溶液成分见表1）：(a) 100 ml NZR（正常斑马鱼林格液），(b) 50 ml NZR + 三卡因（MS222），(c) 10 ml NZR + BSA；(d) 100 ml LoCaS（低Ca²⁺溶液），(e) 10 ml LoCaS + 木瓜蛋白酶，(f) 100 ml K⁺-细胞内液。溶液(a)、(b)、(d)和(f)可在4 °C下保存长达一个月。溶液(c)和(e)应在实验当天配制。所有溶液在开始实验前应恢复至室温。
2. 标记四个35 mm培养皿，并分别加入约半满的溶液(a)、(c)、(d)和(e)。
3. 通过在60 mm培养皿中填充Sylgard（Dow Corning, Midland, MI），然后在其上切割出一个可使鱼体直立而不倾倒的腔体，制备解剖用培养皿。
4. 制备至少两个细胞分离工具：将长毛犬（如拉布拉多寻回犬或魏玛猎犬）的毛囊端用瞬间胶水粘附于玻璃巴斯德吸管末端，使毛发伸出吸管末端约0.5 cm。

2. 听觉与前庭迷路的分离

1. 将一条成年斑马鱼浸入含有 NZR 和 Tricaine 的烧杯中以实施安乐死。目视观察鳃部，直至所有鳃盖运动完全停止。再等待十分钟，然后取出鱼体并用新鲜的 NZR 冲洗。这些操作程序已获得佩珀代因大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准，但您应取得所在机构的相应许可。
2. 将鱼腹面朝上固定在解剖皿中，用一根标准缝纫直针（长约 2.5 cm）穿过每侧眼眶，再用第三根针沿背腹轴方向插入头部至尾部距离的约三分之一至二分之一处，如图 1A所示。
3. 在配备 10 倍目镜、放大倍数为 0.62–5× 的立体解剖显微镜下，使用弹簧剪（Fine Science Tools 目录号 15000-02）从鳃水平后约 0.5 cm 处开始向前至鱼鼻部，移除颅骨顶部，以暴露脑组织及一小段脊髓。用精细镊子（Fine Science Tools 目录号 11251-30）剪断脊髓并夹起脑组织，同时剪断脊神经及其他连接组织；取出脑组织并弃去（图 1B）。
4. 残留的颅骨腹侧部分形成一个“碗状”结构，其中包含内耳器官。观察位于每侧内耳后端对称分布的听壶和球囊中明显、白色、不透明的耳石，以及更靠前外侧位置的椭圆囊耳石（图 1C 和 4A）。
5. 用精细镊子轻轻提起该骨性结构，同时剪断其所有腹侧和侧方连接组织，将其完整取出，并放入盛有 LoCaS 的培养皿中（图 1D 和 4B）。
6. 使用两对精细镊子，通过夹住骨性“碗状”结构的两侧边缘并向外拉开，或 alternatively 将镊子尖端插入中央部位并撬开左右两半，使其沿中线裂开。随后用精细镊子将两个迷路结构从骨组织中分离取出（图 2）。
7. 检查迷路结构，辨认听觉和前庭末梢器官：三个半规管、椭圆囊、球囊和听壶（图 4C）。每个耳石下方呈粉红色的区域为包含毛细胞的斑块。类似地，半规管壶腹部内的一条粉红色条带即为壶腹嵴，是毛细胞所在的位置。
8. 使用精细镊子小心地从听壶和椭圆囊中移除耳石（图 2 和 4C）。无需移除球囊中的耳石，以免损伤球囊毛细胞。

3. 毛细胞分离

1. 使用塑料移液管（Fisher Scientific 目录号 13-711-9AM），将终器转移至含有 LoCaS + 木瓜蛋白酶的培养皿中，尽量减少所转移的液体体积。
2. 在室温下将这些结构在此溶液中孵育三十分钟。
3. 孵育结束后，将结构转移至含有 NZR + BSA 的培养皿中，并在此溶液中继续孵育至少三十分钟。毛细胞在此溶液中可保持健康状态长达四小时，但在分离后1-2小时将开始退化（见后续步骤）。
4. 为准备细胞分离，将其中一个终器转移至含有 NZR 的培养皿中。
5. 对于球囊和椭圆囊，使用狗毛轻轻提起含有毛细胞的粉红色上皮组织——即斑块组织（图3A）。可使用狗毛从球囊耳石下方刮出斑块，或从半规管壶腹内的位置取出壶腹帽。
6. 使用步骤1.4中制备的两个细胞分离工具，对一个斑块或壶腹帽进行吹打，以产生含有毛细胞的碎片区域（图3B）。让细胞至少静置五分钟，使其沉降到培养皿底部后再移动。
7. 将培养皿转移至配备相差光学系统的倒置显微镜载物台上。在40倍放大倍数下观察细胞，并注意其形态多样性。许多细胞呈牛油果形，而另一些则细长。顶端存在纤毛束可确认其为毛细胞，而相差亮度则表明其健康状态。分离毛细胞的显微照片见图5。

4. 斑马鱼毛细胞的膜片钳记录

1. 为进行穿孔膜片钳记录^5,6，按如下方法配制含两性霉素的胞内液：取5 mg两性霉素B（Sigma A4888）放入1.5 ml微量离心管中，加入100 μl DMSO。立即涡旋振荡10-20秒，直至两性霉素完全溶解。然后，用移液器将625 μl K⁺-胞内液转移至另一微量离心管中。向该K⁺-胞内液中加入10 μl两性霉素溶液，并同上进行涡旋振荡。两性霉素储备液可保存数小时，但最终配制的溶液应在一小时后弃用。
2. 使用BF 150-86-10硼硅酸盐玻璃毛细管（Sutter Instruments）在多级拉制仪（Sutter P-1000）上拉制膜片钳电极。电极尖端直径应约为2 μm，在使用表1中溶液时电阻为1-3 MΩ。推荐的拉制参数如下：加热=斜坡减10，拉力=0，速度=18，延迟=1，气压=600。优质电极尖端的形状可参见图5插图c中的照片。优选钝头“子弹形”电极，因其在电生理记录中可提供最低的接入电阻。
3. 使用28号Microfil注射器针头（MF28G-5；World Precision Instruments）将记录电极填充至一半体积，所用溶液为含两性霉素的K⁺-胞内液。
4. 将电极固定于膜片钳放大器的前置放大头段。施加-10 mV、10 ms的电压阶跃，频率为10 Hz，并在电极穿过空气/溶液界面并下降至记录皿底部靠近细胞区域的过程中，持续向电极内保持正压。
5. 将电极垂直对准一个形态健康的细胞。当电极接近细胞至细胞开始因流出液流而发生位移时，迅速反转压力，对电极施加轻微负压，直至细胞“跃入”电极尖端。立即停止抽吸，并在电极内施加-70 mV的保持电位。数秒内即可形成吉欧姆级封接。
6. 在封接形成后不久，观察电压阶跃起始和终止时出现的容性电流瞬变。通过监测这些瞬变电流幅度逐渐增大至最大值（约十分钟内），持续观察两性霉素在电极下对细胞膜的穿孔过程。
7. 为确认在健康细胞中已成功建立全细胞（穿孔）记录构型，可通过施加超极化和去极化电压阶跃来诱发外向K⁺电流。大多数毛细胞均表现出明显的外向电流（见图6）。

5. 典型结果

图4展示了细胞分离过程中各步骤拍摄的图像。在图A中，可通过覆盖其上的薄层骨组织观察到与球囊、椭圆囊和耳石器官相关的耳石。这些不透明的结构为解剖过程中安全取出内耳感觉器官提供了便利的解剖标志。图B显示了容纳完整膜迷路以及椭圆囊、球囊和耳石器官中显著耳石的骨性“碗状”结构。图C显示了已从骨组织中取出的一个膜迷路。注意球囊中具有扇形边缘的大耳石、椭圆囊中呈冰柱状的耳石以及耳石器官中呈豆形的耳石。从球囊中分离出的细胞在大小和形态上的部分多样性如图5所示。健康的细胞在相差显微镜下表现为明亮且轮廓清晰。细胞形态大致可分为两类：鳄梨形（avo）和细长形（thn），尽管每类细胞的大小可能存在显著差异（例如比较avo 1与avo 3）。插图a显示了三个未完全分离的细胞聚集体。插图b中的细胞呈黑色且具有颗粒状外观，明显为死亡细胞。插图c显示了膜片钳电极尖端的形态与尺寸，适用于对这些细胞进行电生理记录。

在图6中所示的电流迹线，是在对类似图5中avo 2的耳石器细胞施加超极化和去极化电压阶跃后记录得到的。不同大小和形状的细胞中的电流反应可能存在显著差异，提示电压门控通道组成的多样性。

图1-3： 示意图展示毛细胞分离过程中的各个步骤。

图 1. 从斑马鱼中去除包含内耳迷路的颅骨囊。 A. 将已处死的斑马鱼腹面朝上固定于解剖皿中。 B. 打开颅骨，取出并弃去脑组织。 C. 观察椭圆囊、球囊和 lagena 中的耳石。 D. 去除包含迷路结构的颅骨囊腹侧部分。

图 2. 从颅骨囊中取出迷路。A. 沿中线将颅骨囊裂开。B. 从骨组织中取出迷路。C. 使用镊子从球囊和椭圆囊中取出耳石。

图 3. 从前庭迷路中分离毛细胞。A. 用狗毛轻轻剥离椭圆囊斑。 B. 用两根狗毛吹打 triturate 椭圆囊斑。 C. 使用分离的毛细胞进行膜片钳实验。

图 4. 细胞分离过程中各步骤拍摄的图像。A. 去除脑组织后，可观察到与两个球囊（sacculi）和瓶状囊（lagenas）相关的耳石（箭头所示）以及椭圆囊（utricles，箭头所示）。B. 去除包含内耳器官的颅骨腹侧部分后的样本。图B右侧的示意图标示了左侧椭圆囊、瓶状囊和球囊的位置。虚线表示左侧迷路的大致位置。C. 右侧迷路（内侧视图）D. 示意图，说明图C中迷路的关键结构。a：前半规管，b：水平半规管，c：后半规管，d：椭圆囊耳石，e：球囊耳石，f：瓶状囊耳石。图D中的比例尺在A和B中代表1 mm，在C和D中代表0.5 mm。

图 5. 从球囊中分离出的健康细胞，展示了形态的多样性；avo：鳄梨形细胞；thn：细长形细胞。插图 a：三个未完全分离的细胞簇；插图 b：死亡细胞；插图 c：用于斑片钳记录斑马鱼毛细胞时所用记录电极的尖端。比例尺 = 20 μm，适用于主图及所有插图。

图 6. 在膜片钳毛细胞中记录到的电流。对一个细胞（类似于图 5中的 avo 2）施加从 -140 mV 到 +70 mV、以 10 mV 为增量的电压阶跃，共呈现三次，其平均反应如图所示，保持电位为 -70 mV。注意在更去极化的电位下出现的失活电流。部分迹线旁标注了电压阶跃的幅度。

讨论

精细解剖感受器器官并轻柔处理细胞，对于成功分离出健康、完整且具有生理活性的毛细胞至关重要。遵循以下建议可确保实验成功：

1. 从小个体鱼（体长2-2.5 cm）中获取健康细胞更为容易。较大的鱼体内含有更多的脂滴，会在解剖过程中阻碍观察。
2. 取出覆盖在毛细胞上方的耳石时需格外小心。使用镊子夹取耳石时应避免触碰细胞。
3. 当将斑块和壶腹帽以片状整体剥离，并将细胞从上皮组织中吹打下来时，效果最佳。
4. 我们发现使用狗毛吹打细胞的效果优于其他方法，包括使用人类睫毛⁷，因为后者尖端不够细且柔韧性较差。
5. 在进行膜片钳记录时，电极穿过气/液界面时施加正压对于保持电极尖端清洁至关重要。随后释放正压使细胞“跳入”电极同样关键。该方法可将电极尖端附近含两性霉素的小体积溶液清除，从而提高与细胞形成吉欧姆封接的可能性。在我们的实验中，由于细胞较为脆弱，采用穿孔膜片钳记录技术而非更传统的全细胞记录构型。尝试进入全细胞模式常会导致吉欧姆封接的丧失。

本文所述方法可从每只动物中获得数百个健康的毛细胞。该技术可在室温下操作，仅需体视显微镜，无需其他特殊设备。JoVE 之前发表的一篇报告描述了采用腹侧入路法解剖斑马鱼内耳的方法⁸。这些作者展示了对经多聚甲醛固定的完整内耳器官进行解剖的过程。我们建议读者观看该视频，以便与我们的方法进行比较。本文所介绍方法的一个优势在于能够获得可用于生理学研究的活细胞。除了可用于膜片钳实验以研究电压门控通道（如本文所示）外，这些细胞还可用于研究细胞共振^9,10、通过电容测量监测神经递质释放^11,12、探究配体门控通道激活所诱导的神经调制作用¹³，以及利用影响听觉和平衡功能的突变体来获取丰富的研究信息¹⁴。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(a) NZR（正常斑马鱼林格液）（单位：mM）	116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2，3 葡萄糖，5 Na+-HEPES，pH 7.35。
（b）NZR + 三卡因	NZR + 0.02% 3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（Sigma A5040）。
(c) NZR + BSA	NZR + 0.4% 牛血清白蛋白（Sigma A2153）。
（d）LoCaS（低钙）2+ 溶液）（单位：mM）	100 NaCl, 2 KCl, 0.05 CaCl2，0.05 MgCl2，3 葡萄糖，30 Na+-HEPES，pH 7.35。
(e) LoCaS + 木瓜蛋白酶	LoCaS + 0.05% L-半胱氨酸 (Sigma C1276) + 0.2% 木瓜蛋白酶 (Sigma P3375)
(f) K+-内液（单位：mM）	52 K2SO4，38 KCl，1 K+-EGTA，5 K+-HEPES，pH 7.3。
<强>表1. 溶液