本文介绍一种定量小鼠诺如病毒（MNV）感染性颗粒的方法，MNV 是唯一能在细胞培养中高效复制的诺如病毒。空斑试验利用 MNV 对小鼠巨噬细胞的嗜性，可适用于含有 MNV 的生物或环境样本。
本文内容
摘要
摘要
小鼠诺如病毒（MNV）是Norovirus属中唯一能在组织培养中高效生长的成员1, 2。在感染小鼠树突状细胞或巨噬细胞时，可观察到MNV-1引起的细胞裂解和细胞病变效应（CPE）1。利用MNV-1的这一特性，可通过空斑实验来定量测定样品中感染性病毒颗粒的数量1。空斑实验依赖于MNV-1裂解细胞并在融合细胞单层上形成空洞（称为空斑）的能力3。
可采用多种技术检测组织培养物、收获的组织、临床样本及环境样本中的病毒感染，但并非所有方法都能测定具有感染性的病毒颗粒数量（例如 qRT-PCR）。一种定量感染性病毒颗粒的方法是进行噬斑实验3，下文将对此进行详细描述。MNV噬斑实验的一种变体是荧光灶点实验，该方法通过免疫染色在细胞单层中检测MNV抗原4。由于病毒抗原的表达早于噬斑形成，该实验可能更为快速，且适用于无法形成噬斑的病毒滴定。然而，荧光灶点实验相较于噬斑实验需要额外资源，例如抗体和显微镜以计数灶点形成单位。感染性MNV也可通过测定50%组织培养感染剂量（TCID50）来定量3。该实验通过终点稀释法测定在50%接种的组织培养细胞中引起细胞病变效应（CPE）所需的病毒量5。然而，其检测下限高于噬斑实验4。
本文介绍了一种噬斑测定法实验方案，可用于有效测定生物或环境样本中存在的具有感染性的鼠诺如病毒（MNV）颗粒数量1, 4, 6。该方法基于对含有MNV的样本进行10倍系列稀释，随后接种至允许性细胞单层（RAW 264.7 小鼠巨噬细胞）。让病毒在一定时间内吸附于细胞单层，然后吸除未吸附的病毒，再用琼脂糖与细胞培养基的混合物覆盖细胞。琼脂可促进子代病毒在邻近细胞间扩散，同时限制其向远处细胞传播。因此，受感染的细胞发生裂解，在细胞单层上形成称为噬斑的空斑。当病毒充分扩散后，通过中性红、亚甲蓝或结晶紫等染料对细胞染色，噬斑即可被观察到。在较低稀释度下，每个噬斑来源于一个具有感染性的病毒颗粒及其在邻近细胞中产生的子代病毒。因此，通过计数噬斑数量，可计算出原始未稀释样本中的噬斑形成单位（PFU）数量3。
方案
1. RAW 264.7 巨噬细胞系的培养
- 在DMEM-10培养基中培养RAW 264.7细胞（ATCC，目录号 # TIB-71），该培养基由高糖DMEM组成，含10%（v/v）低内毒素胎牛血清（< 10 EU/ml）、10 mM HEPES、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、1 mM非必需氨基酸和2 mM L-谷氨酰胺。细胞通常培养于175 cm2的组织培养瓶中，每瓶加入35 ml培养基，并置于组织培养孵箱中，于37 °C、5% CO2条件下孵育。然而，也可使用任意规格的培养瓶，只需根据培养瓶的表面积加入相应体积的培养基即可。
- 传代细胞时：吸除旧培养基，向细胞中加入10 ml新鲜DMEM-10培养基，然后使用细胞刮刀将细胞从培养瓶底部刮下。接着，用10 ml移液器反复吸取细胞悬液，并用力将细胞通过紧贴培养瓶底部的移液器枪头挤出，使细胞重悬为均一的单细胞悬液。此操作至少重复3次，直至细胞不再聚集。通过光学显微镜检查确认已形成单细胞悬液。随后，将1 ml（1:10稀释，约1×107个细胞）至2 ml（1:5稀释，约2×107个细胞）的细胞悬液转移至新的175 cm2培养瓶中，并补加培养基至终体积为35 ml。
- 当细胞接近完全汇合时进行传代（约每175 cm2培养瓶含1×108个细胞）：若起始稀释比例为1:10，则每三天传代一次；若起始稀释比例为1:5，则每两天传代一次。传代前应使用光学显微镜检查细胞形态。大多数细胞应呈圆形且未激活状态。激活的细胞可见颗粒状结构和/或具有突起的细长纺锤形形态。切勿让细胞过度生长，因过度生长的细胞通常无法形成克隆集落。记录细胞传代次数，并定期通过复苏较低传代次数的冻存细胞重新开始培养（我们以第30代作为上限）。
2. 用MNV接种物感染RAW 264.7细胞
- 将 RAW 264.7 细胞接种于 6 孔板（直径 3.5 cm），密度为 1×10⁶ 个细胞/孔6 每毫升 DMEM-10 培养基中的活细胞数，并向每孔加入 2 ml 该细胞悬液。为确保细胞在孔内均匀分布，需手动轻轻摇动培养板至少 10 次，或使用摇床装置振荡约 10 分钟。切勿旋转培养板，以免细胞聚集于孔中央。将培养板放入组织培养孵箱中（置于 37 °C 和 5% CO2）。让细胞贴壁过夜或至少 4 小时 37 °C细胞应达到60%–80%汇合度，并均匀分布于孔中，用于空斑实验。
- 次日，准备病毒接种物，可来源于组织培养中感染了MNV的细胞，或来源于感染MNV小鼠的匀浆组织或粪便样本。使用组织样本时，取豌豆大小的组织块，置于含有无菌二氧化硅珠的2 ml螺旋盖管中，加入1 ml DMEM-10，利用组织匀浆器进行匀浆处理例如 MagnaLyser；Roche)。对于粪便样本，每1 ml培养基中所加入的粪便颗粒不得超过3粒。所有样本随后均于-80 °C）并在进行蚀斑测定前仅解冻一次。
- 用完全DMEM-5培养基制备病毒接种物的10倍系列稀释液，该培养基由DMEM/高糖、5%（v/v）低内毒素胎牛血清（< 10 EU/ml）、10 mM HEPES、100 U/ml 青霉素 100 μg/ml 链霉素，1 mM 非必需氨基酸，2 mM L-谷氨酰胺。
- 在24孔板中进行10倍系列稀释：使用重复移液器将1.35 ml培养基加入多个孔中，然后进行10倍梯度稀释-1 通过将1.35 ml培养基与0.15 ml含病毒样品混合，然后取0.15 ml该10倍稀释液进行后续操作-1 将稀释液加入 1.35 ml 培养基中以制备 10-2 稀释等操作。每次进行新的稀释时，必须更换吸头。可使用多通道移液器同时对多个样本进行稀释，两个吸头可插入24孔板的一个孔中，每孔转移总体积为0.15 ml（参见 图3A).
- 组织匀浆和粪便内容物的典型稀释范围为10-1 至 10-3然而，这些样本产生的噬斑通常比组织培养样本中的更小。此外，在某些情况下，需要将粪便样本稀释至1:100，以充分稀释粪便中可能破坏细胞单层、从而影响噬斑计数的毒性成分。组织培养裂解液的稀释范围则取决于病毒生命周期中所关注的时间点。稀释倍数可高达10-9 感染高峰期可能需要。
- 在完成系列稀释后，标记含有RAW 264.7单层细胞（来自步骤2.1）的6孔板，注明样品名称及接种的稀释度。每次处理一块板，通过轻弹或抽吸方式完全移除培养基。随后立即向一个孔中加入0.5 ml稀释后的样品，并在同一板上重复操作于另一个复孔，再进行下一个稀释度的操作。当某一板上所有3个稀释度均加样完毕后，手动轻轻前后倾斜板子，确保所有细胞均被覆盖。每次仅处理一块板，以防止细胞干燥。
- 向每孔加入0.5 ml稀释液后，将板子直立叠放，于室温孵育1小时。由于加入每孔的液体体积不足以完全覆盖单层细胞，需每隔10-15分钟手动轻轻前后倾斜板子，或将其置于摇床上（约每分钟18次振荡），以防止细胞干燥。
3. 低熔点琼脂糖（SeaPlaque）覆盖物的制备
注意：建议提前准备多瓶已灭菌的SeaPlaque琼脂糖。使用前可在微波炉中重新熔化。
- 在1小时孵育结束前，计算所有培养板所需的覆盖液体积。所需体积为每孔2 ml，或每6孔板12 ml。分别准备琼脂糖（见第3.2节）和培养基（见第3.3节）。
- 制备琼脂糖：将3 g SeaPlaque琼脂糖悬浮于100 ml蒸馏水（3% w/v）中，置于玻璃瓶内，高压灭菌20–30分钟。（若琼脂糖已预先制备，可在微波炉中重新熔化。）使用前必须将SeaPlaque琼脂糖在水浴中平衡至42 °C，因为温度过高会杀死细胞。确保水浴液面等于或高于琼脂糖液面，以防止意外凝固。
- 制备培养基：配制100 ml的2倍浓缩MEM培养基（2x MEM），其中包含10%（v/v）低内毒素胎牛血清（< 10 EU/ml）、10 mM HEPES、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、4 mM L-谷氨酰胺。将培养基在水浴中平衡至37 °C。
- 在覆盖感染的细胞单层前，立即以1:1比例在无菌瓶中混合SeaPlaque琼脂糖与2x MEM培养基。若所需覆盖液总量超过200 ml，应分装至多个瓶子中，并置于37 °C水浴中保存，直至使用。
- 1小时孵育结束后（见第2.7节），吸除各孔中的接种液。将移液枪头紧贴孔壁，缓慢沿孔边缘加入2 ml覆盖液。可同时操作最多5块板，而不会导致细胞干燥。
- 在室温下静置约10分钟，待覆盖液凝固后，将培养板正放于组织培养孵箱中。在37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。
- 孵育结束后，蚀斑肉眼隐约可见，因此应先检查未染色的培养板是否存在蚀斑。若未观察到蚀斑，可继续孵育4小时后再次检查。但总孵育时间不得超过72小时。
4. 通过中性红染色观察斑块
- 为观察斑块，将3 ml中性红溶液（0.33% w/v，溶于DPBS；Sigma，货号 # N2889）加入97 ml 1×PBS（组织培养级，不含Mg2+-，Ca2+-游离；Gibco，货号 # 10010）。计算实验所需的中性红染色液用量：每块6孔板需要12 ml中性红染色液，即每孔加入2 ml。尽管某些蚀斑实验方案要求从孔中移除琼脂糖凝胶块，但在本方案中，中性红染色液直接加在覆盖层之上。
- 孵育1小时后 37 °C检查中性红染色液仍在孔中时是否可见噬斑。如果噬斑不明显，继续染色1小时。持续孵育直至噬斑可见。（注意：染色时间超过3小时并不理想；若在染色3小时后阳性对照样本中仍不可见噬斑，则表明噬斑实验未成功。）染色完成后，吸除中性红染色液，注意勿扰动琼脂糖凝胶块，随后进行噬斑计数。
- 将培养皿倒置在透光板上，对已计数的噬菌斑标记圆点，以避免重复计数。选择噬菌斑清晰分离的孔所对应的稀释度进行计数。即 无肉眼可见的噬斑融合现象。如果可能，应在两个稀释度下计数噬斑。需要注意的是，噬斑大小可能因MNV毒株、病毒接种量以及进行噬斑实验时RAW 264.7细胞的状态不同而有所差异。
- 如果孔中未观察到噬斑，则可能是因为样本中不存在病毒，或者病毒量低于噬斑检测法的检测限。在这种情况下，孔会染成红色，颜色与其他含有噬斑的孔相似。此外，在某一稀释度中病毒颗粒过多时，也会出现无噬斑的现象。这会导致整个单层细胞裂解，孔呈现橙色或黄色。
- 计算病毒滴度。将单个稀释度下两孔中的噬斑数量相加，再乘以稀释倍数（即 1 毫升（若2个孔各感染0.5毫升，则合并为1毫升）。由此可得出接种物体积为1毫升时的空斑形成单位（PFU）数量。例如，在 图4 在第10个-2 稀释度为10⁻⁶时，一个孔（标记为“II”）有14个噬斑，另一个孔（标记为“V”）有17个噬斑。因此，病毒滴度为14×10⁶ PFU/mL。2 + 17×102 = 3,100（3.1×10）3) pfu/ml
5. 典型结果
可使用空斑实验对具有感染性的 MNV-1 颗粒进行定量，该实验的示意图见图 1。图 2A 显示了感染前含有 RAW 264.7 细胞单层的孔，而图 2B 显示了同一孔中由罗马数字 I、II 和 III 标示的三个可见空斑。该实验的各个步骤如图 3A 至 F 所示。图 3A 显示了对含病毒样品进行 10 倍系列稀释的制备过程。图 3B 显示将稀释后的样品转移至 6 孔板中的两个重复孔中。图 3C 显示使用摇床装置在室温下将 RAW 264.7 细胞与接种物共同孵育 1 小时。图 3D 显示向细胞中加入 SeaPlaque:MEM 混合物覆盖。图 3E 显示将培养板置于室温下使覆盖层凝固，而图 3F 显示在 48 小时后使用 0.01% 中性红溶液对细胞进行染色。染色 1–3 小时后吸除中性红染色液，即可观察并计数空斑（图 4）。
图 1. MNV斑块分析实验方案示意图。
图 2. 单层细胞感染前及空斑形成后的代表性图像。A) RAW 264.7 细胞培养过夜后，在20倍光学显微镜下成像。B) 感染48小时后，用0.01%中性红溶液染色，并在4倍光学显微镜下观察。罗马数字 I、II 和 III 标示三个可见的空斑。
图 3. 不同噬斑实验步骤的代表性图像。A) 将 MNV-1 接种物进行 10 倍系列稀释。B) 将接种物以复孔方式加入细胞单层。C) 在室温下轻轻摇动孵育 1 小时，使细胞与接种物充分接触。D) 用 SeaPlaque 琼脂糖与 2x MEM 培养基按 1:1 比例混合的覆盖液覆盖细胞。E) 在室温下孵育 10 分钟，使覆盖层凝固。F) 感染后 48 小时，用中性红染色液对细胞进行染色。
图4. MNV-1在细胞单层上形成蚀斑。图中显示的是感染后48小时的代表性蚀斑实验结果，经中性红染色液孵育1小时后可见染色的蚀斑。该板显示了三个10倍稀释度的重复孔。标有罗马数字I和IV的孔对应10⁻¹稀释度；II和V对应10⁻²稀释度；III和VI对应10⁻³稀释度。样品的病毒滴度在下方标出（计算方法详见第4.5节）。
讨论
本文介绍的MNV-1噬斑检测方法是一种用于定量感染性MNV颗粒的方法。通过遵循图3所示的检测步骤，可以获得可重复的病毒滴度。该检测方法的检测下限取决于起始稀释度。当如上所述从样品1:10稀释开始时，噬斑检测的检测下限为10 pfu（即在10-1稀释度下可见1个噬斑）。由于每个噬斑代表一个单一病毒颗粒，因此也可通过挑取分离的噬斑并如前所述进行扩增，利用噬斑检测法纯化MNV的克隆群体1。此外，噬斑纯化还可用于从混合病毒群体中分离出单一病毒群体。使用噬斑检测法检测MNV感染的一个局限性在于，并非所有MNV毒株都能形成噬斑4。然而，对于从动物中分离获得的某些不能形成噬斑的MNV毒株，可能通过在组织培养中连续传代来克服这一限制7。噬斑检测法的另一种替代方法是通过TCID50技术测定感染性病毒颗粒3, 4。该方法通过终点稀释法测定在50%接种的组织培养细胞中引起细胞病变效应（CPE）所需的病毒量，完成MNV检测需1周时间4。与噬斑检测法相比，TCID50检测不仅耗时更长，而且灵敏度较低（检测下限 = 200 TCID50/ml），这主要是由于组织样本对RAW 264.7细胞具有毒性4。
尽管在实验方案中已对关键步骤进行了详细说明，但以下部分提供了简要总结，以方便排查问题。实验方案中最关键的步骤是确保RAW 264.7细胞在整个检测过程中保持活性，以支持病毒的复制。可通过光学显微镜在检测的各个阶段监测细胞状态。细胞活性的维持可通过以下两种方式实现：第一，在操作培养板时需注意避免细胞干燥，因此应逐个接种培养板，感染期间轻摇培养板，并在不进行操作时始终保持培养板封闭；第二，加至细胞上的溶液应预先平衡至约37 °C。此外，为维持RAW 264.7细胞的整体健康状态，应将其培养在含有低内毒素血清的培养基中< 10 EU/ml），以限制细胞的活化。此外，我们观察到使用传代30代或更高代次的细胞时，蚀斑实验的失败率更高。尽管这一情况可能因实验室而异，但仍建议设置阳性对照（例如， 使用已知病毒滴度的样品）以确保滴度的可重复性，尤其是在使用高代次 RAW 264.7 细胞时。为减少高代次细胞的使用，建议在收到 RAW 264.7 细胞后立即将早期代次的细胞冻存备用，并定期从冻存管中重新启动培养。当细胞出现特征改变（如贴壁能力下降、细胞形态变化等）时，重新使用低代次细胞培养将尤为有益。例如 从圆形变为细长或扩散状），或检测到支原体污染时。另一个需要注意的重要事项是确保在不同样本之间以及稀释过程中更换移液器吸头。这将确保连续稀释的准确性，并防止样本间的交叉污染。在本实验方案中，唯一可以重复使用同一移液器吸头的步骤是在向孔板中添加同一样本的连续稀释液时。在此情况下，应从最稀释的接种液开始，逐步移向浓度较高的样本，并在吸取每一步新稀释液时充分吹打混匀。
空斑实验方案可进行多种改进。当细胞数量不足以进行复孔接种时，可采用的一种改进方法是每个稀释度仅接种一个孔。但由于接种体积为0.5 ml，此时需将空斑数量乘以2的校正系数，以标准化为pfu/ml。该空斑实验也可适用于任何其他能够支持MNV复制的贴壁细胞系，已有文献报道其在小鼠小胶质细胞BV-2细胞系中的应用8。其他可实施的改进方法包括借鉴为其他病毒建立的空斑实验方案中所描述的技术。针对MNV，以下改进已成功应用：使用甲基纤维素替代Sea Plaque琼脂糖9，以及使用结晶紫或亚甲蓝染色细胞，替代中性红染色10, 11。
总体而言，该方案可根据需要轻松调整，用于定量其他形成噬斑的病毒，或用于在 RAW 264.7 细胞中引起裂解性感染的其他病毒，因此是一种通用的、用于定量感染性病毒颗粒的有效工具。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢Wobus实验室成员提出的宝贵意见和建议。CEW实验室的研究工作得到了密歇根大学启动资金、美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所生物防御与新发传染病研究区域卓越中心（RCE）计划“五大湖”地区第五区RCE项目（NIH资助号1-U54-AI-057153）的职业发展资助以及NIH R01 AI080611项目的资助。M.B.G.-H. 的研究经费来自密歇根大学获得的实验免疫学（NIH T32 A1007413-16）和微生物致病分子机制（NIH T32 A1007528）培训项目。J.B.C. 的研究经费由巴西巴西利亚的高等教育人员提升协调办公室（Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES）提供。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM/高糖 | Hyclone | SH30243.02 | |
| 2x MEM | Gibco | 11935 | |
| 100x 青霉素和链霉素 | Hyclone | SV30010 | |
| 10 mM 非必需氨基酸 | Hyclone | SH30238.01 | |
| 1M HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| 200 mM (100x) L-谷氨酰胺 | Hyclone | SH30034.01 | |
| 胎牛血清 | Gibco, Hyclone | 10437, SH30070.02 | |
| Sea Plaque 琼脂糖 | Lonza | 50100 | |
| 中性红 0.33% | Sigma | N2889 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010 | |
| 1.0 mm 氧化锆/二氧化硅珠 | BioSpec Products | 11079110z | |
| Model 35 速度摇床 | Labnet | S2035 | |
| Magna Lyser 仪器 | Roche | 03358968001 | |
| Raw 264.7 细胞系 | ATCC | TIB-71 | |
| 组织培养孵育箱 | Sanyo | MCO-18AIC |
参考文献
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